抗凍蛋白及從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法

2023-08-10 06:36:01

抗凍蛋白及從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗凍蛋白及從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，而提供一種操作簡單，易於產業化大規模生產的抗凍蛋白及其提取方法。所述抗凍蛋白的分子量為43.14KDa，經差示掃描量熱儀測定的熱滯活性為0.08℃，採用下述方法製備：以谷朊粉為原料，經鹼性溶液浸提後離心、透析除鹽、冷凍乾燥得到抗凍蛋白粗品；所述鹼性溶液的濃度為0.01-0.09mol/L、pH值為8-11。本發明的以小麥澱粉生產的副產物谷朊粉為原料，谷朊粉來源廣發、廉價易得、蛋白質含量豐富，能夠降低抗凍蛋白的成本。製備過程中未添加任何有毒有害的物質，同時，谷朊粉本身就是一種可食用性的植物性原材料，所得抗凍蛋白為天然產品，因此可以以添加劑的形式應用於食品行業。
【專利說明】抗凍蛋白及從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及食品工程【技術領域】，特別是涉及一種抗凍蛋白及從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]低溫脅迫是一種嚴重的自然災害，它對大多數生物體都是致死性的，它導致細胞內環境脫水、結晶，造成細胞物理性的損害或死亡，每年因低溫脅迫造成的損失高達數千億美兀。
[0003]另一方面，目前的冰淇淋等速凍食品在凝結、冷凍、運輸、儲存及銷售的過程中，冷量消耗的越多，產品的冰晶體才能保證越小，即使冷量供應很大，但是溫度的上下波動照樣會造成冰晶體的長大以致口感粗糙。如果有種物質能將水分子的流動性從開始就控制住，並且隨溫度的波動，水分子的運動難以進行則不但保證了產品的質量，而且能降低耗冷量，減少用電，降低能耗，節約成本，符合低碳經濟的發展。
[0004]抗凍蛋白(ant1-freezing proteins, AFP)是一類具有特殊功能的蛋白質,其存在於各種生命體中。它通過與冰晶結合來降低冰晶生長的溫度和改變冰晶形成的大小和形態，從而起到重結晶抑制效應；而且它能以非依數性形式降低水溶液的冰點而對其熔點影響甚微，於是導致水溶液的熔點(melting point, MP)和冰點(freezing point, FP)之間出現一定的熱滯活性(thermal hysteresis activity, THA)而產生熱滯效應,從而幫助各種生物體抵禦寒冷的環境。
[0005]抗凍蛋白以其獨特的功能在低溫冷鏈的眾多食品加工和運輸過程中、在醫學器官移植等各個領域都發揮著重要作用。
[0006]已有植物性抗凍蛋白的提取主要集中在高山高寒地區的高山雪蓮、黑麥草、內蒙古沙冬青等植物性原材料，但這些原材料不易得到，並且其提取方法以「冰手指法」為主，不適合大規模的生產。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，而提供一種操作簡單，易於產業化大規模生產的抗凍蛋白及其提取方法。
[0008]為實現本發明的目的所採用的技術方案是:
[0009]一種抗凍蛋白，所述抗凍蛋白的分子量為43.14KDa，經差示掃描量熱儀測定的熱滯活性為0.08°C，採用下述方法製備:以谷朊粉為原料，經鹼性溶液浸提後離心、透析除鹽、冷凍乾燥得到抗凍蛋白粗品；所述鹼性溶液的濃度為0.01-0.09mol/L、pH值為8_11。
[0010]一種從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，包括下述步驟:以谷朊粉為原料，以鹼性溶液作為浸提液浸提，再經離心、透析和冷凍乾燥得到抗凍蛋白粗品；所述鹼性溶液的濃度為0.01-0.09mol/L、pH值為8-11。
[0011]所述鹼性溶液為NaOH溶液。[0012]浸提的溫度為10_55°C。
[0013]浸提的提取時間為l_4h。
[0014]所得抗凍蛋白粗品經分離純化得到高純度的抗凍蛋白；所述抗凍蛋白粗品分離純化的手段為凝膠層析。
[0015]抗凍蛋白粗品分離純化的具體工藝為:浸提的抗凍蛋白粗品利用S印Hadex G-100凝膠色譜進行分離，一次上樣量為100-300 μ L，洗脫液為含0.1-0.2mol/L的NaCl、濃度為5-15mmol/L、pH值為8-9的Tris-HcL緩衝液，流速為0.1-0.3ml/min，在檢測波長為280nm的條件下收集洗脫峰，即可得到高純度的抗凍蛋白。 [0016]所述離心的條件為:4_10°C下以6000-10000r/min的速率離心10_30min。
[0017]谷朊粉的質量濃度為3-10%。
[0018]上述的抗凍蛋白在農業、醫學、生物技術和食品領域的抗凍方面的應用。
[0019]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0020]1、本發明的抗凍蛋白以小麥澱粉生產的副產物谷朊粉為原料，與其它植物性抗凍蛋白提取的原材料相比，谷朊粉來源廣發、廉價易得、蛋白質含量豐富，能夠降低抗凍蛋白的成本。
[0021]2、本發明的抗凍蛋白的製備過程中未添加任何有毒有害的物質，同時，谷朊粉本身就是一種可食用性的植物性原材料，所得抗凍蛋白為天然產品，因此可以以添加劑的形式大規模的應用於食品行業。
[0022]3、本發明通過鹼液粗提、凝膠層析純化、透析除鹽、冷凍乾燥等方法從谷朊粉中將抗凍蛋白提取出來，操作過程簡單，易於實現大規模生產。而且，顯著的提高了谷朊粉的利用價值，為小麥谷朊粉的深加工提供了新的途徑。
[0023]4、本發明的抗凍蛋白的提取方法通過合理確定鹼性溶液的濃度為0.01-0.09mol/L、pH值為8-11時，使得抗凍蛋白能夠最大程度的保留其原有活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1所示為本發明實施例1中的抗凍蛋白粗品經SepHadex G-100凝膠色譜分離的圖譜；
[0025]圖2所示為本發明實施例1中經純化的抗凍蛋白各組分的SDS-PAGE電泳圖譜；
[0026]圖3所示為本發明實施例1中純化的抗凍蛋白P2組分的熔點掃描圖譜；
[0027]圖4所示為本發明實施例1中純化的抗凍蛋白P2組分當保留溫度為-0.83°C時的冰點掃描圖譜。
【具體實施方式】
[0028]以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0029]實施例1
[0030](I)抗凍蛋白粗品的提取製備
[0031]稱取IOg谷朊粉溶解於150ml的0.09mol/L、pH值為11的NaOH溶液中，在水浴鍋中保持提取溫度55?的條件下恆溫攪拌2h,然後在TSOOr/mirufC的條件下離心15min,取上清液，在7Ku的透析袋內透析過夜，冷凍乾燥24h，得抗凍蛋白粗品1.837g，抗凍蛋白粗品的得率為18.37%。
[0032]( 2 )抗凍蛋白粗品的純化
[0033]將提取分離的抗凍蛋白粗品復溶於10mmol/L、pH值為8.5的Tris-Hcl緩衝液中配製成20mg/ml的粗蛋白溶液,採用SepHadex G-100凝膠色譜進行層析分離,凝膠色譜分離圖譜如圖1所示，層析所採用的層析柱規格為Φ 1.0cmX IOcm,用10mmol/L、pH值為8.5的Tris-Hcl緩衝液進行預平衡，上樣200 μ L，洗脫液為10mmol/L、pH=8.5的Tris-Hcl緩衝液(含0.15mol/L的NaCl )，流速為0.3ml/min,檢測波長為280nm，收集洗脫峰P1I2,進行冷凍乾燥得到P1組分和P2組分。 [0034](3)抗凍活性的鑑定
[0035]將P1組分和P2組分分別配製成10mg/ml的蛋白溶液，取10 μ I置於鋁製液體坩堝中，按照設定的溫控程序進行熱滯活性的測定:
[0036]a、以5°C /min的速率由室溫降至_30°C，保持5min ；
[0037]b、以1°C /min的速率由_30°C升至20°C，記錄樣品熔點Tm ；
[0038]C、以 1°C /min 的速率由 20°C 降至 _30°C，保持 5min ；
[0039]d、以1°C /min的速率由_30°C升至固液混合態(保留溫度Th)，保留2min ；
[0040]e、以TC /min的速率由Th降至_30°C,記錄樣品體系開始結晶的溫度Ttl ;計算熱滯活性 THA=Th-Ttl。
[0041]按照上述設定的溫控程序進行P2組分的熱滯活性的測定，P2組分的熔點掃描圖譜如圖3所示，測得P2組分的熔點Tm=-0.19°C,當確定其保留溫度Th=-0.83 0C時，P2組分的冰點掃描圖譜如圖4所示，冰點Ttl=-0.91°C，經計算得:抗凍蛋白P2組分熱滯活性THA=Th-T0=0.08°C，因此，P2組分即為高純度的抗凍蛋白。
[0042]採用同樣方法進行P1組分的熱滯活性的測定，經計算P1組分的熱滯活性為0°C，因此，P1組分不具有抗凍活性。
[0043]所得高純度的抗凍蛋白(即P2組分)為0.865g，經微量凱式定氮法測定氮和總蛋白的含量為0.746g，高純度的抗凍蛋白得率為8.65%，其相對純度為86.24%。
[0044](4) SDS-PAGE電泳測定純化的抗凍蛋白分子量
[0045]將所得高純度的抗凍蛋白(即P2組分)配製成lmg/ml的溶液，經SDS-PAGE電泳測定，SDS-PAGE電泳圖譜如圖2所示，其分子量為43.16KDa。
[0046]實施例2
[0047](I)抗凍蛋白粗品的提取製備
[0048]稱取5g谷朊粉溶解於100ml的0.07mol/L、pH值為8.2的Tris-Hcl緩衝液中，在水浴鍋中保持提取溫度30°C的條件下恆溫攪拌2.5h，然後在8000r/min、4°C的條件下離心20min,取上清液，在7Ku的透析袋內透析過夜，冷凍乾燥24h，得抗凍蛋白粗品0.972g，抗凍蛋白粗品的得率為9.72%。
[0049]( 2 )抗凍蛋白粗品的純化
[0050]將提取分離的抗凍蛋白粗品復溶於10mmol/L、pH=8.0的Tris-Hcl緩衝液中配製成20mg/ml的粗蛋白溶液,採用SepHadex G-100凝膠色譜進行層析分離,凝膠色譜分離圖譜與圖1基本相同，層析所採用的層析柱規格為Φ 1.0cmX IOcm,用10mmol/L、pH=8.0的Tris-Hcl緩衝液進行預平衡，上樣150 μ L，洗脫液為10mmol/L、pH=8.0的Tris-Hcl緩衝液(含0.lmol/L的NaCl )，流速為0.2ml/min，檢測波長為280nm，收集洗脫峰P1和P2。將洗脫峰P2冷凍乾燥得到純化的抗凍蛋白P2組分為0.326g，經微量凱式定氮法測定氮和總蛋白的含量為0.378g，高純度的抗凍蛋白的得率為3.26%，其相對純度為86.32%。
[0051](3) SDS-PAGE電泳測定純化的抗凍蛋白分子量
[0052]將所述高純度的抗凍蛋白P2組分配製成lmg/ml的溶液，經SDS-PAGE電泳測定，SDS-PAGE電泳圖譜與圖2基本相同，其分子量為43.2IKDa0
[0053](4)經純化的抗凍蛋白組分進行抗凍活性的鑑定
[0054]將經純化的谷朊粉抗凍蛋白組分P2配製成10mg/ml的蛋白質溶液，取10 μ I置於鋁製液體坩堝中，按照設定的溫控程序進行熱滯活性的測定，熔點掃描圖譜與圖3基本相同，測得P2組分的熔點Tm=-0.19°C，當確定其保留溫度Th=-0.51°C時，冰點掃描圖譜與圖4相似，冰點Ttl=-0.59°C，經計算得:抗凍蛋白P2組分熱滯活性THA=Th-Ttl=0.08°C, P2組分即為抗凍蛋白。
[0055]實施例3
[0056](I)抗凍蛋白粗品的提取製備
[0057]稱取15g谷朊粉溶解於150ml的0.01mol/L、pH值為8.9的PBS緩衝液中，在水浴鍋中保持提取溫度25°C的條件下恆溫攪拌4h，然後在8500r/min、4°C的條件下離心lOmin，取上清液，在7Ku的透析袋內透析過夜，冷凍乾燥24h，得抗凍蛋白粗品0.863g，抗凍蛋白粗品的得率為8.63%。
[0058]( 2 )抗凍蛋白粗品的純化
[0059]將提取分離的抗凍蛋白粗品復溶於10mmol/L、pH=8.2的Tris-Hcl緩衝液中配製成20mg/ml的粗蛋白溶液,採用SepHadex G`-100凝膠色譜進行層析分離,凝膠色譜分離圖譜與圖1基本相同，層析所採用的層析柱規格為Φ 1.0cmX IOcm,用10mmol/L、pH=8.2的Tris-Hcl緩衝液進行預平衡，上樣180 μ L，洗脫液為10mmol/L、pH=8.2的Tris-Hcl緩衝液(含0.lmol/L的NaCl )，流速為0.25ml/min，檢測波長為280nm,收集洗脫峰P1和P20將洗脫峰P2冷凍乾燥得到純化的抗凍蛋白P2組分為0.313g，經微量凱式定氮法測定氮和總蛋白的含量為0.365g，高純度的抗凍蛋白的得率為3.13%，其相對純度為85.87%。
[0060](3) SDS-PAGE電泳測定純化的抗凍蛋白分子量
[0061 ] 將所述高純度的谷朊粉抗凍蛋白P2組分配製成lmg/ml的溶液，經SDS-PAGE電泳測定，SDS-PAGE電泳圖譜與圖2基本相同，其分子量為43.18KDa。
[0062](4)經純化的抗凍蛋白組分進行抗凍活性的鑑定
[0063]將經純化的抗凍蛋白組分P2配製成10mg/ml的蛋白質溶液，取10 μ I置於鋁製液體坩堝中，按照設定的溫控程序進行熱滯活性的測定，熔點掃描圖譜與圖3基本相同，測得P2組分的熔點Tm=-0.19°C，當確定其保留溫度Th=-0.21°C時，冰點掃描圖譜與圖4相似，冰點Ttl=-0.290C，經計算得:抗凍蛋白P2組分熱滯活性THA=Th-Ttl=0.08°C，P2組分即為抗凍蛋白。
[0064]本發明採用單一廉價的鹼性溶液浸提以及易於擴大製備規模的凝膠層析技術分離純化抗凍蛋白，整個工藝操作過程簡單有效，所得產品純度較高，所得谷朊粉抗凍蛋白產品可作為添加劑應用於冰淇淋等速凍冷飲行業以及農業、醫學、生物技術等領域，從而實現谷朊粉的高效利用，為植物性抗凍蛋白的提取提供新的途徑。[0065]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫 離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種抗凍蛋白，其特徵在於，所述抗凍蛋白的分子量為43.14KDa，經差示掃描量熱儀測定的熱滯活性為0.08°C，採用下述方法製備:以谷朊粉為原料，經鹼性溶液浸提後離心、透析除鹽、冷凍乾燥得到抗凍蛋白粗品；所述鹼性溶液的濃度為0.01-0.09mol/L、pH值為 8-11。
2.一種從谷朊粉中提取權利要求1所述的抗凍蛋白的方法，其特徵在於，包括下述步驟:以谷朊粉為原料，以鹼性溶液作為浸提液浸提，再經離心、透析和冷凍乾燥得到抗凍蛋白粗品；所述鹼性溶液的濃度為0.01-0.09mol/L、pH值為8_11。
3.根據權利要求2所述的從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，所述鹼性溶液為NaOH溶液。
4.根據權利要求2或3所述的從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，浸提的溫度為 10-55°C。
5.根據權利要求4所述的從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，浸提的提取時間為l_4h。
6.根據權利要求2或3所述的從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，所得抗凍蛋白粗品經分離純化得到高純度的抗凍蛋白；所述抗凍蛋白粗品分離純化的手段為凝膠層析。
7.根據權利要求6所述的從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，抗凍蛋白粗品分離純化的具體工藝為:浸提的抗凍蛋白粗品利用SepHadex G-100凝膠色譜進行分離，一次上樣量為100-300 μ L，洗脫液為含0.1-0.2mol/L的NaCl、濃度為5-15mmol/L、pH值為8-9的Tris-HcL緩衝液，流速為0.1-0.3ml/min,在檢測波長為280nm的條件下收集洗脫峰，即可得到高純度的抗凍蛋白。
8.根據權利要求4所述的從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，所述離心的條件為:4-10°C下以 6000-10000r/min 的速率離心 10_30min。
9.根據權利要求4所述的從谷朊粉中提取抗凍蛋白的方法，其特徵在於，谷朊粉的質量濃度為3-10%。
10.權利要求1所述的抗凍蛋白在農業、醫學、生物技術和食品領域的抗凍方面的應用。
【文檔編號】C07K1/14GK103613650SQ201310589169
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】劉愛國, 趙源, 吳子健 申請人:天津商業大學