一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法

2023-07-30 12:51:36

專利名稱：一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法
技術領域：
本發明屬於啤酒質量評價技術領域，更詳細地說，涉及用於檢測功能啤酒中牛磺 酸的高效液相色譜法。
背景技術：
牛磺酸(Taurine)是一種廣泛存在於人和動物體內的含硫？胺基酸，早在1827年 就被從牛的膽汁中發現並分離出來，並因此而得名。牛磺酸作為人體內一種條件性必需氨 基酸有著廣泛的生物學活性，是調節機體正常生理功能的重要物質。研究表明，牛磺酸因其 對運動機體內的自由基代謝、Ca2+轉運等具有良好的調節作用，從而表現出良好的抗運動疲 勞效果。目前，市場上已推出了多種添加牛磺酸的功能飲品，如含有牛磺酸的運動啤酒、運 動飲料等為對這些功能啤酒進行嚴格的質量控制，需要建立準確的啤酒中牛磺酸測定方 法。目前定量檢測食品中牛磺酸含量常用的方法有酸鹼滴定法、胺基酸自動分析法、薄層色 譜法和高效液相色譜法等，而專門針對啤酒檢測的多為螢光光度法，其它方法沒有應用到 啤酒檢測，由於各種方法和樣品的差異性，在樣品前處理、分析步驟以及所使用的試劑等方 面都有所不同。螢光光度法採用強酸性陽離子樹脂分離出啤酒中的牛磺酸，與鄰苯二 甲醛(OPA)/2巰基乙醇衍生化後進行螢光法測定。由於牛磺酸是磺化胺基酸 (NH2-CH2-CH2-SO3H)，含有磺酸根(SO3H)，與樹脂結合最不緊密，當經過陽離子樹脂柱的時候 首先被洗脫下來，可能存在樣品中與樹脂結合較弱的其它胺基酸共流出，從而導致測定值 偏高。此外，陽離子樹脂處理操作較為繁瑣，不利於常規檢測。而且由於啤酒中存在幾十種 不同種類的游離胺基酸，易對牛磺酸的檢測產生幹擾，僅靠單一的螢光光度法很難將牛磺 酸從其它胺基酸中完全分離，從而影響其準確定量。

發明內容
本發明的目的是建立一種能對功能啤酒中牛磺酸進行準確定性和定量的高效液 相色譜法，用於該類型啤酒的質量控制。本發明採用高效液相色譜法(英文簡稱HPLC)，利 用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基甲酸酯(英文縮寫AQC)柱前衍生，二極體陣列或 紫外檢測器和螢光檢測器串聯檢測，通過調節緩衝液濃度、PH以及溶劑梯度淋洗，實現啤酒 中牛磺酸與其它胺基酸的完全分離，從而對其進行準確定性和定量。本發明所述的一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，包括下述步 驟(一)衍生前處理程序6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基甲酸酯(AQC)柱前衍生；本發明還包括下述步驟( 二)梯度洗脫程序流動相A為139. 92mmol/L三水乙酸鈉+16. 39mmol/L三乙 胺的緩衝液，用50%磷酸調節pH至4. 98，流動相B為純水，流動相C為乙腈，分別針對標樣 和啤酒樣品優化梯度洗脫程序，使得牛磺酸與啤酒中其它幹擾物質完全分離；
(三)色譜分析和數據處理程序樣品分析所使用的色譜柱為美國Waters公司的AccQ-Tag胺基酸分析C18柱， 3. 9mm*50mm，4um，將待測啤酒和牛磺酸標樣譜圖對比，以保留時間定性，色譜峰峰面積定
量，計算公式如下
權利要求
1.一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，其特徵是包括下述步驟 (一)衍生前處理程序6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基甲酸酯柱前衍生。
2.如權利要求1所述的一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，其特徵 是還包括(二)梯度洗脫程序流動相A為139. 92mmol/L三水乙酸鈉+16. 39mmol/L三乙 胺的緩衝液，用50%磷酸調節pH至4. 98，流動相B為純水，流動相C為乙腈，分別針對標樣 和啤酒樣品優化梯度洗脫程序，使得牛磺酸與啤酒中其它幹擾物質完全分離；(三)色譜分析和數據處理程序樣品分析所使用的色譜柱為美國Waters公司的AccQ-Tag胺基酸分析C18柱， 3. 9mm*50mm，4um,將待測啤酒和牛磺酸標樣譜圖對比，以保留時間定性，色譜峰峰面積定量。
3.如權利要求2所述的一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，其特 徵是所述的步驟(二)梯度洗脫程序為(1) (To. 5分鐘內，流動相為100%緩衝液A，進行 等度洗脫；(2)0. 5分鐘時，流動相瞬間切換為99%緩衝液A+1%乙腈；(3)0. 5 27. 0分鐘， 流動相由99%緩衝液A+1%乙腈線性變換為95%緩衝液A+5%乙腈，逐漸增大有機相(乙 腈)比例以減小流動相極性；(4) 27. (Γ33. 0分鐘，遵循曲線8所代表的為非線性換相方式， 流動相由95%緩衝液A+5%乙腈逐漸變換為91 %緩衝液A+9%乙腈，進一步減小流動相 極性，使在色譜柱上保留較強的組分洗脫下來；(5)33. (Γ33. 5分鐘，流動相由91%緩衝液 A+9%乙腈線性變換為60%純水+40%乙腈，開始衝洗色譜柱；(6) 33. 5^34. 0分鐘，流動相 從60 %純水A+40 %乙腈變為40 %純水+60 %乙腈，進一步加大有機相比例以增強衝洗強 度；(7) 34. 0 37· 0分鐘，以40%純水+60%乙腈衝洗色譜柱3分鐘；(8) 37. 1分鐘，流動相變 換為100%緩衝液A，開始平衡色譜柱；(9)37.廣45. 0分鐘，以100%緩衝液A平衡色譜柱至 初始狀態，為分析下一個樣品做好準備。
4.如權利要求2或3所述的一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，其 特徵是步驟(二)前包括二極體陣列或紫外和螢光雙檢測器串聯檢測程序，即將二極體陣 列或紫外檢測器和螢光檢測器串聯在色譜柱後，樣品中的牛磺酸衍生產物與其它幹擾物質 在色譜柱上實現分離，並依次通過二極體陣列或紫外檢測器和螢光檢測器，分別利用待測 物質的紫外和螢光特性進行檢測，從而實現牛磺酸的雙重定性和定量。
5.如權利要求2或3所述的一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，其 特徵是步驟(三)計算公式如下式中C樣——待測啤酒中牛磺酸的含量，mg/L ； Cfe標樣中牛磺酸的含量，mg/L;A#------待測啤酒中牛磺酸的峰面積；A標------標樣中牛磺酸的峰面積；f——待測啤酒的稀釋因子。
6.如權利要求2或3所述的一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，其 特徵是步驟(三)後包括驗證程序，方法評價指標包括加標回收率、重現性和最小檢出限等達到啤酒樣品的分析要求。
全文摘要
一種採用高效液相色譜檢測功能啤酒中牛磺酸的方法，包括下述步驟(一)衍生前處理程序6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基甲酸酯柱前衍生；(二)梯度洗脫程序流動相A為139.92mmol/L三水乙酸鈉+16.39mmol/L三乙胺的緩衝液，用50％磷酸調節pH至4.98，分別針對標樣和啤酒樣品優化梯度洗脫程序，使得牛磺酸與啤酒中其它幹擾物質完全分離，樣品分析所使用的色譜柱為美國Waters公司的AccQ-Tag胺基酸分析C18柱，3.9mm*50mm，4um；(三)數據處理程序將待測啤酒和牛磺酸標樣譜圖對比，以保留時間定性，色譜峰峰面積定量。本發明實現了啤酒中牛磺酸與其它胺基酸的完全分離，從而對其進行準確定性和定量。方法操作簡單，準確可靠，具有較高的靈敏度。
文檔編號G01N30/02GK102147397SQ201010301398
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者單連菊, 李梅, 楊朝霞, 楊梅, 董建軍, 郝俊光 申請人:青島啤酒股份有限公司