從乳汁中提取免疫球蛋白a的方法

2023-08-08 11:53:06 2

專利名稱：從乳汁中提取免疫球蛋白a的方法
技術領域：
本發明涉及一種採用現代生物工程技術、從乳汁中提取純化免疫球蛋白A的方法。
免疫球蛋白A主要以單體形式、雙體形式存在於動物體內。血液中的免疫球蛋白A主要以單體形式存在，這種免疫球蛋白，由於沒有雙體免疫球蛋白A分子中所具有的、能夠抵抗消化道內分泌的蛋白酶的分解破壞作用的、叫做分泌片的糖蛋白結構，因此不能作為口服製劑達到免疫防護作用。乳汁中的免疫球蛋白主要是雙體免疫蛋白A，這是由兩個單體免疫球蛋白A通過一個叫做分泌片的分子量約6萬的糖蛋白連接在一起的。分泌糖蛋白具有抵抗消化道中分泌出的各種蛋白消化酶對免疫球蛋白A的分解破壞作用，使免疫球蛋白A免遭破壞，保護其應有的免疫活性。如果血液中的免疫球蛋白A製成注射用免疫球蛋白，給免疫球蛋白A缺乏的人注射會使其產生抗免疫球蛋白A抗體，多次注射還會引起過敏反應和休克反應。口服從血液中提取的免疫球蛋白製劑，則因血液中的免疫球蛋白A不具有抵抗消化道中蛋白分解酶的破壞作用，無法起到免疫保護作用。因此，只有乳汁等動物分泌的乳汁中的雙體免疫球蛋白A才能真正自然地充分發揮應有的免疫保護作用。
新生兒童早期易患呼吸道及消化道感染。這與新生兒機體發育不全、合成免疫球蛋白的功能不全或不完善有關。兒童體內合成免疫球蛋白A的能力隨著年齡的增長而增長，12歲左右才基本達到成年人水平，而老年人隨著年齡的增長，機體新陳代謝的能力逐漸降低，體內合成免疫物質的能力也逐漸下降，對細菌感染和病毒侵襲的抵抗能力也逐年下降，這時給予足量的外源性免疫球蛋白A的補充，可以在消化道和呼吸道形成天然保護屏障，預防多種感染性疾病的發生。腫瘤病人在放化療治療期間及以後相當長的一段時間都極易罹患感染性疾病，一個重要的原因便是治療藥物或射線在殺傷腫瘤細胞的同時，也損傷了機體內正常的代謝功能活躍的組織細胞，這其中也包括合成分泌免疫球蛋白的組織細胞，使消化道和呼吸道中免疫球蛋白A的合成、分泌受損減少，甚至功能喪失。目前，尚沒有其它很好的辦法阻止機體遭受細菌和病毒的侵襲。高濃度的雙體免疫球蛋白A可以幹擾和限制致病菌在消化道及呼吸道上皮細胞表面的聚集，以及中和病毒的毒性，從而有效地提高正在進行放化療腫瘤病人的存活率，但是，目前尚沒有這種既能夠保持雙體免疫球蛋白A活性又能夠方便需要者服用的高濃度雙體免疫球蛋白A的製劑。
本發明的目的是提供一種從乳汁中批量分離純化雙體免疫球蛋白A，並將其加工成可以口服的固體劑型的方法。
本發明的目的是這樣實現的一種從乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特徵是用新鮮採集的乳汁(人乳、牛乳、羊乳等動物乳汁)，加入0.8-1.2倍(重量)的0.01N-0.5N(N-當量)氯化鈉溶液，混合均勻，在0-15℃條件下離心1-3小時，離心轉速(重量)控制在2000-15000rpm，離心結束，棄去上層油脂和底部沉渣，取中部清液加0.01M-1M的酸性溶液(如鹽酸、硫酸、磷酸或有機酸)，調節PH值使其成酸性。PH值調節範圍應控制在2-5之間，可形成大量不溶性雜蛋白顆粒。用過濾、離心或過濾加離心的方法將不溶性顆粒除掉。清液加鹼性溶液(如氫氧化鈉、碳酸鈉或有機鹼性化合物)，調節PH值在7-8之間。隨後，採用凝膠柱層折法、半透膜法、超濾法等方法進一步純化。如採用凝膠柱層折法，可以採用DEAE柱作為分離柱。洗脫液為三份Tris-HCl(0.01M，PH8.0)，NaCl的濃度分別為0.03±0.01M、0.05±0.01M及0.1±0.01M。注意NaCl濃度不同，收集到的成份也不同，如0.03MNaCl洗脫液洗脫的主要為免疫球蛋白G，0.05MNaCl洗脫液洗脫的主要為免疫球蛋白A的分泌片，雙體免疫球蛋白A則集中在0.1MNaCl洗脫液中，因此，首先用0.03M的NaCl洗脫液洗脫並去除洗脫液，然後用0.05MNaCl洗脫液洗脫並去除洗脫液，最後用0.1M的NaCl洗脫液洗脫並收集洗脫液。經280nm紫外分光光度計測定確認後，繼續濃縮。這時可用超濾法、半透明法脫水濃縮，即為雙體免疫球蛋白A的濃縮液，濃縮液的蛋白濃度一般控制在10-50％(重量)之間，為防止濃縮液在從貯放到乾燥的過程中發生蛋白變質，可考慮加入一種即可以防腐但在終產品中又不留跡量的防腐劑，如乙醇等有機低沸點、無毒物質，若選用乙醇，用量應控制在10-50％(重量)之間。雙體免疫球蛋白A濃縮液的乾燥方法是免疫球蛋白A濃縮液預冷至0-4℃，備用。乾燥方法可選擇真空乾燥法、低溫冷凍乾燥法、低溫冷凍真空乾燥法或其它合適的方法。本發明採用低溫冷凍真空乾燥法，所採用的冷凍真空乾燥設備適合於大批量生產免疫球蛋白A固體製劑。具體方法如下。首先開啟製冷系統，使冷凍真空乾燥箱的溫度降到-15-35℃之間，一般可選在-30℃。當冷凍真空乾燥箱的溫度達到後，冷凍乾燥箱處於待用狀態，這時，將預冷的免疫球蛋白A濃縮液傾倒在冷凍乾燥盤中。注意液體的厚度應控制在0.5-2.5cm之間，一般可選在1.5cm的液體厚度，將裝有液體的冷凍乾燥盤置於冷凍乾燥箱中的擱板上，關閉冷凍真空乾燥箱的箱門，開啟製冷系統，使冷凍乾燥箱內的溫度降至-20--45℃，並保持在此溫度範圍內2-6小時。待溶液凍結後，開啟真空系統，使冷凍乾燥箱內的壓力在短時間內達到低於0.04KPa。待壓力穩定後，開啟擱板加熱系統，在最初階段，擱板溫度的上升控制在5℃/2小時以內，並以此速度逐漸升溫，當溫度升至-10-20℃之間時，停止加熱一段時間，時間約為2-12個小時，一般可控制在6小時左右，待製品中約90％的水份去除後，則重新開啟擱板加熱系統，以2-5℃/小時的速度升溫。當溫度升至-5-10℃時，注意觀察製品的外觀形狀是否保持正常，如水份過高，則重新快速降溫至-35℃左右，保持在此溫度水平4小時左右，再緩慢升溫，保持5℃/小時左右的速度升溫，最終控制擱板的溫度在20-40℃之間，一般可控制在30℃左右，並在此溫度範圍保持4-6小時，此時製品的溫度與擱板的溫度一致，兩條記錄曲線匯合，整個過程約需時20-30小時。製品最終的殘留水份對以後的製品保管、加工、製造有十分重要的影響，因此，在制品乾燥結束後，收集製品的工作應在能控制相對溼度的房間裡進行，一般收集室的相對溼度應控制在30-50度之間。收集到的固體免疫球蛋白粉末應密封在容器中貯存。
本發明與現有技術相比，其顯著優點是首次用人工的方法從乳汁中提取免疫球蛋白A，為人類利用免疫球蛋白A提供了一種既可行，又豐富的方法。
下面結合實施例對本發明作進一步詳述實施例，新鮮採集的牛乳，加等量0.15NraCl溶液，混合均勻，在4℃條件下離心1小時，離心轉速為10000rpm，離心結束，棄去上層油脂和底部沉渣。取中部清液加0.5M HCl溶液，調節PH到4.6±0.2，離心去除產生的不溶性蛋白顆粒。清液加0.5M NaOH溶液，調PH至7.6±0.2。用DEAE柱純化，洗脫液為梯度NaClTris-HCl液(0.01M，PH8.0)，內含NaCl分別為0.03M、0.05M及0.1M。收集0.1M NaCl洗脫液，經280mm紫外分光光度計確認及測定含量後，用排阻分子量1000的濾膜脫水濃縮。濃縮到蛋白含量在20％左右。加入適量乙醇，使濃度控制在10％。置4℃冷室備用。開啟低溫冷凍真空乾燥機的製冷系統，使冷凍真空乾燥箱的溫度降到-30℃，並保持在此溫度。將預冷到4℃的濃縮液傾倒在冷凍乾燥盤中，厚度為1.2-1.5cm，將裝有液體的冷凍乾燥盤置於冷凍乾燥箱中的擱板上，關閉冷凍真空乾燥箱箱門，開啟製冷系統，使冷凍乾燥箱內的溫度降至-30℃，並保持在此溫度4小時，待溶液凍結後，開啟真空系統，使冷凍乾燥箱內的壓力在短時間內達到0.01kPa，待壓力穩定後，開啟擱板加熱系統。在最初階段，擱板溫度的上升控制在5℃/2小時以內，當溫度升至-20℃時，停止加熱，並保持4-6小時，待製品中約90％的水份去除後，重新開啟擱板加熱系統，以5℃/小時的速度升溫，當溫度升至-5℃時，觀察製品的外觀形狀，如無異常，繼續升溫，控制擱板的最終溫度在30-35℃，並在此溫度範圍保持4-6小時，此時製品的溫度與擱板的溫度一致，兩條記錄曲線匯合。整個乾燥過程約需時20小時。在能控制相對溼度在50℃以下的房間裡收集製品密封貯存。
權利要求
1.一種從乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特徵是該方法包括下列步驟1．1用新鮮採集的乳汁加入0.8-1.2倍(重量)的0.01-0.5N氯化鈉溶液，混合均勻，在0-15℃條件下離心1-3小時；1．2棄去上層油脂和底部沉渣，取中部清液，加0.01-1.0M的酸性溶液，使其PH值在2-5之間，形成不溶性雜蛋白顆粒，用過濾、離心或過濾加離心的方法去除不溶性顆粒；1．3加鹼性溶液，使PH值在7-8之間；1．4用凝膠柱層折法，半透膜法或超濾法進行純化；1．5用真空乾燥法對濃縮液進行乾燥即可。
2.根據權利要求1所述的從乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特徵是所述的凝膠柱層折法進行純化濃縮的方法步驟是2．1選用DEAE柱，三份Tris-HCl(0.01M，PH8.0)洗脫液，三份洗脫液的NaCl的濃度分別是0.03±0.01M、0.05±0.01M、0.1±0.01M；2．2首先用0.03±0.01M的Tris-Hcl洗脫液進行洗脫並去除洗脫液，然後用0.05±0.01M的Tris-Hcl洗脫液進行洗脫並去除洗脫液，再用0.1±0.01M的Tris-Hcl洗脫液進行洗脫，收集此次洗脫液；2．3用超濾法、半透膜法進行脫水濃縮，使蛋白濃度在10-50％(重量)之間；2．4加入10-50％(重量)的乙醇防腐。
3.根據權利要求1所述的從乳汁中提取免疫球蛋白A的方法，其特徵在於所述的用低溫冷凍真空乾燥進行乾燥的方法步驟是3．1將免疫球蛋白A濃縮液預冷至0-4℃備用；3．2開啟製冷系統，使冷凍真空乾燥箱的溫度降到-15-35℃；3．3將預冷的免疫球蛋白濃縮液傾倒在冷凍乾燥盤中，液體厚度為0.5-2.5cm，將乾燥盤置於冷凍乾燥箱的擱板上，開啟製冷系統，使冷凍乾燥箱中的溫度降至-20--45℃，並保持2-6小時；3．4開啟擱板加熱系統，擱板溫度以5℃/2小時的速度上升，當溫度升至-10--20℃時停止加熱2-12小時；3．5重新開啟擱板加熱系統，以2-5℃/小時的速度升溫至-5-10℃，然後以5℃/小時速度升溫至20-40℃，並在此溫度內保持4-6小時；3．6將收集到的固體免疫球蛋白粉末密封在容器中貯存。
全文摘要
本發明公開了一種從乳汁中提取免疫球蛋白A的方法,具體方法步驟是用新鮮乳汁加入適量氯化鈉溶液、離心,去除上層油脂和底部沉渣,取中部清液加入酸性溶液,形成不溶性雜蛋白顆粒,並將不溶性顆粒去除,加入鹼性溶液,用凝膠柱層折法、半透膜法或超濾法濃縮,再用真空乾燥法、低溫冷凍乾燥法或低溫冷凍真空乾燥法對濃縮液進行乾燥即可收集免疫球蛋白A。本發明的優點是首次用人工的方法從乳汁中提取免疫球蛋白A,為人類利用免疫球蛋白A提供了一種既可行、又豐富的方法。
文檔編號C07K1/00GK1287125SQ9911442
公開日2001年3月14日 申請日期1999年9月7日 優先權日1999年9月7日
發明者郭曙平 申請人:郭曙平