一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的製備方法

2023-07-12 10:38:41 2

專利名稱：一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用複合酶定向酶解茄參膠原蛋白製取能夠抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的方法背景技術原發性高血壓是由多種因素引起的，其中包括遺傳、飲食習慣、精神狀態等。研究表明血壓正常與否，與腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統密切相關，而血管緊張素酶(ACE)在上述兩個系統中都起著重要作用。在腎素-血管緊張素系統中，ACE水解無升壓活性的血管緊張素I，生成具有升壓活性的血管緊張素II；而在激肽釋放酶-激肽系統中，ACE能夠降解具有降壓活性的緩激肽，使之失去降血壓活性。ACE通過以上兩種途徑參與了體內血壓調節，能造成血壓的升高，引發高血壓。ACE抑制劑通過抑制血漿和血管內皮細胞ACE的活性達到降低血壓的目的。ACE抑制劑的研究始於20世紀60年代，Ferreira等人在南美洲蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中發現ACE抑制劑，之後人們對於ACE抑制劑的機理、提取及合成進行了廣泛研究，1981年第一個合成ACE抑制劑Captopril(商品名為卡普託利)經FDA批准上市。目前合成ACE抑制劑是臨床上廣泛應用的一種降血壓藥物，但由於它具有乾咳、血管性水腫等副作用，人們試圖尋找更為安全的ACE抑制劑。1979年Oshima等人用細菌膠原酶降解明膠獲得具有較強ACE抑制活性肽，這是人類第一次利用食品蛋白質得到的食源性ACE抑制活性肽，之後人們先後從日本清酒、沙丁魚、蛋黃、酸奶、鰹魚等食品原料中獲得食源性ACE抑制活性肽。食源性ACE抑制活性肽安全性高，降壓效果溫和、專一、持久，且無副作用，但它的缺點是成本高，對ACE的抑制作用差。
目前，尚未見到用茄參膠原蛋白製備ACE抑制活性肽的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種用複合酶定向酶解茄參膠原蛋白製取能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的方法，它能克服現有技術的上述缺陷。
一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的製備方法，其特徵是將茄參體壁用蒸餾水打漿，離心，殘渣用鹼溶液攪拌過夜，離心，重複用鹼洗，除去上清液，沉澱用蒸餾水衝洗至中性，加入蒸餾水恆溫加熱並攪拌抽提，離心分離得熱水提膠原溶液，冷凍乾燥，得到茄參膠原蛋白，將該茄參膠原蛋白溶解於磷酸-檸檬酸緩衝液中配成溶液，加入菠蘿蛋白酶，恆溫攪拌，水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；用鹼液調pH7-8，再加入Alcalase蛋白酶，恆溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；加I型膠原酶，恆溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾，得水解液，經過陽離子交換柱、凝膠柱、兩次反相高壓液相色譜半製備柱分離純化後凍幹。
本發明以低值的茄參為原料，利用菠蘿蛋白酶、Alcalase蛋白酶、I型膠原酶複合酶解製備具有ACE抑制活性的寡聚肽，所得產物活性高，對ACE酶有較好的抑制作用。
具體實施例方式
將1kg茄參體壁加入2.5kg的蒸餾水打漿，離心，所得殘渣用8kg的NaOH水溶液攪拌過夜，離心，重複用NaOH的水溶液洗三次，除去上清液，沉澱用蒸餾水衝洗至中性，加入蒸餾水45℃下恆溫加熱並攪拌抽提8h，離心分離得膠原水溶液，冷凍乾燥。將所得茄參膠原蛋白溶解於磷酸-檸檬酸緩衝液(該緩衝溶液的摩爾濃度為0.02M，pH4.5)中配成0.5～1.5％(重量百分比濃度，下同)，最好是1％的溶液，按照4000～5000U/g，最好4500U/g膠原蛋白加菠蘿蛋白酶，恆溫攪拌，40～50℃下，最好45℃下水解3～5小時，最好4小時，95～100℃下滅酶，冷卻，用10KDa超濾膜超濾；用鹼液調pH7～8，最好7.5，按照2500～3500U/g，最好3000U/g膠原蛋白加入Alcalase蛋白酶，50～60℃下，最好55℃恆溫水解1.5～2.5小時，最好2小時，95℃下滅酶，冷卻，用5KDa超濾膜超濾；使pH值不變，按照3500～4500U/g，最好4000U/g膠原蛋白加入I型膠原酶，36～38℃下，最好37℃下恆溫水解3～4小時，最好4小時，95℃滅酶，冷卻，用1KDa超濾膜超濾，所得水解液經過SP Sephadex C-25陽離子交換柱、Sephadex G-15凝膠柱，兩次反相高壓液相色譜C18半製備柱分離純化，凍幹即得到具有ACE抑制活性的寡聚肽。
採用分光光度計法測定，分子量在1K以下的本發明的寡聚肽對ACE有較好的抑制效果，其IC50值為23.8ug/ml。
權利要求
1.一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的製備方法，其特徵是將茄參體壁用蒸餾水打漿，離心，殘渣用鹼溶液攪拌過夜，離心，重複用鹼洗，除去上清液，沉澱用蒸餾水衝洗至中性，加入蒸餾水恆溫加熱並攪拌抽提，離心分離得熱水提膠原溶液，冷凍乾燥，得到茄參膠原蛋白，將該茄參膠原蛋白溶解於磷酸-檸檬酸緩衝液中配成溶液，加入菠蘿蛋白酶，恆溫攪拌，水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；用鹼液調pH7-8，再加入Alcalase蛋白酶，恆溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；加I型膠原酶，恆溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾，得水解液，經過陽離子交換柱、凝膠柱、兩次反相高壓液相色譜半製備柱分離純化後凍幹。
全文摘要
一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的製備方法，其特徵是將茄參體壁用水打漿，離心，殘渣用鹼攪拌，離心，用鹼液洗，除去上清液，沉澱用水衝洗至中性，加水恆溫，加熱並攪拌抽提，離心分離得熱水提膠原溶液，冷凍乾燥，得到茄參膠原蛋白，將後者溶於磷酸－檸檬酸緩衝液中，加入菠蘿蛋白酶，恆溫攪拌，水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；調pH7－8，再加入Alcalase蛋白酶，恆溫水解，滅酶，冷卻，超濾；加I型膠原酶，恆溫水解，滅酶，冷卻，超濾，得水解液，經交換柱、凝膠柱、兩次反相高壓液相色譜半製備柱分離純化後凍幹。本發明以低值的茄參為原料製得的寡聚肽活性高，對ACE酶有較好的抑制作用。
文檔編號A61K36/185GK1858230SQ20061004448
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月3日 優先權日2006年3月3日
發明者曾名湧, 趙元暉, 劉尊英, 董士遠, 李八方 申請人:中國海洋大學