包含一種或多種可組合的突變的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的製作方法
2023-06-04 19:41:29
本申請要求2008年11月11日提交的美國臨時專利申請61/113,545和2009年6月19日提交的美國臨時專利申請61/218,802的優先權，所述臨時專利申請在此引入作為參考。發明領域本發明提供改造的蛋白酶變體。具體而言，該蛋白酶變體包含在選定的表面位置處的可組合突變，所述突變影響酶的電荷和/或疏水性以增強得到的變體酶在選擇性應用中的至少一種需要的特性。也提供了包含蛋白酶變體的組合物，以及使用該組合物的方法。發明背景絲氨酸蛋白酶是羰基水解酶的亞類，所述羰基水解酶包含多種具有廣泛的特異性和生物學功能的酶類。在枯草桿菌蛋白酶上已經進行了許多研究，主要是由於它們在清潔和餵飼應用中的有用性。其他研究集中於可能減少這些酶在多種應用中的功能性的不利環境條件上(例如，暴露於氧化劑、螫合劑、極端的溫度和/或pH)。然而，本領域仍需要能抵抗這些不利條件並保留本領域目前已知的那些酶系統的活性或者具有改善的活性的酶系統的需求。發明概述本發明提供改造的蛋白酶變體。具體而言，該蛋白酶變體包含在選定的表面位置處的可組合突變，所述突變影響酶的電荷和/或疏水性以增強得到的變體酶在選擇性應用中的至少一種需要的特性。也提供了包含蛋白酶變體的組合物，以及使用該組合物的方法。在一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬(Bacillus)枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-GI18Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q，和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替換T213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並(包含)選自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的組合替換，其中所述位置對應於SEQIDNO：1的BPN』枯草桿菌蛋白酶的位置。在另一個實施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替代K213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另一個實施方案中，本發明提供了編碼上述任意一種蛋白酶變體的分離的核酸。在另一個實施方案中，本發明提供了包含編碼上述任意一種蛋白酶變體的分離的核酸的表達載體。在另一個實施方案中，本發明提供了包含表達載體的宿主細胞，其相應地包含了編碼上述任意一種蛋白酶變體的分離的核酸。在另一個實施方案中，本發明提供了包含至少一種蛋白酶變體的清潔組合物，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑(drylaundry)。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號,並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替換T213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，本發明提供了包含至少一種蛋白酶變體的清潔組合物，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q-A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的組合替換，其中所述位置對應於SEQIDNO：1的BPN』枯草桿菌蛋白酶的位置。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。又在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替換K213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶(perhydrolases)、角質酶(cutinase)、果膠酶、果膠酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶(ligninase)、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替換T213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另外的實施方案中，清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E，的組合替換，其中所述位置對應於SEQIDNO：1的BPN』枯草桿菌蛋白酶的位置，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替換K213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強效液體洗滌劑或乾洗洗滌劑。在備選的實施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另一個實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個或多個位置的替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在另外的實施方案中，本發明提供了包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO:1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個或多個位置的兩個或多個替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號，並且其具有大於或等於0.5的相對蛋白質表達水平性能指數(TCAPI)和/或去汙活性性能指數(BMIPI)。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式並包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q，和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替換T213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含選自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的組合替換，其中所述位置對應於SEQIDNO：1的BPN』枯草桿菌蛋白酶的位置。在另外的實施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，並包含替換K213Q，其中所述位置通過對應於如SEQIDNO：1所述的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』的胺基酸序列而進行編號。在另外的實施方案中，本發明提供了清潔的方法，包括將表面和/或包含織物的物品與所述的任意一種清潔組合物接觸，並任選地洗滌和/或漂洗所述表面或物品。附圖簡述圖1提供了親本蛋白酶GG36(SEQID：4)和FNA(SEQIDNO：7)與BPN』(SEQIDNO：1)成熟形式的比對。除非另外說明，替換位置以相對於BPN』位置的方式給出。圖2提供了表示胺基酸殘基替換在pH8.6的電荷改變之電荷改變真值表。可以容易地從該真值表中確定與親本酶相比，變體酶的淨電荷改變。圖3提供了表示胺基酸殘基替換的親水性改變的Kyte-Doolittle親水性改變真值表。可以容易地從該真值表中確定與親本酶相比，變體酶的淨親水性改變。圖4提供了pAC-GG36ci的圖譜。圖5提供了pAC-FNAre的圖譜。發明詳述本發明提供改造的蛋白酶變體。具體而言，該蛋白酶變體包含在選定的表面位置處的可組合突變，所述突變影響酶的電荷和/或疏水性以增強得到的變體酶在選擇性應用中的至少一種需要的特性。也提供了包含蛋白酶變體的組合物，以及使用該組合物的方法。如本文中所指，引入的替換影響了枯草桿菌蛋白酶的電荷和/或疏水性，得到了包含至少一種可組合突變的酶，以提供當與親本酶比較時，具有至少一種目的特性的性能指數>0.5的性能指數的變體蛋白酶。可組合突變可以用於在多種應用中增強至少一種需要的酶特性的性能指數。目的特性包括但不限於電荷、疏水性、可溶性、清潔性能例如從織物和/或硬表面去汙、熱穩定性、儲藏穩定性、去垢劑穩定性、底物結合、酶抑制、表達水平、反應速率和底物降解。在一些實施方案中，目的特性是選自電荷、疏水性、表達水平(TCAPI)和清潔性能例如去汙性能(BMIPI)的一種或多種特性。儘管在本文中以蛋白酶和血漬、乳漬和墨漬(BMI)的關係的方式進行描述，但是應當考慮，本發明的蛋白酶變體對於在由應用例如清潔應用指定的任意多種反應介質中的任一酶-底物相互作用是最優的。在此之前，研發優良的蛋白質的嘗試集中於最小化酶與表面的結合。例如，一些方法涉及改變枯草桿菌蛋白酶序列以獲得具有降低對不可溶性底物吸附的變體酶(參見如，WO95/07991)。在另外的方法中，改變了枯草桿菌蛋白酶的pI以獲得在定義的pH具有淨電荷為零的變體酶(參見如，WO91/00345)。然而，正如在本發明的研發期間所測定，這些方法並非總是成功的。在本發明的研發期間，測定出酶的表面特性一般具有由以表面電荷和/或疏水性的方式改變的函數確定的最佳值。甚至對於通常非常活躍的酶，在一些條件下和與一些底物反應時，表面特性也可以造成整個反應比在其他條件下和/或與其他底物反應時更慢。在一些實施方案中，本發明提供了包含修飾了表面特性的變體蛋白酶，其通過改變酶表面上一個或多個胺基酸的性質獲得。當在表面上並不與任一其他胺基酸相互作用且對於酶功能並非必需的位置處產生這些改變時，基於如本文中所述那些位置處替換的胺基酸的特性，可以預測蛋白質的特性。從結構數據可以容易地鑑定位置；備選地，可使用同源序列比對、位點評價文庫數據和/或它們的任一組合。可以將胺基酸得分真值表(aminoacidscoringmatrices)(例如圖1)和/或疏水性尺度(scales)(例如圖2)用於指導胺基酸替換並用於鑑定與替換的胺基酸的特性相關的蛋白質的那些物理特性。定義除非另外指明，本發明的實施包括屬於本領域技術的普遍用於分子生物學、微生物學和重組DNA的常規技術。這些技術為本領域技術人員所公知，並記載於許多本領域熟知的文章和參考著作中。此處提及的所有專利、專利申請、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都明確引入本申請作為參考。除非另外定義，此處所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員所一般理解的含義相同的含義。雖然與此處描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用於本發明的實施或檢測，還是在本文中描述了一些優選的方法和材料。因此，通過整體參考說明書而更加完全地描述下面定義的術語。同時，如本文中所用，單數「一個」、「一」和「所述」包括其複數指代，除非另外清楚指明。數值範圍包括限定範圍的端點數值。除非另外說明，核酸以5'至3'的方向從左向右書寫，而胺基酸序列以氨基端到羧基端的方向從左向右書寫。應理解本發明不限於所描述的特定方法學、實驗方案和試劑，因為本領域技術人員可以根據使用它們的背景而對其進行改變。預期通篇說明書中給定的每個上限值意欲包括每個較小的數值限制，相當於這樣的較小數值限制明確記載於本文中。通篇說明書中給定的每個下限值意欲包括每個較大的數值限制，相當於這樣的更大數值限制明確記載於本文中。整個說明書中每個數值範圍包括落入該較寬數值範圍的每個較窄數值範圍，相當於這樣的較窄數值範圍全部明確記載於本文中。此外，此處提供的標題不是本發明的各個實施方式或方面的限制，該各個實施方式或方面可以通過整體參考說明書而獲得。因此，如上所述，通過整體引用說明書而更加完全地描述下面定義的術語。儘管如此，為了方便本發明的理解，將許多術語定義如下。如本文中所用，術語「性能指數(PI)」指在給定的測定中，變體酶的性能相對於親本酶或參考酶的性能的比率。清潔性能的PI在本文中提供為去除血漬、乳漬和墨漬(BMI)的性能，並提供為BMIPI值。用於表達水平性能的PI在本文中提供為由通過三氯乙酸(TCA)沉澱法測量的產生的蛋白質的水平，並提供為TCAPI值。如本文中所用，「可組合的突變」是對於包含具有至少一種特性的性能指數(PI)值>0.5的突變的變體而言的那些突變。可組合的突變是可以聯合的突變，以賦予蛋白質一種或多種需要特性的合適性能指標(PerformanceIndice)，並給予電荷和/或疏水性的改變。發生突變的位置如下分類：對於至少一種特性，非限制性位置具有＝20％的中性突變；和對於活性和穩定性，限制性位置具有<20％的中性突變。術語「分離的」和「純化的」指從其來源環境(例如，天然環境，如果其是天然發生的)中分離的物質。例如，當其在特定的組合物中以比天然發生的或野生型生物中存在的濃度更高或更低的濃度存在時或者以與並非通常存在於天然存在的或野生型生物中表達的組分組合的方式存在時，稱該物質為「純化的」。例如，存在於活的動物中的天然發生的多核苷酸或者多肽不是分離的，但是分離自天然系統中的一些或者所有共存物質的相同的核苷酸或多肽是分離的。在一些實施方案中，此類多核苷酸是載體的一部分，和/或此類多核苷酸或多肽是組合物的一部分，並且仍然是分離的，因為此類載體或組合物並不是其天然環境的一部分。在優選的實施方案中，稱核苷酸或蛋白質為純化的，例如，如果其在電泳凝膠或印跡中產生基本上一條帶時。術語「分離的」，當用於指DNA序列時，指已經從其天然遺傳環境中分離的DNA序列，並因此沒有其他無關的或不需要的編碼序列，並且為適合於在遺傳改造的蛋白質生產系統中使用的形式。此類分離的分子是那些分離自它們的天然環境的分子並包括cDNA和基因克隆。本發明的分離的DNA分子沒有與它們通常相關的其他基因，但是可以包括天然存在的5'和3'非翻譯區例如啟動子和終止子。相關區域的鑑定對本領域普通技術人員是顯而易見的(參見例如，Dynan和Tijan，Nature316：774-78[1985])。術語「分離的DNA序列」備選地稱為「克隆的DNA序列」。術語「分離的」，當用於指蛋白質時，指在除其天然環境外的條件中發現的蛋白質。在優選的形式中，分離的蛋白質基本上沒有其他蛋白質，特別是其他同源的蛋白質。分離的蛋白質具有由SDS-PAGE測定的大於約10％的純度，優選地大於約20％，和甚至更優選地大於約30％的純度。本發明另外的方面包括由SDS-PAGE測定的高純化形式(即，大於約40％的純度，大於約60％的純度，大於約70％的純度，大於約80％的純度，大於約90％的純度，大於約95％的純度，大於約97％的純度和甚至大於約99％的純度)的蛋白質。如本文中所用，「親本」蛋白質指例如通過引入一種或多種胺基酸替換修飾，以產生親本蛋白質的一種或多種變體的蛋白質。因此，術語「蛋白酶變體」和「變體蛋白酶」用於指與變體蛋白酶類似，特別是與它們的功能類似的親本蛋白酶的變體，但是在它們的胺基酸序列中的突變使得它們從1個至20個胺基酸位置與親本蛋白酶的序列不同。示例性親本蛋白酶的成熟區域的胺基酸序列顯示於圖1的比對結果中。FNA(SEQIDNO:7)和GG36(SEQIDNO:4)是已得到修飾並含有一個或多個可組合的替換的成熟親本蛋白酶，所述可組合的替換產生本發明的變體蛋白酶。GG36是野生型遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)的蛋白酶，而FNA是含有Y217L替換的解澱粉芽孢桿菌的BPN』蛋白酶。如本文中所用，術語「蛋白酶」和「蛋白水解活性」指顯示出水解肽或具有肽鍵的底物的能力的蛋白質或肽。存在許多熟知的方法來測量蛋白水解活性((Kalisz,「MicrobialProteinases」出自Fiechter(編著),AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,[1988])。例如，蛋白水解活性可以通過比較實驗來確定，該實驗分析了各種蛋白酶水解商業底物的能力。用於這種蛋白酶或蛋白水解活性分析的示例性底物包括但不限於，二甲基酪蛋白(SigmaC-9801)，牛膠原(SigmaC-9879)，牛彈性蛋白(SigmaE-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical902111)。使用這些底物的比色法為本領域所熟知，參見，例如WO99/34011和美國專利6,376,450，所述兩專利在本文中引入作為參考。pNA測定(參見，例如DelMar等人,Anal.Biochem.,99:316-320[1979])也可以用於測定在梯度洗脫期間收集的組分的活性酶濃度。該測定測量當酶水解可溶性合成底物琥珀醯-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對-硝基苯胺(sucAAPF-pNA)時的對硝基苯胺釋放率。用分光光度計在410nm處測量從水解反應中產生的黃色的速率，其與活性酶濃度成比例。此外，在280nm的吸光度測量可以用於測定總蛋白質的濃度。活性酶/總蛋白質比率給出了酶純度。如本文中所用，術語「枯草桿菌蛋白酶」指如在MEROPS-ThePeptidaseDatabase中所述的S8絲氨酸蛋白酶家族的任一成員(Rawlings等人，MEROPS：thepeptidasedatabase，NucleicAcidsRes，第34資料庫專輯，D270-272，2006，在merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi？id＝s08；action＝：網站)。以下信息來源於到2008年11月6日為止的MEROPS-ThePeptidase資料庫，「肽酶家族S8含有絲氨酸內肽酶枯草桿菌蛋白酶及其同源物(PeptidasefamilyS8containstheserineendopeptidasesubtilisinanditshomologues)」(BiochemJ，290：205-218，1993)。S8家族，也已知為枯草桿菌酶，是絲氨酸肽酶的第二大家族，並可以分為兩個亞族，S8A亞族的示例類型為枯草桿菌蛋白酶(S08.001)和S8B亞族的示例類型為枯草溶菌酶(kexin)(S08.070)。以前認為三肽基-肽酶II(TPP-II；S08.090)是第三亞族的示例類型，但是已經確定為錯誤分類。S8家族的成員具有Asp、His和Ser序列順序的催化三分子，其與S1、S9和S10家族的序列順序不同。在S8A亞族中，活性部位殘基一般存在於Asp-Thr/Ser-Gly(其與在AA系中的天冬氨酸內肽酶家族中的序列基序類似)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro基序中。在S8B亞族中，催化殘基一般存在於Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg和Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro基序中。大多數S8家族的成員是內肽酶，並且在中性-微鹼性pH時具有活性。該家族中的許多肽酶是熱穩定的。通常將酪蛋白用作為蛋白質底物，並且一般的合成底物是suc-AAPF。該家族的大多數成員是非特異性肽酶，具有優先在疏水殘基後的剪切。然而，S8B的成員，例如枯草溶菌酶(S08.070)和弗林蛋白酶(S08.071)，在氨基二羧酸後剪切。一般絲氨酸肽酶抑制物例如DFP和PMSF可以抑制S8家族的大多數成員。因為家族的許多成員都與鈣結合以穩定，用EDTA和EGTA可以觀察到抑制，所以通常認為其是金屬蛋白酶的特異抑制物。蛋白質抑制物包括火雞卵類粘蛋白第三結構域(I01.003)、鏈黴菌屬(Streptomyces)(I16.003)枯草桿菌蛋白酶抑制劑和I13家族的成員例如水蛭蛋白酶抑制劑C(I13.001)和大麥(棒ley)抑制劑CI-1A(I13.005)，它們中的許多也抑制胰凝乳蛋白酶(S01.001)。枯草桿菌蛋白酶前肽是其自身的抑制物，並且來自酵母屬的同源蛋白酶B抑制物抑制塞裡維辛(cerevisin)(S08.052)。目前已測定S8家族的幾個成員的三級結構。典型的S8蛋白質結構由具有在兩層螺旋之間的7鏈β摺疊夾層的三層組成。枯草桿菌蛋白酶(S08.001)是SB系類型結構(SB)。儘管具有不同的結構，枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性部位是可以疊加的，表明相似性是趨同而非趨異進化的結果。如本文中所用，術語「桿菌」和「桿菌屬」包括本領域技術人員已知桿菌屬的所有成員，包括但不限於枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)、環狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)和蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。應承認，桿菌屬還在持續進行分類學上的重新組織。所以，桿菌屬包括那些已經重新分類的物種，包括但不限於例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(現在命名為Geobacillusstearothermophilus)等微生物。氧氣存在下抵抗性的內生孢子被認為是桿菌屬的定義性特徵，雖然該特徵也適用於現在命名的環脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus)、兼性芽孢桿菌(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)、短芽孢桿菌(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌(Halobacillus)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)、需鹽芽孢桿菌(Salibacillus)、耐熱芽孢桿菌(Thermobacillus)、Ureibacillus和枝芽孢桿菌(Virgibacillus)。術語「蛋白質」和「多肽」在本文中可互換地使用。與IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature(JCBN)一致定義的胺基酸的3字母密碼用於本公開中。應當理解，由於遺傳密碼的簡併性，多肽可以由一種以上的核苷酸序列編碼。「前序列」是蛋白酶的信號肽和成熟區之間的胺基酸序列。在成熟過程期間剪切前序列，導致產生蛋白酶的活性成熟形式。術語「信號序列」或「信號肽」指參與成熟或前體形式的蛋白質分泌的任一核苷酸和/或胺基酸序列。該信號序列的定義是功能性定義，意圖包括由蛋白質基因的氨基端部分編碼的所有胺基酸序列，其參與蛋白質分泌的實施。它們通常，但並非普遍地與蛋白質的氨基端部分或與前體蛋白質的氨基端部分結合。信號序列可以是內源的或者外源的。信號序列通常可以是與蛋白質(例如，蛋白酶)相關的，或者可以來自編碼其他分泌蛋白質的基因。一種示例性外源信號序列包含與來自遲緩芽孢桿菌(ATCC21536)的枯草桿菌蛋白酶的信號序列的剩餘部分融合的枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的信號序列的前七個胺基酸殘基。術語「雜合信號序列」指信號序列中的一部分是獲自與待表達的基因的信號序列融合的表達宿主的信號序列。在一些實施方案中，使用合成的序列。術語蛋白質或肽的「成熟」形式指蛋白質或肽的最終功能性形式。作為示例,本文中提供的FNA蛋白酶的成熟形式包括SEQIDNO:7的胺基酸序列，而GG36的成熟形式包括SEQIDNO:4的胺基酸序列。本文中的術語「前體」指具有與成熟蛋白質的氨基端或羧基端有效連接的前序列的蛋白質或肽形式。作為示例，成熟GG36(SEQIDNO:4)和FNA(SEQIDNO:7)的前體的序列分別為SEQIDNOS:3和SEQIDNOS:6。前體也可以具有與前序列的氨基端有效連接的「信號」序列。前體也可以具有涉及翻譯後活性的其他多核苷酸(例如，從其剪切以釋放成熟形式的蛋白質或肽的多核苷酸)。「天然存在的酶」和「天然存在的蛋白質」指具有與見於天然界的胺基酸序列相同的非修飾的胺基酸序列的酶或蛋白質。天然存在的酶包括天然酶，那些酶天然表達於或見於特定的微生物中。術語「源自」和「獲自」不僅指由所討論的生物的菌株產生的或可產生的酶，例如蛋白酶，也指由分離自此種菌株的DNA序列編碼的和在含有此種DNA序列的宿主生物中產生的酶。此外，該術語指由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼的酶，並且該酶具有所討論酶的相同的特徵。本定義範圍內的「衍生物」通常保留了在野生型、天然或親本形式中觀察到的特徵性蛋白水解活性，以使衍生物可以用於野生型、天然或親本形式類似的目的。功能性酶衍生物包括天然發生的、合成或重組產生的具有親本酶的一般特徵的肽或肽片段。如本文中所用，「對應於」指在蛋白質或肽中所列舉的位置處的殘基。如本文中所用，「替換的」和「替換」指取代親本序列中一個或多個胺基酸殘基或核酸鹼基。在一些實施方案中，該替換涉及取代天然存在的殘基或鹼基。在一些實施方案中，替換兩個或多個胺基酸以產生包含組合胺基酸替換的變體蛋白酶。在一些實施方案中，組合替換通過進行了替換的位置處的胺基酸表示。例如，由E6A-E30G表示的組合意為用丙氨酸(A)替換了位置6處的穀氨酸(E)，並且用甘氨酸(G)替換了位置30處的穀氨酸(E)。給出的胺基酸位置對應於枯草桿菌蛋白酶BPN』的成熟區域(SEQODNO:1)中的編號位置。本文中的短語「在兩個或多個位置處的替換」指在同一蛋白質中進行兩個或多個替換的組合。因此，「在兩個或多個位置處的替換」指2個、3個、4個、5個、6個和7個胺基酸替換的組合的任意一種。如本文中所用，術語「表達盒」和「表達載體」指重組或合成產生的核酸構建體，其具有一系列允許特定的核酸在靶細胞中轉錄的特定核酸元件。該重組表達盒可以摻入到質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除其他序列外，表達載體的重組表達盒部分包括待轉錄的核酸序列和啟動子。在優選的實施方案中，表達載體具有在宿主細胞中摻入並表達異源DNA片段的能力。許多原核的和真核的表達載體是商業可獲得的。選擇合適的表達載體是在本領域技術人員的知識範圍內的。在本文中，術語「表達盒」與「DNA構建體」和它們的語法等同形式可以互換地使用。選擇合適的表達載體是在本領域技術人員的知識範圍內的。如本文中所用，術語「載體」指設計用於將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸構建體。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、盒等。在一些實施方案中，該多核苷酸構建體包含編碼蛋白酶(例如，前體或成熟蛋白酶)的DNA序列，所述DNA序列與能在合適的宿主中影響該DNA表達的合適的前序列(例如，分泌的序列等)有效連接。如本文中所用，術語「質粒」指用作為克隆載體的環狀雙鏈(ds)DNA構建體，並且其在一些真核生物或原核生物中形成了染色體外的自我複製遺傳元件或者整合到宿主染色體中。如本文中所用，術語「宿主菌株」或「宿主細胞」指用於包含根據本發明的DNA的表達載體的合適宿主。如本文中所用，「清潔組合物」和「清潔製劑」指用於從待清潔的物品除去不需要的化合物的組合物，所述物品例如織物、餐具、隱形眼鏡、其他固體底物、頭髮(洗髮劑)、皮膚(肥皂和乳膏)、牙齒(漱口劑、牙膏)等。該術語包括選擇用於特定類型的所希望的清潔組合物的任一物質/化合物以及在該組合物中使用的產品的形式(例如，液體、凝膠、顆粒、粉末或噴霧組合物)。通過考慮待清潔的表面、物品或織物以及在使用期間用於清潔條件的組合物的希望形式，可以容易地進行清潔組合物材料的特定選擇。該術語也指適合於清潔、漂白、消毒和/或殺菌任意物體和/或表面的任一組合物。該術語意圖包括但不限於洗滌劑組合物(例如，液體和/或固體洗衣劑和精細織物洗滌劑；硬表面清潔製劑，例如用於玻璃、木材、陶瓷的和金屬的臺面和窗戶的清潔製劑；地毯清潔劑；烤箱清潔劑；織物增鮮劑；織物軟化劑；和紡織品和衣物預去斑劑，以及餐具洗滌劑)。事實上，除非另外指明，本文中所用的術語「清潔組合物」包括，幹的例如顆粒或粉末形式的全效或強效洗滌劑，特別是清潔洗滌劑；液體的、凝膠的或者膏狀形式的全效洗滌劑，特別是所謂的強效液體(HDL)型；液體精細織物洗滌劑；手洗餐具洗滌劑或輕漬餐具洗滌劑，特別是那些高發泡型(high-foamingtype)；家用和公用的機洗餐具洗滌劑，包括多種片劑、顆粒、液體和助漂洗類型；液體清潔和消毒劑，包括抗菌型手洗洗滌類型、清潔棒、漱口劑、假牙清潔劑、汽車和地毯洗滌劑、衛浴清潔劑；洗髮劑和護髮素；沐浴凝膠和泡沫浴和金屬清潔劑；以及清潔助劑例如漂白添加劑和「染色棒(stain-stick)」或預處理類型。如在本文中所用，「織物清潔組合物」包括手洗和機洗衣物洗滌劑組合物，包括衣物添加組合物和適合於在浸泡和/或預處理汙垢織物(例如，衣物，日用織品和其他紡織材料)中使用的組合物。如本文中所用，「非織物清潔組合物」包括非紡織的(即，織物的)表面清潔組合物，包括但不限於餐具清洗洗滌劑組合物、口腔清潔組合物、假牙清潔組合物和個人清潔組合物。如本文中所用，術語「洗滌劑組合物」和「洗滌劑製劑」用於指意圖在用於清潔髒物體的洗滌介質中使用的混合物。在優選的實施方案中，該術語用於指用於清潔餐具、刀叉餐具等(例如「餐具洗滌劑」或「餐具清潔洗滌劑」)的洗滌劑。並不意圖使本發明限於任一具體的洗滌劑製劑或組合物。事實上，除含有本發明的至少一種蛋白酶的洗滌劑外，該術語還包括含有表面活性劑、轉移酶、水解酶、氧化還原酶、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍劑和螢光染料、抗結塊劑、掩蔽劑、酶活化劑、抗氧化劑和助溶劑的洗滌劑。如本文中所用，「餐具洗滌組合物」指用於清潔餐具包括刀叉餐具的組合物的所有形式，包括但不限於顆粒和液體形式。並不意圖使本發明限於任一具體類型餐具組合物。事實上，本發明用於清潔任意材料的餐具(例如，餐具，包括但不限於盤子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉餐具(例如，器具，包括但不限於匙、刀、叉、餐點器具等)，所述材料包括但不限於陶瓷、塑料、金屬、瓷器、玻璃、丙烯酸脂類等。本文中所用的術語「餐具」指餐具和刀叉餐具二者。如本文中所用，「無磷酸鹽餐具洗滌劑」是含有不多於0.5％的磷(即，磷是痕量元素)的洗滌劑。如本文中所用，變體蛋白酶的「洗滌性能」或「清潔性能」指當與不存在蛋白酶變體的情況下獲得的清潔能力比較時，變體蛋白酶對清潔組合物的清潔能力所起的作用。本文中所用的術語「相關洗滌條件」指餐具或衣物洗滌劑細分市場中在家庭中實際使用的條件，特別是洗滌溫度、時間、洗滌機械、肥皂液濃度、洗滌劑類型和水硬度。術語「改善的洗滌性能」用於指在相關洗滌條件下在去汙中獲得的更好的最終結果，或者指相對於對應的野生型或起始親本蛋白酶獲得相同的最終結果所需的在重量方面更少的變體蛋白酶。如本文中所用，術語「消毒」指從表面去除汙垢，以及抑制或者殺滅物品表面的微生物。並不意圖使本發明限於任一具體的表面、物品或者待除去的汙垢或微生物。如本文中所用，「酶的有效量」指為達到具體應用(例如，個人護理產品、清潔組合物等)中所需的酶活性所需的酶的量。本領域普通技術人員可以容易地確定該有效量，並且其基於許多因素，例如所用的具體的酶變體、清潔應用、清潔組合物的具體成分，以及需要的是液體組合物還是幹(例如，顆粒、棒料)組合物，等。本文中清潔組合物的「緊湊型」形式通過密度得到最好反映，並且就組合物而言，由無機填料鹽的量得到最好反映。無機填料鹽是粉末形式洗滌劑組合物的常規成分。在常規洗滌劑組合物中，該填充鹽以基本量存在，一般佔總組合物重量的約17％至約35％。相比之下，在緊湊型組合物中，該填充鹽以不超出總組合物的約15％的量存在。在一些實施方案中，該填充鹽按組合物的重量以不超過約10％，或者更優選地約5％的量存在。在一些實施方案中，該無機填料選自鹼金屬和鹼土金屬的硫酸鹽和鹽酸鹽。優選的填料鹽是硫酸鈉。如本文中所用，「輔助成分」或「輔助材料」指清潔材料，包括但不限於表面活性劑、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、漂白催化劑、其他酶、酶穩定系統、螯合劑、螢光增白劑、汙物釋放聚合物、染料傳遞劑、分散劑、抑泡劑、染料、香料、著色劑、填充鹽、水溶增溶劑、光漂劑、螢光增白劑、織物調節劑、水解表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、色斑、silvercare、防晦暗劑和/或防腐蝕劑、鹼度來源、增溶劑、載體、加工助劑、色素和pH控制劑(參見例如，美國專利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部專利申請在此處引入作為參考)。如本文中所用，「餐具洗滌組合物」指用於清潔餐具的組合物的所有形式，包括但不限於顆粒和液體形式。如本文中所用，「織物清潔組合物」指用於清潔織物的洗滌劑組合物的所有形式，包括但不限於顆粒、液體和棒狀形式。如本文中所用，「織物」包括任一織造材料。因此，該術語意圖包括衣服，以及織品、紗、纖維、非織造材料、天然材料、合成材料和任一其他織造材料。如本文中所用，「紡織品」指織造的織物，以及適合於轉變成或者用作紗的短纖維和長絲、織造物、針織品和非織造織物。該術語包括天然，以及合成的(例如，製造的)纖維製造的紗。如本文中所用，「紡織材料」是用於纖維、紗中間產品、紗、織物和由織物製造的產品(例如，衣服和其他物品)的常用術語。目前用於在工業、消費或藥物應用中改善蛋白質性能的大多數策略都集中於在酶活性部位或者在酶活性部位附近的胺基酸替換，以增加催化效率。然而，在本發明的研發期間，測定到除可能由於催化效率改善而增加的酶性能之外，在酶表面上其他位置的突變顯著地增加了酶性能。基本上，由酶介導的控制底物轉變成產物的反應速率僅部分地通過單獨的化學催化轉變步驟的速率控制。在酶和底物結合為酶-底物ES複合物之前，以及在從化學轉變後形成的酶-產物EP複合物解離期間，酶和底物作為膠體相互作用。即使該反應步驟以快速率進行，酶也可以非常慢地靠近底物(例如，擴散限制)，如同經歷靜電排斥力的相同指標的膠體的情況一樣。此外，酶從酶-產物EP複合物中釋放可以非常地慢(例如，擴散限制)，如同經歷短程疏水引力和分散力的膠體的情況一樣。與化學轉變比較，兩種條件都增加了酶轉換底物為產物的時間，並成為限速步驟。儘管可以假設，相反電荷的膠體可以事實上地加速ES複合物的形成(例如，在擴散極限以上)，但是隨後的EP複合物的解離會相當的慢(假定沒有電荷產生或者丟失)並可能降低總體反應速率。因此，開發了不對稱的成對相互作用勢能(thepair-wiseinteractionpotential)以確保最小化ES複合物和EP複合物二者的轉換時間。這在工業生物技術中特別重要，因為其期望在通常的酶限制性條件下以儘可能最短的時間將所有的底物轉變成產物。歷史上，蛋白質工程師側重於化學轉變步驟的特定酶-底物相互作用，並沒有意識到由膠體分子間力和表面力產生的短期和長期非特異性相互作用二者的作用，所述相互作用控制結合和解離步驟。本發明的目的是提供了通過改變酶表面上一個或多個胺基酸的性質獲得的具有改變的表面特性的蛋白酶變體，其優化了分子間作用力，使得化學轉化步驟成為限速步驟。表面特性的修飾通過使用本文中所述的方法引入改變酶的電荷和/或疏水性的胺基酸替換達到。一旦該化學轉變步驟成為了限速步驟，那麼可以通過改變酶活性部位來達到變體酶性能的進一步改善。無論底物是溶液中的小肽還是不溶性宏觀底物，該目的都是適用的。然而，涉及的機制知識對於製備和使用本發明並非必需。並不意圖使本發明限於任一具體的機制。簡而言之，用於產生本發明的蛋白酶變體的方法包括(I)測定跨度物理特性範圍的探針蛋白質；(II)測定給定的所要結果的物理特性最佳值；和(III)提供具有物理特性最佳值的變體蛋白質。I.測定探針蛋白質測定探針蛋白質涉及在合適的測定中檢測覆蓋目的物理特性(即「目的特性」)範圍的多個探針蛋白質(即「探針蛋白質摺疊」)。探針蛋白質包括蛋白質和/或其變體的有限集。在一些示例性實施方案中，測試了至少一種絲氨酸蛋白酶的一種或多種優點。例如，提供了相對於親本酶的變體(兩種絲氨酸蛋白酶，GG36和FNA)的淨電荷的改變。在本文中描述了GG36和FNA變體的淨電荷改變，與各自的親本酶比較，跨越了-7至0的相對靜電荷改變範圍。II.測定物理特性最佳值測定物理特性最佳值即測定目的特性的最佳值，涉及鑑定所要結果的物理特性最佳值或其範圍。在一些示例性實施方案中，測量了FNA和GG36蛋白酶變體的清潔性能指數，在本文中提供為BMIPI。在其他實施方案中，測量了FNA和GG36蛋白酶變體的表達水平，在本文中提供為TCAPI。在本實施方案中，當比較用具有相同摺疊模式的蛋白質即絲氨酸蛋白酶獲得的優點時，使用了相對比較(例如，相對於野生型或親本蛋白質的靜電荷差異)。備選地，當比較用具有不同摺疊模式的蛋白質，例如絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶獲得的優點時，使用了常見的物理特性尺度(例如，報導為ζ電勢的蛋白質電荷)。使用跨越寬物理特性範圍的探針蛋白質，以增加定義物理特性的最佳值的可能性。一旦通過測定探針蛋白質建立了目的優點的最佳值或最佳值範圍，那麼就可以預測將較差的性能(performer)(例如，處於最佳值範圍的外面)轉變成較高性能(performer)(例如，在最佳值範圍內)可能所需的改變的總趨勢和強度二者。考慮使用一種以上的探針蛋白質系列，以允許鑑定目的優點的不同物理特性最優條件。例如在一些實施方案中，檢測了相對於洗滌劑蛋白酶GG36和FNA的親本酶的淨電荷和疏水性二者的改變在血、乳、墨測定中的清潔性能。在一些例子中，認為相同的物理特性對於不同優點會顯示出不同的最佳值。例如，存在FNA的清潔性能(BMIPI)的最佳蛋白酶電荷，其與表達水平(TCAPI)的最佳蛋白酶電荷不同。在一些實施方案中，在測量的ζ電勢、淨電荷、電荷密度和/或可離子化基團的表面計數方面比較了親本蛋白質和變體蛋白質之間與電荷相關的物理特性。總而言之，測定蛋白質電荷的任一方法(滴定法或者電泳測量法)都適合於比較不同的蛋白質摺疊模式。當具備時，通過計算基於蛋白質一級、二級和/或三級序列信息的一個或多個上述值來比較不同蛋白質變體。用於此類目的的一般生物信息學工具包括使用Henderson-Hesselbach等式(例如，EuropeanMolecularBiologyLaboratory)的等電點計算器或者Poisson-Boltzmann靜電解算機(例如，DelPhi，MOE)。III.提供具有物理特性最佳值的變體蛋白質一旦在以上步驟中確定了最佳值和範圍，那麼將提供滿足目的物理特性的多個候選蛋白質。用於提供候選蛋白質的合適方法包括但不限於，通過重組技術產生人工酶變體，以及通過層析法純化天然酶變體(例如，同源的)、體外合成糖基化或磷酸化酶變體或者體外產生的酶綴合物。通過糖基化改變蛋白質的疏水性的另一方法是在酶的表面產生新的糖基化部位。在表達期間將會體內地糖基化這些變體。在一些實施方案中，就由替換的殘基對產生的變體相對於親本酶的疏水性淨改變的總體貢獻而言，比較了蛋白酶變體間與疏水性相關的物理性質。在一些實施方案中，使用文獻中可得到的和本領域已知的許多胺基酸疏水尺度的一種或多種來計算總體疏水貢獻，其將蛋白質一級、二級和/或三級結構信息考慮在內。例如就測量的蛋白質在其天然含水環境和疏水相之間分配而言，比較不同的蛋白質摺疊模式間與疏水性相關的物理特性。例子包括但不限於在空氣-水或者庚烷-水界面處的表面張力，以及在水相和含有固體底物相之間的接觸角和潤溼測量。總之，適合於表徵蛋白質在兩種相之間分配的任一方法都適合於在本發明中使用，包括光學的(例如，橢圓對稱、表面等離子共振、幹涉測量和/或反射性)測定法、聲學的(例如，石英晶體微量天平)測定法、螢光測定法、光譜學(例如，衰減全反射紅外的)測定法或者濃度(例如，酶活性)測定法。由於帶電荷殘基增加了親水特性，因此電荷和疏水性尺度並非是相互獨立的。因此，本發明的一些實施方案並不是簡單的相對於其他而挑選一個尺度，而是使用多種不同的尺度(例如，理論或者實驗測定的尺度)用於鑑定物理特性依從性。最常用的23種疏水性尺度的文獻包括：疏水性(Rao和Argos)：計算膜埋入的螺旋參數(Rao和Argos，Biochim.Biophys.Acta869：197-214[1986])；疏水性(Black和Mould)：計算生理性L-α胺基酸的疏水性(Black和Mould，Anal.Biochem.，193：72-82[1991])；疏水性(Bull和Breese)：計算疏水性(以kcal/mole表示的轉移到表面的自由能)(Bull和Breese，Arch.Biochem.Biophys.161：665-670[1974])；疏水性(Chothia)：計算95％埋入殘基的比例(在12種蛋白質中)(Chothia，J.Mol.Biol.，105：1-14[1976])；疏水性(Kyte和Doolittle)：計算親水性(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132[1982])；疏水性(Eisenberg等人)：計算標準化的共同疏水性尺度(Eisenberg等人，J.Mol.Biol.179：125-142[1984])；疏水性(Fauchere和Pliska)：計算疏水性尺度(pi-r)(Fauchere和Pliska，Eur.J.Med.Chem.，18：369-375[1983])；疏水性(Guy)：基於轉移自由能(kcal/mole)計算疏水性尺度(Guy，BiophysJ.，47：61-70[1985])；疏水性(Janin)：計算從球蛋白內部轉移到外部的自由能(Janin，Nature277：491-492[1979])；疏水性(Abraham和Leo)計算疏水性(deltaG1/2cal)(Abraham和Leo，Proteins：Structure，FunctionandGenetics2：130-152[1987])；疏水性(Manavalan等人)計算周圍平均的疏水性(Manavalan等人，Nature275：673-674[1978])；疏水性(Miyazawa等人)計算疏水性尺度(基於3D數據的接觸能)(Miyazawa等人，Macromolecules18：534-552[1985])；疏水性(Aboderin)計算胺基酸在層析紙上的遷移率(RF)(Aboderin，Int.J.Biochem.，2：537-544[1971])；疏水性HPLC(Parker等人)基於HPLC肽滯留時間計算親水性尺度(Parker等人，Biochem.，25：5425-5431[1986])；Hphob.HPLCpH3.4通過HPLC測定計算ph3.4的疏水性指數(Cowan和Whittaker，PeptideRes.，3：75-80[1990])；Hphob.HPLCpH7.5通過HPLC測定計算計算ph7.5的疏水性指數(Cowan和Whittaker，PeptideRes.，3：75-80[1990])；疏水性(Rose等人)(AA)計算平均級分面積損失(f)[埋入的平均面積/標準態面積](Rose等人，Science229：834-838[1985])；和疏水性(Roseman)計算疏水性尺度(pi-r)(Roseman，J.Mol.Biol.，200：513-522[1988])。在具有相同的蛋白質摺疊模式的蛋白酶和其變體之間或者在不同的蛋白質摺疊模式之間比較的其他物理特性，包括但不限於，可溶性相關的物理特性、大小相關的物理特性和蛋白質解鏈溫度。比較了不同蛋白質摺疊模式之間在前述電荷和疏水性尺度二方面的可溶性相關物理特性。總而言之，任一表徵蛋白質-蛋白質對蛋白質-溶劑相互作用的熱力學或動力學值都適合於用於本發明的方法。例如，可以使用反映背離理想混合性質的第二維裡係數(參見，Wilson，ActaCrystallographica，D50：361-365[1994])、chi參數、滲透壓和活性或者逸度係數(參見例如，Reid等人，「ThePropertiesofGasesandLiquids」，第4版，McGraw-Hill，[1987])。使用適合於測定蛋白質或多聚體維度的任一實驗方法比較不同蛋白質摺疊模式之間與大小相關的物理特性。使用蛋白質或多聚體構象(捲曲的、球狀的、分支的)、它們的分子量和流體動力學半徑或者迴轉半徑之間的常用相關性，從分子量推斷大小。用於大小或分子量測定的合適技術包括但不限於靜態光散射和動態光散射、凝膠電泳、質譜和層析。備選地，大小可以容易地從實驗測定的蛋白質晶體結構或者結構的同源模型的信息中估計。蛋白質解鏈溫度(Tm)一般通過監測溫度範圍內的物理指徵特性測定。合適的方法包括但不限於，差示掃描量熱法、圓二色性、動態光散射和紫外可見光譜。絲氨酸蛋白酶類的應用考慮將構建的以產生蛋白酶變體的可組合突變用於增強在多種應用中的至少一種需要的酶特性的性能指數，例如確定性能最佳值。性能/特性最佳值的確定主要受到所使用的介質(例如，洗滌劑的配方、pH、離子強度，等)，以及目的酶的胺基酸殘基的淨電荷和電荷分布影響。因此，考慮存在針對變化的pH、離子強度、表面活性劑類型和比率、助洗劑和螯合劑的不同製劑的最佳酶，所有所述因素都影響靜電現象。考慮使用酶混合物用於生產適合於多種條件(例如，在具有不同的水硬度的不同地區或場所中出售的洗滌劑製劑中的蛋白酶)的製劑，其中該混合物的每一成員擁有不同的電荷最佳值。也考慮了用於生產適合於清潔多種汙跡的製劑的酶混合物的用途，其中該混合物的每一成員擅長於清潔不同的汙跡。此外，考慮了在酶反應期間，酶底物自身經歷電荷改變的情況下酶混合物的用途，其中該混合物的每一成員擁有不同的電荷最佳值。儘管在本文中以蛋白酶和血漬、乳漬和墨漬的關係的方式進行描述，但是應當考慮，本發明的蛋白酶變體對於在由應用例如清潔應用指定的任意多種反應介質(即條件)中的任一酶-底物相互作用是最優的。如本文中更詳細的描述，本發明的變體蛋白酶具有重要的特性，使得它們非常適合於某些應用。例如，在一些優選的實施方案中，本發明的變體蛋白酶與一些目前使用的蛋白酶比較，具有改變的電荷和/或疏水性。因此，這些蛋白酶特別地用於清潔組合物中。事實上，在某些洗滌條件下，與目前使用的枯草桿菌蛋白酶比較，本發明的蛋白酶顯示出相當的或增強的表達和/或去汙活性。因此，應當考慮將本發明的清潔和/或酶組合物提供在多種清潔組合物中。因此，本發明蛋白酶可以用於多種清潔組合物，以及動物飼料應用、皮革加工(例如，軟化)、蛋白質水解和紡織品用途。該鑑定的蛋白酶也可以用於個人護理應用。事實上，本發明的蛋白酶變體可以用於許多工業應用，特別是用於清潔、消毒、動物餵飼和紡織/皮革工業。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶與洗滌劑、助洗劑、漂白劑和其他常規成分組合以產生多種在衣物和其他清潔領域中使用的新清潔組合物，例如，如衣物洗滌劑(粉末衣物洗滌劑和液體衣物洗滌劑二者)、衣物預洗劑、完全織物漂白劑、自動餐具清洗洗滌劑(液體自動餐具清洗洗滌劑和粉末自動餐具清洗洗滌劑二者)、家庭清洗劑、特別是棒和液體皂應用和drainopeners。此外，通過將該材料與清潔組合物的水溶液接觸，變體蛋白酶可以用於隱型眼鏡以及其他物品的清潔。此外，這些變體蛋白酶可以用於例如肽水解、廢物處理、紡織品應用、醫療器材清潔、生物膜去除，並可以用作為蛋白質生產中的融合-剪切酶等。這些產品的組合物對於本發明並不是關鍵的，只要變體蛋白酶在所使用的環境中一直維持其功能。在一些實施方案中，該組合物可以通過將清潔有效量的蛋白酶變體或者包含變體蛋白酶製備物的酶組合物與該組合物的常規成分以其領域公認的量組合來容易地製備。清潔組合物除非另外指出，本文中提供的所有組分或組合物水平通過參考組分或組合物的活性水平而提供，並不包括雜質，例如，殘留溶劑或副產物，其可能存在於市售的來源中。酶組分的重量基於總活性蛋白質。除非另外指出，所有百分比和比率都通過重量計算。除非另外指出，所有百分比和比率都基於全部組合物計算。在示例性洗滌劑組合物中，酶水平按總組合物的重量計的純酶表述，並且除非特別說明，洗滌劑成分按總組合物的重量計的方式來表述。如本文所示，在一些實施方案中，本發明的清潔組合物進一步包含輔助材料，包括但不限於表面活性劑、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、漂白催化劑、其他酶類、酶穩定系統、螯合劑、螢光增白劑、汙物釋放聚合物、染料傳遞劑、分散劑、抑泡劑、染料、香料、著色劑、填充鹽、水溶增溶劑、光漂劑、螢光增白劑、織物調節劑、可水解表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、增光劑、silvercare、防晦暗劑和/或放腐蝕劑、鹼度來源、增溶劑、載體、加工助劑、色素和pH控制劑(參見例如，美國專利號6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部專利在此處引用作為參考)。具體清潔組合物的實施方案在以下詳細說明。在清潔組合物中清潔輔助材料與本發明的變體蛋白酶不兼容的實施方案中，那麼使用保持清潔輔助材料與蛋白酶分離(即相互並不接觸)直到需要兩種組分組合時的合適方法。該分離方法包括本領域已知的任一合適的方法(例如，軟膠囊、膠囊、片劑、物理分離，等)。本發明的清潔組合物可以有利地用於例如衣物應用、硬表面清潔、餐具清洗應用，以及美容應用例如假牙、牙齒、頭髮和皮膚。此外，由於在較低溫度溶液中具有增加的有效性的獨特優點，本發明的酶特別適合於衣物應用。而且，本發明的酶可以用於顆粒和液體組合物。本發明的變體蛋白酶也可以用於清潔添加劑產品。在一些實施方案中，用於低溫溶液清潔應用。在一些實施方案中，當需要其他的漂白效果時，本發明提供了特別適合於摻入到洗滌過程中的包含本發明的至少一種酶的清潔添加產品。此類例子包括但不限於低溫溶液清潔應用。在一些實施方案中，該添加劑產品是其最簡單的形式，一種或多種蛋白酶。在一些實施方案中，該添加劑是以劑量形式包裝的，用於添加到清潔過程中。在一些實施方案中，添加劑是以劑量形式包裝的，用於添加到清潔過程中，其中使用了過氧化(peroxygen)源並且期望得到增加的漂白效果。本發明使用的任一合適的單一劑量單位形式包括但不限於，丸劑、片劑、軟膠囊，或者其他單一劑量單位例如預量過的粉末或液體。在一些實施方案中，包含填充物或載體材料以增加此類組合物的體積。合適的填充物或載體材料包括但不限於，多種硫酸鹽、碳酸鹽和矽酸鹽以及滑石、粘土等。用於液體組合物的合適填充物或載體材料包括但不限於，水或低分子量一級醇和二級醇包括多元醇和二元醇。此類醇的示例包括但不限於，甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實施方案中，該組合物含有約5％至約90％的此類物質。酸性填充物用於降低pH。備選地，在一些實施方案中，該清潔添加劑包括如下更充分描述的輔助成分。本清潔組合物和清潔添加劑需要有效量的本文中所提供的至少一種蛋白酶變體，其可以是單獨的或者與其他蛋白酶和/或其他酶的組合。所需酶的水平通過添加一種或多種本發明的蛋白酶變體來達到。一般地，本清潔組合物包括至少約0.0001重量百分比，約0.0001至約10，約0.001至約1或者甚至約0.01至約0.1重量百分比的本發明的至少一種變體蛋白酶。本文中的清潔組合物一般如下配製以在用於含水清潔操作期間使用時，洗滌用水具有約5.0至約11.5或者甚至約7.5至約10.5的pH。一般製備具有約3.0至約9.0或者甚至約3至約5的淨pH的液體產品製劑。一般製備具有約9至約11的pH的顆粒洗衣產品。控制pH在推薦的使用水平的技術包括緩衝液、鹼、酸等的使用，並且是本領域技術人員熟知的。合適的低pH清潔組合物一般具有約3至約5的淨pH，並且一般不含在該pH環境中水解的表面活性劑。此類表面活性劑包括烷基硫酸鈉，其包含至少一個環氧乙烷部分或者甚至約1至約16摩爾的環氧乙烷。此類清潔組合物一般包含足夠量的pH調節物，例如氫氧化鈉、單乙醇胺或鹽酸，以為此類清潔組合物提供約3至約5的淨pH。此類組合物一般包含至少一種酸穩定酶。在一些實施方案中，該組合物是液體，而在其他實施方案中，它們是固體。此類液體組合物的pH一般測量為淨pH。將此類固體組合物的pH測量為所述組合物的10％固體溶液，其中該溶劑是蒸餾水。在這些實施方案中，除非另外指出，所有pH測量都在20℃進行。在一些實施方案中，當將變體酶用於顆粒組合物或液體中時，期望的是變體蛋白酶是封裝的顆粒形式，以在儲存期間保護變體蛋白酶免於受顆粒組合物中其他組分的影響。此外，包封也是在清潔過程中控制變體蛋白酶的有效性的方法。在一些實施方案中，包封增強了變體蛋白酶和/或其他酶的性能。就此而言，將本發明的變體蛋白酶用本領域已知的任一合適包封材料封裝。在一些實施方案中，該包封材料一般封裝了有關本發明的變體蛋白酶的催化劑的至少一部分。一般地，該包封材料是水溶的和/或水分散的。在一些實施方案中，該包封材料具有0℃或更高的玻璃化轉變溫度(Tg)。玻璃化轉變溫度在WO97/11151中進行了更詳細的描述。該包封材料一般選自碳水化合物、天然或合成樹膠、殼多糖、脫乙醯殼多糖、纖維素和纖維素衍生物、矽酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟和它們的混合物。當包封物質是碳水化合物時，其通常選自單糖、寡糖、多糖和它們的組合物。在一些一般的實施方案中，該封裝材料是澱粉(參見例如，EP0922499；US4,977,252；US5,354,559和US5,935,826)。在一些實施方案中，包封材料是用塑料製備的微球體，例如熱塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和它們的混合物；可用的市售微球體包括但不限於那些由(Stockviksverken，瑞士)和PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和(PQCorp.，ValleyForge，PA)提供的微球體。如本文中所述，本發明的變體蛋白酶可以特別地用於清潔工業，包括但不限於衣物和餐具洗滌劑。這些應用將酶置於多種環境壓力下。本發明的變體蛋白酶提供了優於許多目前使用的酶的優點，歸因於其在多種條件下的穩定性。事實上，參與洗滌的蛋白酶暴露於多種洗滌條件，包括不同的洗滌劑製劑、洗滌用水體積、洗滌用水溫度和洗滌時間長短。此外，在不同地區使用的洗滌劑製劑，其相對組分在洗滌用水中存在的濃度是不同的。例如，歐洲洗滌劑在洗滌用水中一般具有約4500-5000ppm的洗滌劑組分，而日本洗滌劑在洗滌用水中一般具有大約667ppm的洗滌劑組分。在北美，特別是美國，洗滌劑在洗滌用水中一般具有約975ppm的洗滌劑組分。低洗滌劑濃度系統包括在洗滌用水中存在小於約800ppm的洗滌劑組分的洗滌劑。一般認為日本洗滌劑為低洗滌劑濃度系統，因為它們在洗滌用水中具有大約667ppm的洗滌劑組分。中等洗滌劑濃度包括在洗滌用水中存在約800ppm至約2000ppm之間的洗滌劑組分的洗滌劑。一般認為北美洗滌劑為中等洗滌劑濃度系統，因為它們在洗滌用水中具有大約975ppm的洗滌劑組分。巴西洗滌劑在洗滌用水中存在的洗滌劑組分一般為大約1500ppm。高洗滌劑濃度系統包括在洗滌用水中存在大於約2000ppm的洗滌劑組分的洗滌劑。一般認為歐洲洗滌劑為高洗滌劑濃度系統，因為它們在洗滌用水中具有大約4500-5000ppm的洗滌劑組分。拉美洗滌劑一般是高泡磷酸鹽助洗劑洗滌劑，並且由於它們在洗滌用水中具有1500ppm至6000ppm的洗滌劑組分，因此在拉美使用的洗滌劑可以屬於中等和高洗滌劑濃度二者的範圍。如上提及，巴西洗滌劑在洗滌用水中存在的洗滌劑組分一般為大約1500ppm。然而，並不僅限於拉美國家，其他高泡磷酸鹽助洗洗滌劑地區也具有存在於洗滌用水中的高達約6000ppm洗滌劑組分的高洗滌劑濃度系統。根據前述，在全世界，洗滌劑組合物在一般洗滌溶液中的濃度變化如下：從小於約800ppm的洗滌劑組合物(「低洗滌劑濃度地區」)，例如在日本約667ppm，到約800ppm至約2000ppm之間(「中間洗滌劑濃度地區」)，例如在美國約975ppm和在巴西約1500ppm，到高於約2000ppm(「高洗滌劑濃度地區」)，例如在歐洲約4500ppm至約5000ppm和在高泡磷助洗劑地區約6000ppm。經驗地確定一般的洗滌溶液的濃度。例如，在美國，一般的洗衣機容納約64.4L的洗滌溶液。因此，為了在洗滌溶液中獲得約975ppm的洗滌劑濃度，必須加入約62.79g的洗滌劑組合物到64.4L洗滌溶液中。該量是通過消費者使用洗滌劑提供的測量杯測量加入到洗滌用水中的一般量。作為另外的例子，不同的地區使用不同的洗滌溫度。在日本，洗滌用水的溫度一般低於在歐洲使用的溫度。例如，在北美和日本，洗滌用水的溫度一般為約10℃至約30℃(例如，約20℃)，而在歐洲，洗滌用水的溫度一般為約30℃至約60℃(例如，約40℃)。然而，為了節約能源，許多消費者改為用冷水洗滌。此外，在一些另外的區域，一般將冷水用於洗衣，以及餐具洗滌應用。在一些實施方案中，本發明的「冷水洗滌」指在約10℃至約40℃、或者約10℃至約30℃、或者約15℃至約25℃，以及在約10℃至約40℃的範圍內的所有其他組合溫度時進行的洗滌。作為另外的例子，不同地區一般具有不同的水硬度。水硬度通常描述為每加侖混合的Ca2+/Mg2+的格令量。硬度是在水中測量的鈣(Ca2+)和鎂(Mg2+)的量。在美國，大多數水是硬的，但是硬度的程度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有百萬分之60至181(百萬分率轉變成美國每加侖格令是ppm#除以17.1等於每加侖格令)的硬礦物質。水每加侖的格令百萬分率軟少於1.0小於17微硬1.0至3.517至60中等硬3.5至7.060至120硬7.0至10.5120至180非常硬高於10.5大於180歐洲水硬度一般高於每加侖約10.5(例如約10.5至約20.0)格令的混合的Ca2+/Mg2+(例如，每加侖約15格令的混合的Ca2+/Mg2+)。北美水硬度一般高於日本水硬度，但是低於歐洲水硬度。例如，北美水硬度可以在約3格令至約10格令之間、約3格令至約8格令之間或者約6格令。日本水硬度一般低於北美水硬度，通常低於約4格令，例如每加侖約3格令的混合的Ca2+/Mg2+。因此，在一些實施方案中，本發明提供了在至少一組洗滌條件(例如，水溫、水硬度和/或洗滌劑濃度)下顯示出令人驚奇的洗滌性能的變體蛋白酶。在一些實施方案中，本發明的變體蛋白酶與其他枯草桿菌蛋白酶在洗滌性能方面是相當的。在一些實施方案中，與目前市售的枯草桿菌蛋白酶比較，本發明的變體蛋白酶顯示出增強的洗滌性能。因此，在本發明的一些優選的實施方案中，本文中提供的變體蛋白酶顯示出增強的氧化穩定性、增強的熱穩定性、在多種條件下增強的清潔能力和/或增強的螯合穩定性。此外，本發明的變體蛋白酶可以單獨或者與助洗劑和穩定劑組合地用於並不含有洗滌劑的清潔組合物中。在本發明的一些實施方案中，清潔組合物包含按組合物的重量計約0.00001％至約10％水平的本發明的至少一種變體蛋白酶和按組合物的重量計含清潔輔助材料的剩餘部分(例如，約99.999％至約90.0％)。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物包含按組合物的重量計約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％水平的至少一種變體蛋白酶和含清潔輔助材料的清潔組合物的剩餘部分(例如，按重量計約99.9999％至約90.0％、約99.999％至約98％、約99.995％至約99.5％)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含一種或多種其他洗滌劑酶，其提供了清潔性能和/或織物護理和/或餐具清洗益處。合適的酶的示例包括但不限於，半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質酶、果膠酶、果膠酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶或它們的混合物。在一些實施方案中，所用的酶組合物(即，「混合物」)包含常規使用的酶如蛋白酶、酯肪酶、角質酶和/或纖維素酶連同使用的澱粉酶。除本文中提供的蛋白酶變體外，在本發明的組合物中可以使用任一其他合適的蛋白酶。合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶。在一些特別優選的實施方案中，使用微生物蛋白酶。在一些實施方案中，包括化學或遺傳修飾的變體。在一些實施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，優選地鹼性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。鹼性蛋白酶的例子包括枯草桿菌蛋白酶，特別是衍生自芽孢桿菌屬(Bacillus)的那些枯草桿菌蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶、緩慢芽孢桿菌的蛋白酶,解澱粉芽孢桿菌的蛋白酶,枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,枯草桿菌蛋白酶309,枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168)。其他例子包括在美國專利RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628中描述的變體蛋白酶，所述全部專利在此處引用作為參考。其他蛋白酶例子包括但不限於，胰蛋白酶(例如，豬或牛來源的胰蛋白酶)和在WO89/06270所述的鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。在一些實施方案中，在本發明中使用的市售蛋白酶包括但不限於，MAXACALTM、MAXAPEMTM、EXCELLASETM、PURAFASTTM和OXP(Genencor)；DURAZYMTM、和(Novozymes)；和BLAPTM(HenkelKommanditgesellschaftaufAktien，Duesseldorf，德國)。多種蛋白酶描述於WO95/23221、WO92/21760、U.S.專利申請公開文本No.2008/0090747和美國專利5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、USRE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，以及多種其他專利中。在一些實施方案中，在本發明中使用的金屬蛋白酶包括但不限於，描述於WO07/044993中的中性金屬蛋白酶。此外，本發明中可以使用任一合適的脂肪酶。合適的脂肪酶包括但不限於細菌和真菌來源的那些脂肪酶。本發明包括化學或遺傳修飾的突變體。有用的脂肪酶的示例包括柔毛腐質黴(Humicolalanuginosa)脂肪酶(參見例如，EP258068和EP305216)、米赫根毛黴(Rhizomucormiehei)脂肪酶(參見例如，EP238023)、假絲酵母(Candida)脂肪酶，例如南極假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如，南極假絲酵母脂肪酶A或南極假絲酵母脂肪酶B；參見例如，EP214761)、假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶例如P.alcaligenes脂肪酶和P.pseudoalcaligenes脂肪酶(參見例如，EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)脂肪酶(參見例如，EP331376)、P.stutzeri脂肪酶(參見例如，GB1,372,034)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢桿菌屬脂肪酶(例如枯草芽孢桿菌脂肪酶[Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta1131：253-260[1993]]；嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶[參見例如，JP64/744992]；和B.pumilus脂肪酶[參見例如，WO91/16422])。此外，在本發明的一些實施方案中可以使用許多克隆的脂肪酶，包括但不限於沙門柏乾酪青黴(Penicilliumcamembertii)脂肪酶(參見，Yamaguchi等人，Gene103：61-67[1991])、白地黴(Geotricumcandidum)脂肪酶(參見，Schimada等人，J.Biochem.，106：383-388[1989])和多種根黴屬(Rhizopus)脂肪酶例如代氏根黴(R.delemar)脂肪酶(參見，Hass等人，Gene109：117-113[1991])、R.niveus脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.56：716-719[1992])和米根黴(R.oryzae)脂肪酶。在本發明的一些實施方案中也可以使用其他類型的脂解酶例如角質酶，包括但不限於，來源於門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)的角質酶(參見，WO88/09367)，和來源於豌豆腐皮鐮孢(Fusariumsolanipisi)的角質酶(參見，WO90/09446)。另外的合適脂肪酶包括市售的脂肪酶例如M1LIPASETM、LUMAFASTTM和LIPOMAXTM(Genencor)；和ULTRA(Novozymes)；和LIPASEPTM「Amano」(AmanoPharmaceuticalCo.Ltd.，日本)。在本發明的一些實施方案中，清潔組合物進一步包含按組合物的重量計約0.00001％至約10％的其他脂肪酶水平的脂肪酶和按組合物的重量計的清潔輔助材料的剩餘部分。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物也包含按組合物的重量計約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的脂肪酶水平的脂肪酶。在本發明的一些實施方案中，本發明可以使用任一合適的澱粉酶。在一些實施方案中，也可以使用適合於在鹼性溶液中使用的任一澱粉酶(例如，α澱粉酶和/或β澱粉酶)。合適的澱粉酶包括但不限於細菌或真菌來源的那些澱粉酶。在一些實施方案中包括化學或遺傳修飾的突變體。在本發明中使用的澱粉酶包括但不限於，獲自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的α澱粉酶(參見例如，GB1,296,839)。在本發明中使用的市售澱粉酶包括但不限於，和BANTM(Novozymes)，以及POWERASETM、和P(Genencor)。在本發明的一些實施方案中，本發明的清潔組合物進一步包含按組合物的重量計約0.00001％至約10％的其他澱粉酶水平的澱粉酶和按組合物的重量計的清潔輔助材料的剩餘部分。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物也包含按組合物的重量計約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的澱粉酶水平的澱粉酶。在一些另外的實施方案中，本發明的清潔組合物可以使用任一合適的纖維素酶。合適的纖維素酶包括但不限於細菌或真菌來源的那些纖維素酶。在一些實施方案中包括化學或遺傳修飾的突變體。合適的纖維素酶包括但不限於特異腐質黴(Humicolainsolens)纖維素酶(參加例如，美國專利4,435,307)。特別合適的纖維素酶是具有色彩護理優點的纖維素酶(參見例如，EP0495257)。在本發明中使用的市售的纖維素酶包括但不限於，(Novozymes)和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。在一些實施方案中，摻入的纖維素酶為成熟野生型或變體纖維素酶的一部分或者片段，其中氨基端的一部分缺失(參見例如，美國專利5,874,276)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物進一步包含按組合物的重量計約0.00001％至約10％水平的其他纖維素酶的纖維素酶和按組合物的重量計的清潔輔助材料的剩餘部分。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物也包含按組合物的重量計約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％的纖維素水平的纖維素酶。適合於在洗滌劑組合物中使用的任一甘露聚糖酶也可以用於本發明中。合適的甘露聚糖酶包括但不限於細菌和真菌來源的那些甘露聚糖酶。在一些實施方案中包括化學或遺傳修飾的突變體。在本發明中使用的多種甘露聚糖酶是已知的(參見例如，美國專利6,566,114、美國專利6,602,842和美國專利6,440,991，所述全部專利申請在此處引用作為參考)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物進一步包含按組合物的重量計約0.00001％至約10％的其他甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶和按組合物的重量計的清潔輔助材料的剩餘部分。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物也包含按組合物的重量計約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶。在一些實施方案中，在本發明的組合物中使用與過氧化氫或其來源(例如，過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)組合的過氧化物酶。在一些備選的實施方案中，氧化酶與氧組合使用。兩種酶都用於「溶液漂白」(即，當織物在洗滌用水中一起洗滌時，防止織物染料從染色織物向另一織物轉移)，優選地與增強劑一起使用(參見例如，WO94/12621和WO95/01426)。合適的過氧化物酶/氧化酶包括但不限於，植物、細菌或真菌來源的那些過氧化物酶/氧化酶。在一些實施方案中包括了化學或遺傳修飾的突變體。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物進一步包含按組合物的重量計約0.00001％至約10％的其他過氧化物酶和/或氧化酶水平的其他過氧化物酶和/或氧化酶和按組合物的重量計的清潔輔助材料的剩餘部分。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物也包含按組合物的重量計約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的過氧化物酶和/或氧化酶水平的過氧化物酶和/或氧化酶。在一些實施方案中，可以使用的其他酶包括但不限於過水解酶(perhydrolase)(參見例如，WO05/056782)。此外，在一些具體優選的實施方案中，包括了本文上述酶的混合物，具體是一種或多種其他蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一種纖維素酶。事實上，考慮在本發明中使用這些酶的多種混合物。也考慮變體蛋白酶和一種或多種其他酶的不同水平都可以獨立地變動至約10％，清潔組合物的剩餘部分是清潔輔助材料。通過考慮待清潔的表面、物品或者織物，和在使用期間(例如，在清洗洗滌劑使用期間)用於清潔條件的組合物的期望形式可以容易地具體選擇清潔輔助材料。合適的清潔輔助材料的例子包括但不限於，表面活性劑、助洗劑、漂白劑、漂白活性劑、漂白催化劑、其他酶、酶穩定系統、螯合劑、螢光增白劑、去汙聚合物、染料轉移劑、染料轉移抑制劑、催化材料、過氧化氫、過氧化氫的來源、預製的過酸、聚合分散劑、去粘土汙漬劑、結構增彈劑、分散劑、抑泡劑、染料、香料、色料、填料鹽、水溶增溶劑、光漂劑、螢光增白劑、衣物柔順劑、織物軟化劑、載體、水溶增溶劑、加工助劑、溶劑、色素、可水解的表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、色斑、silvercare、防晦暗劑和/或防腐蝕劑、鹼度來源、增溶劑、載體、加工助劑、色素和pH控制劑(參見例如，美國專利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部專利申請在此處引入作為參考)。以下詳細地列舉了具體的清潔組合物材料的實施方案。在清潔組合物中清潔輔助材料與本發明的變體蛋白酶不兼容的實施方案中，那麼使用保持清潔輔助材料與蛋白酶分離(即相互並不接觸)的合適方法，直到需要將兩種組分組合時。該分離方法包括本領域已知的任一合適的方法(例如，軟膠囊、膠囊、片劑、物理分離等)。在一些優選的實施方案中，本文中提供的一種或多種變體蛋白酶的有效量包含於用於清潔需要去除蛋白質汙跡的多種表面的組合物中。此類清潔組合物包括用於如清潔硬表面、織物和餐具此類應用的清潔組合物。事實上，在一些實施方案中，本發明提供了織物清潔組合物，而在另外的實施方案中，本發明提供了非織物清潔組合物。特別地，本發明也提供了適合於個人護理的清潔組合物，包括口腔護理(包括dentrifices、牙膏、漱口劑等，以及假牙清潔組合物)、皮膚和頭髮清潔組合物。本發明意圖包括任一形式(即，液體、顆粒、棒、半固體、凝膠、乳劑、片劑、膠囊等)的洗滌組合物。通過實施例的方式，以下更詳細地描述了使用本發明的變體蛋白酶的幾種清潔組合物。在一些實施方案中，其中將本發明的清潔組合物配製為適合於在洗衣機洗滌方法中使用的組合物，本發明的組合物優選地含有至少一種表面活性劑和至少一種助洗劑化合物，以及選自有機聚合化合物、漂白劑、其他酶、抑泡劑、分散劑、石灰皂分散劑、汙物懸液和抗再沉澱劑和腐蝕抑制劑的一種或多種清潔輔助材料。在一些實施方案中，洗衣組合物也含有軟化劑(即，作為其他的清潔輔助材料)。本發明的組合物也可以用於固體或液體形式的洗滌劑添加產品。此類添加劑產品意圖補充和/或增強傳統洗滌組合物的性能，並可以在清潔過程的任一階段添加。在一些實施方案中，在20℃測量的本文中的衣物洗滌組合物的濃度為約400g/升至約1200g/升，而在其他實施方案中，其為約500g/升至約950g/升。在配製為在人工餐具洗滌方法中使用的組合物的實施方案中，本發明的組合物優選地含有至少一種表面活性劑和優選地至少一種選自有機聚合化合物、增泡劑、第II族金屬離子、溶劑、水溶增溶劑和其他酶的其他清潔助劑材料。在一些實施方案中，多種清潔組合物例如在美國專利6,605,458中提供的那些清潔組合物可以與本發明的變體蛋白酶一起使用。因此，在一些實施方案中，包含本發明的至少一種變體蛋白酶的組合物是緊湊型顆粒織物清潔組合物，而在其他實施方案中，該組合物是在洗滌有色織物中有用的顆粒織物清潔組合物，在另外的實施方案中，該組合物是在洗滌的過程中提供軟化的顆粒織物清潔組合物，在其他的實施方案中，該組合物是強效液體織物清潔組合物。在一些實施方案中，包含本發明的至少一種變體蛋白酶的組合物是織物清潔組合物，例如在美國專利6,610,642和6,376,450中描述的那些織物清潔組合物。此外，本發明的變體蛋白酶可以用於在歐洲或日本洗滌條件下顆粒衣物洗滌劑組合物的具體用途中(參見例如，美國專利6,610,642)。在一些備選的實施方案中，本發明提供了包含本文中提供的至少一種變體蛋白酶的硬表面清潔組合物。因此，在一些實施方案中，包含本發明的至少一種變體蛋白酶的組合物是硬表面清潔組合物，例如描述於美國專利6,610,642、6,376,450和6,376,450中的那些硬表面清潔組合物。又在另外的實施方案中，本發明提供了包含本文中提供的至少一種變體蛋白酶的餐具洗滌組合物。因此，在一些實施方案中，包含本發明的至少一種變體蛋白酶的組合物是硬表面清潔組合物，例如在美國專利6,610,642和6,376,450中的那些硬表面清潔組合物。仍在一些另外的實施方案中，本發明提供了包含本文中提供的至少一種變體蛋白酶的餐具洗滌組合物。在一些另外的實施方案中，包含本發明的至少一種變體蛋白酶的組合物包含口腔護理組合物，例如那些在美國專利申請6,376,450和6,376,450中的那些口腔護理組合物。包含在前述美國專利6,376,450、6,605,458、6,605,458和6,610,642中的化合物和清潔輔助材料的配方和說明書可與本文中提供的變體蛋白酶一起使用。本發明的清潔組合物可以配製成任一合適的形式並通過由製造者選擇的任一方法製備，所述方法的非限制性示例描述於美國專利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中，所述全部專利在此處引入作為參考。當需要低pH清潔組合物時，通過添加材料例如單乙醇胺或者酸性物質例如HCl調節此類組合物的pH。雖然實質上並非是本發明的目的，但是在下文中說明的輔助物的非限制性列表適合於在速溶清潔組合物中使用。在一些實施方案中，將這些輔助物摻入，例如以輔助或者增強清潔性能、用於處理待清潔的底物或者以修飾清潔組合物的美學感官(如在使用香料、染料、色料等的情況時)。應當理解，此類輔助物是在除本發明的變體蛋白酶之外而添加的。這些添加組分的精確性質和其摻入的水平取決於組合物的物理形式和將使用其的清潔操作的性質。合適的輔助物材料包括但不限於，表面活性劑、助洗劑、螯合劑、染料轉移抑制劑、沉積助劑、分散劑、其他的酶和酶穩定劑、催化材料、漂白活性劑、漂白加強劑、過氧化氫、過氧化氫的來源、預製的過酸、聚合的分散劑、去粘土汙漬/抗再沉積劑、增白劑、抑泡劑、染料、香料、結構增彈劑、織物軟化劑、載體、水溶增溶劑、加工助劑和/或色素。除以下的公開外，此類其他輔助物的合適示例和使用的水平見於引用作為參考的美國專利申請5,576,282、6,306,812和6,326,348。上述的輔助成分可以構成本發明的清潔組合物的餘量。在一些實施方案中，根據本發明的清潔組合物包含至少一種表面活性劑和/或表面活性劑系統，其中該表面活性劑選自非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兼性離子表面活性劑、半極性非離子表面活性劑和它們的混合物。在一些低pH清潔組合物實施方案中(例如，具有約3至約5的淨pH的組合物)，該組合物一般並不含有烷基乙氧基化硫酸鹽，因為認為此類表面活性劑可能被該組合物的酸性物質水解。在一些實施方案中，該表面活性劑按清潔組合物的重量計為約0.1％至約60％的水平存在，而在備選的實施方案中，該水平為約1％至約50％，而仍在另外的實施方案中，該水平為約5％至約40％。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑助洗劑或助洗劑系統。在一些摻入至少一種助洗劑的實施方案中，清潔組合物包含按清潔組合物的重量計的至少約1％、約3％至約60％或者甚至約5％至約40％的助洗劑。助洗劑包括但不限於，多磷酸鹽的鹼金屬鹽、銨鹽和鏈烷醇銨鹽、鹼金屬矽酸鹽、鹼土金屬碳酸鹽和鹼金屬碳酸鹽、鋁矽酸鹽、聚羧酸酯化合物、羥基聚羧酸酯醚、馬來酸酐與乙烯或者乙烯甲基醚的共聚物、1,3,5-三羥基苯-2,4,6-三磺酸和羧基甲氧基琥珀酸(carboxymethyloxysuccinicacid)、聚乙酸的多種鹼金屬鹽、銨鹽和取代的銨鹽例如乙二胺四乙酸和氨三乙酸，以及聚羧酸鹽例如苯六甲酸、琥珀酸、檸檬酸、氧聯琥珀酸、聚馬來酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸和它們的可溶性鹽。事實上，考慮在本發明的多種實施方案中使用任一合適的助洗劑。在一些實施方案中，助洗劑形成水溶性硬度離子複合物(hardnessioncomplex)(例如，多價螯合的助洗劑)，例如檸檬酸鹽和聚磷酸鹽(例如，三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉六水合物、三聚磷酸鉀以及混合的三聚磷酸鈉和三聚磷酸鉀等)。考慮在本發明中使用任一合適的助洗劑，包括本領域已知的那些助洗劑(參見例如，EP2100949)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含至少一種螯合劑。合適的螯合劑包括但不限於，銅、鐵和/或錳螯合劑和它們的混合物。在使用至少一種螯合劑的實施方案中，本發明的清潔組合物包含佔受試清潔組合物的重量計的約0.1至約15％或者甚至約3.0％至約10％的螯合劑。仍在一些實施方案中，本文中提供的清潔組合物包含至少一種沉積助劑。合適的沉積助劑包括但不限於，聚乙二醇、聚丙二醇、多羧酸酯、去汙聚合物例如polytelephthalicacid，粘土例如高嶺石、蒙脫土、凹凸棒石黏土(atapulgite)、伊利石、膨潤土、埃洛石石和它們的混合物。如在本文中所指，在一些實施方案中，在本發明的一些實施方案中可以使用抗再沉積劑。在一些優選的實施方案中，可以使用非離子表面活性劑。例如，在自動餐具洗滌實施方案中，非離子表面活性劑可以用於表面修飾目的，特別是對於表面(sheeting)，以避免薄膜形成和起斑並改善光澤。這些非離子表面活性劑也可以用於預防汙漬的再沉積。在一些優選的實施方案中，抗再沉積劑是本領域已知的非離子表面活性劑(參見例如，EP2100949)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含一種或多種染料轉移抑制劑。合適的聚合型染料轉移抑制劑包括但不限於，聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮(polyvinyloxazolidone)和聚乙烯咪唑或者它們的混合物。在使用了至少一種染料轉移抑制劑的實施方案中，本發明的清潔組合物包含按清潔組合物重量計約0.0001％至約10％、約0.01％至約5％或者甚至約0.1％至約3％的染料轉移抑制劑。在一些實施方案中，本發明的組合物內包含矽酸鹽。在一些此類實施方案中，可以使用矽酸鈉(例如，二矽酸鈉、偏矽酸鈉和晶體層狀矽酸鹽)。在一些實施方案中，矽酸鹽以約1％至約20％的水平存在。在一些優選的實施方案中，矽酸鹽按組合物的重量計以約5％至約15％的水平存在。仍在一些其他實施方案中，本發明的清潔組合物也含有分散劑。合適的水溶性有機材料包括但不限於，同或共聚合物酸或者它們的鹽，其中多聚羧酸包含至少兩個羧基，通過不多於2個的碳原子將所述羧基彼此分離。在一些另外的實施方案中，在清潔組合物中使用的酶通過任何合適的技術穩定。在一些實施方案中，本文中使用的酶通過最終組合物中存在的鈣和/鎂離子的水溶性來源而穩定，所述最終組合物提供此類離子給酶。在一些實施方案中，酶穩定劑包括寡糖、多糖和無機二價金屬鹽包括鹼土金屬鹽，例如鈣鹽。本發明中可以使用多種用於酶穩定的技術。例如，在一些實施方案中，本文中使用的酶通過在最終組合物中存在鋅(II)、鈣(II)和/鎂(II)離子的水溶性來源，以及其他金屬離子(例如，鋇(II)、鈧(II)、鐵(II)、錳(II)、鋁(III)、錫(II)、鈷(II)、銅(II)、鎳(II)和氧化釩(oxovanadium(IV))而得到穩定，所述最終組合物提供此類離子給酶。在本發明的一些實施方案中也可以使用氯化物和硫酸鹽。合適的寡糖和多糖(例如，糊精)的示例是本領域已知的(參見例如，WO07/145964)。在一些實施方案中，也可以使用可逆的蛋白酶抑制劑，例如含硼的化合物(例如，硼酸鹽、4-甲醯苯基硼酸)和/或如所希望地，使用三肽醛進一步改善穩定性。在一些實施方案中，本發明的組合物中存在漂白劑、漂白活性劑和/或漂白催化劑。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含無機和/有機漂白化合物。無機漂白劑包括但不限於，過氧化氫合物鹽(例如，過硼酸鹽、過碳酸鹽、過磷酸鹽、過硫酸鹽和過矽酸鹽)。在一些實施方案中，無機過氧化氫合物鹽是鹼金屬鹽。在一些實施方案中，包含沒有其他保護的結晶性固體的無機過氧化氫合物鹽，而在一些其他實施方案中，該鹽是包被的。可以在本發明中使用本領域已知的任何合適鹽(參見例如，EP2100949)。在一些實施方案中，將漂白活性劑用於本發明的組合物中。漂白活性劑一般是在60℃或更低溫度的清潔期間增強漂白作用的有機過酸前體。適合於在本文中使用的漂白活性劑包括在過水解(perhydrolysis)條件下提供脂肪族過氧化羧酸(aliphaicperoxoycarboxylicacid)和/或任選地經取代的過苯甲酸的化合物，其中脂肪族過氧化羧酸具有優選的約1個至約10個碳原子、特別是約2個至約4個碳原子。其他漂白活性劑是本領域已知的並可以適用於本發明中(參見例如，EP2100949)。此外，在一些實施方案中和如本文中進一步所述，本發明的清潔組合物進一步包含至少一種漂白催化劑。在一些實施方案中，可以使用三氮雜環壬烷錳和相關的絡合物，以及鈷、銅、錳和鐵絡合物。在本發明中可以使用其他漂白催化劑(參加例如，美國4,246,612、5,227,084、4,810410、WO99/06521和EP2100949)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物含有一種或多種催化金屬複合物。在一些實施方案中，可以使用含金屬的漂白催化劑。在一些優選的實施方案中，使用包含催化系統的金屬漂白催化劑，所述催化系統包含確定了漂白催化活性的過渡金屬陽離子(例如，銅、鐵、鈦、釕、鎢、鉬或錳陽離子)、具有極少或者沒有漂白催化活性的輔助金屬陽離子(例如，鋅或鋁陽離子)和具有針對催化性和輔助性金屬陽離子的定義了穩定常數的螯合劑(sequestrate)，特別是乙二胺四乙酸、乙二胺四甲叉膦酸(亞甲基膦酸)和它們的水溶性鹽(參見例如，美國專利申請4,430,243)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物通過錳化合物催化。使用的此類化合物及其水平是本領域熟知的(參見例如，美國專利申請5,576,282)。在其他的實施方案中，可以在本發明的清潔組合物中使用鈷漂白催化劑。多種鈷漂白催化劑是本領域已知的(參加例如，美國專利申請5,597,936和5,595,967)並可以通過已知的方法容易地製備。在其他的實施方案中，本發明的清潔組合物包含巨多環剛性配體(MRL)的過渡金屬絡合物。作為實施的方式，並不以限制的方式，在一些實施方案中，調節由本發明提供的組合物和清潔方法以在含水洗滌介質中提供至少億萬分之一級別的活性MRL種類，並且在一些優選的實施方案中，在溶液中提供約0.005ppm至約25ppm，更優選地約0.05ppm至約10ppm，和最優選地約0.1ppm至約5ppm的MRL。在速溶過渡金屬漂白催化劑中優選的過渡金屬包括但不限於，錳、鐵和鉻。優選的MRL也包括但不限於，交聯的特異超剛性配體(例如，5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮雜雙環[6.6.2]正十六烷)。可以通過已知的方法(參見例如，WO2000/32601和美國專利申請6,225,464)容易地製備合適的過渡金屬MRL。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含金屬護理劑。金屬護理劑用於預防和/或降低金屬，包括鋁、不鏽鋼和非鐵類金屬(例如，銀和銅)的鏽蝕、腐蝕和/或氧化。合適的金屬護理劑包括描述於EP2100949、WO9426860和WO94/26859中的那些金屬護理劑。在一些實施方案中，金屬護理劑是鋅鹽。在一些另外的實施方案中，本發明的清潔組合物包含按重量計約0.1％至約5％的一種或多種金屬護理劑。如上所指出，本發明的清潔組合物可以配製成任一合適的形式，並可以通過由配製者選擇的任一方法製備，所述方法的非限制性示例描述於美國專利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,516,448、5,489,392、和5,486,303，所述全部專利申請在此處引入作為參考。在其中需要低pH清潔組合物的一些實施方案中，可以通過添加酸性物質例如HCl調節此種組合物的pH。本文中公開的清潔組合物可以用於清潔物品(situs)(例如，表面、餐具或織物)。一般而言，該物品的至少一部分與以純品形式或者稀釋於洗滌用水中的本發明清潔組合物的實施方案接觸，並然後任選地洗滌和/或漂洗該物品。對於本發明的目的，「洗滌」包括但不限於，擦洗和機械攪拌。在一些實施方案中，該清潔組合物在溶液中一般以約500ppm至約15,000ppm的濃度使用。當洗滌溶液是水時，水溫一般為約5℃至約90℃的範圍，並當物品包含織物時，水與織物質量比率一般為約1:1至約30:1。實驗提供以下實施例以說明並進一步闡明本發明的某些優選的實施方案和方面，並不應解釋為限制其範圍。在以下公開的實驗中，使用以下縮寫：℃(攝氏度)；rpm(轉/分鐘)；H2O(水)；HCl(鹽酸)；aa和AA(胺基酸)；bp(鹼基對)；kb(千鹼基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；μm和um(微米)；M(體積摩爾濃度的)；mM(毫摩爾)；μM和uM(微摩爾)；U(單位)；V(電壓)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分鐘)；hr(小時)；MgCl2(氯化鎂)；NaCl(氯化鈉)；OD280(280nm處光密度)；OD405(405nm處光密度)；OD600(600nm處光密度)；PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸鹽緩衝鹽水[150mMNaCl、10mM磷酸鈉緩衝液，pH7.2])；LAS(十二烷基磺酸鈉)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)胺基甲烷)；TAED(N,N,N』N』-四乙醯乙二胺)；BES(聚酯碸(polyesstersulfone))；MES(2-嗎啉代乙磺酸,一水合物；f.w.195.24；Sigma#M-3671)；CaCl2(氯化鈣,無水的；f.w.110.99；Sigma#C-4901)；SRI(去汙指數),BMI(血乳墨)和BMIPI(血乳墨性能指數),TCA(三氯乙酸)和TCAPI(三氯乙酸性能指數)。此外，材料獲自以下的一些機構：TIGR(TheInstituteforGenomicResearch，Rockville，MD)；AATCC(AmericanAssociationofTextileandColoringChemists)；Amersham(AmershamLifeScience，Inc.ArlingtonHeights，IL)；Corning(CorningInternational，Corning，NY)；ICN(ICNPharmaceuticals，Inc.，CostaMesa，CA)；Pierce(PierceBiotechnology，Rockford，IL)；Equest(Equest，WarwickInternationalGroup，Inc.，Flintshire，UK)；EMPA(EidgenossischeMaterialPrufungsundVersuchAnstalt，St.Gallen，Switzerland)；CFT(CenterforTestMaterials，Vlaardingen，TheNetherlands)；Amicon(Amicon，Inc.，Beverly，MA)；ATCC(AmericanTypeCultureCollection，Manassas，VA)；BectonDickinson(BectonDickinsonLabware，LincolnPark，NJ)；Perkin-Elmer(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)；Rainin(RaininInstrument，LLC，Woburn，MA)；Eppendorf(EppendorfAG，Hamburg，Germany)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Geneart(GeneartGmbH，Regensburg，Germany)；PerseptiveBiosystems(PerseptiveBiosystems，Ramsey，MN)；MolecularProbes(MolecularProbes，Eugene，OR)；BioRad(BioRad，Richmond，CA)；Clontech(CLONTECHLaboratories，PaloAlto，CA)；Cargill(Cargill，Inc.，Minneapolis，MN)；Difco(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；NewBrunswick(NewBrunswickScientificCompany，Inc.，Edison，NJ)；Thermoelectron(ThermoelectronCorp.，Waltham，MA)；BMG(BMGLabtech，GmbH，Offenburg，Germany)；Greiner(GreinerBio-One，Kremsmuenster，Austria)；Novagen(Novagen，Inc.，Madison，WI)；Novex(Novex，SanDiego，CA)；Finnzymes(FinnzymesOY，Finland)Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Invitrogen(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)；Sigma(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)；DuPontInstruments(Asheville，NY)；GlobalMedicalInstrumentation或GMI(GlobalMedicalInstrumentation；Ramsey，MN)；MJResearch(MJResearch，Waltham，MA)；Infors(InforsAG，Bottmingen，Switzerland)；Stratagene(StratageneCloningSystems，LaJolla，CA)；Roche(HoffmannLaRoche，Inc.，Nutley，NJ)；Agilent(AgilentTechnologies，PaloAlto，CA)；Merck(Merck&Co.，Rahway，NJ)；IonBeamAnalysisLaboratory(IonBeanAnalysisLaboratory，TheUniversityofSurreyIonBeamCentre(Guildford，UK)；TOM(Terg-o-Meter)；BMI(血漬、乳漬、墨漬)；BaChem(BaChemAG，Bubendorf，Switzerland)；MolecularDevices(MolecularDevices，Inc.，Sunnyvale，CA)；Corning(CorningInternational，Corning，NY)；MicroCal(Microcal，Inc.，Northhampton，MA)；ChemicalComputing(ChemicalComputingCorp.，Montreal，Canada)；NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)；Beckman(Beckman-Coulter，Fullerton，CA)；SeitzSchenk(SeitzSchenkFiltersystemsGmbH，BadKreuznach，Germany)；Pall(PallCorp.，EastHills，NY)；MalvernInstruments(MalvernInstruments，Inc.，Worcestershire，UK)，DNA2.0(MenloPark，CA)，MolecularDevices(Sunnyvale，CA)，Costar(Cambridge，MA).實施例1測定法在以下的實施例中，為了便於閱讀，如下所述地使用多種測定法。標出了以下提供的方法的任一差別。A.在96空微滴定板中用於蛋白質含量測定的TCA測定法對於FNA(例如，親本蛋白酶)和其突變體，使用來自在33℃、230轉/分鐘搖蕩並加溼通風生長於微滴定板3-4天的過濾培養上清開始該測定。將新的96孔平底微滴定板(MTP)用於測定。首先，在每孔中放入100μL/孔的0.25NHCl。然後加入50μL的過濾培養液。然後在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測定光散射/吸收，以提供「空白」讀數。對於該測試，將100μL/孔的15％(w/v)三氯乙酸(TCA)放入板中，並室溫溫育5至30分鐘。然後在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測定光散射/吸收。對於GG36(例如，親本蛋白酶)和其突變體，使用來自在37℃、300轉/分鐘搖蕩並加溼通風生長於微滴定板約3天的過濾培養上清進行該測定。在該測定中，將100μL的0.25MHCl溶液加入到96孔平底微滴定板的每一孔中。隨後，向每孔加入25μL等分的過濾培養上清(含蛋白酶)。然後在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測定光散射/吸收，以提供「空白」讀數。在該測量後，將100μL/孔的30％(w/v)TCA溶液加入每孔，並將微滴定板室溫溫育5至15分鐘。最後，在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測定最終的光散射/吸收。使用的設備是BiomekFXRobot(BeckmanCoulter)和SpectraMAX(340型；MolecularDevices)MTPReader；MTP來自Costar(9017型)。使用的設備是BiomekFXRobot(BeckmanCoulter)和SpectraMAX340型(MolecularDevices)MTPReader；和MTP是9017型(Costar)。通過從含TCA的測試讀數中減去空白(無TCA)進行計算以提供樣品中蛋白質含量的相對測量。如需要，可以通過用具有已知轉變因子的克隆的AAPF測定校正TCA讀數來產生標準曲線。然而，就蛋白酶濃度為每毫升50至500微克(ppm)的蛋白質而言，TCA結果是線性的，並因此為了選擇良好性能的變體，可以直接針對酶性能作圖。在樣品中渾濁度/光散射的增加與培養上清中可沉澱蛋白質的總量相關。B.清潔性能測定在市售的2XCold洗滌劑中、在微滴定板(MTP)規模上測定提到的絲氨酸蛋白酶和其變體在微塊布樣上的去汙性能。將確定缺少蛋白酶活性的熱滅活2XCold(成品洗滌劑)用於該測定。將熱滅活的購買的洗滌劑用於破壞任一蛋白質組分的酶活性，但保留非酶組分的特性。因此，該方法適合於製備用於在測試本發明的酶變體中使用的商業購買的洗滌劑。使用的試劑為：5mMHEPES，pH8.0或5mMMOPS，pH7緩衝液、3:1Ca：Mg的介質水硬度(CaCl2：MgCl2·6H2O)；稀釋成6gpg的每加侖15000格令(gpg)儲液。每孔使用由CFT處理的兩塊EMPA-116BMI(血漬/乳漬/墨漬)棉花布料樣品。將微布料樣品室溫在去離子水中預洗滌20分鐘。預洗滌步驟後，將布料樣本置於紙巾上面乾燥。然後，在衝壓(expulsionpress下)使用1/4」圓衝模將風乾的布料樣品衝孔。最後，將兩塊微布料樣品垂直地放入96孔MTP的每一孔中以暴露全部表面區域(即，並不是平放在孔的底部)。工作洗滌劑溶液顯示於表1-1中。將溫箱設定為16℃。將來自主稀釋平板的～10ppm酶的10μL樣品加入具有上文列出的190μL工作洗滌劑溶液的BMI2-布料樣品板中。將測定板中的體積調節到變體的終濃度為0.5ppm。立即將平板轉移到iEMS溫箱/震蕩器(Thermo/Labsystems)；並在給定的溫度1400轉/分鐘搖蕩溫育30分鐘。溫育後，將100μL的上清轉移到新96孔板(將Costar9017型用於溫育後讀取反應平板)中，並在405nm和/或600nm處在SpectraMAXMTPReader(340型；MolecularDevices)中測量吸收率。測試中也包括含有2塊微布料樣品和沒有添加蛋白酶樣品的洗滌劑的對照孔。405nm處的測量提供了更高的值並追蹤了色素去除，而在600nm處的測量追蹤了渾濁度和清潔。在該測定中，蛋白酶水解底物並從底物中釋放色素和不溶性顆粒。因此，渾濁度的速率是酶活性的測量。計算去汙活性將獲得的吸光度值用空白值(沒有酶的底物)校正，以提供水解活性的測量。對每一樣品(變體)，計算性能指數。在相同的蛋白質濃度比較變體(實際值)和標準酶(理論值)的性能的性能指數。此外，可以使用標準酶的Langmuir等式的參數計算理論值。性能指數在相同蛋白質濃度比較變體(實際值)和親本蛋白酶(理論值)的性能的性能指數。此外，使用標準蛋白酶的結合曲線(即，Langmuir等式)的參數可以計算理論值。對於至少一種特性具有值>0.5的性能指數(PI)鑑定了包含至少一種突變的變體，所述突變可以與一種或多種突變組合以產生具有一種或多種目的特性的合適的性能指標的蛋白質，該一種或多種目的特性不同於測量的PI值>0.5的目的特性，或者是除測量的PI值>0.5的目的特性之外的特性。實施例2枯草芽孢桿菌GG36枯草桿菌蛋白酶變體在該實施例中，進行實驗以在所述的枯草芽孢桿菌中產生GG36(也在本文中稱為遲緩芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶)。如本領域已知進行轉化(參見例如，WO02/14490)。在枯草芽孢桿菌中產生GG36蛋白酶使用在共有aprE啟動子和BPN』轉錄終止予的控制下，與aprE信號序列的笫8個密碼子融合的GG36密碼予改進的基因構建表達質粒pAC-GG36ci。在以下提供的序列(SEQIDNO：2)中，黑字體和斜字體表示共有aprE啟動子，標準字體表示信號序列，下劃線字體表示前序列，且黑字體表示編碼GG36成熟蛋白酶的DNA，並且下劃線斜字體表示BPN』終止子。用於克隆的KpnI和XhoI限制位點位於編碼GG36成熟區的DNA序列(SEQIDNO：4)的側翼(參見圖4)。atctcaaaaaaatgggtctactaaaatattactccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcatccgctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagttgaggcaaatgacgaggtaαccattctctctaaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttctgtccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgttagagctcgatccagctatttcttatattgaagaggatgcagaagtaactacaatggcgcaatcggtaccatggggaattagcagagtacaagccccagctgcacataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtccttgataccggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggagctagctttgtaccaggggaaccatccactcaagatggcaatggacatggcactcatgttgccggcacaatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttggcgtagcgccaagcgcagaactatacgctgttaaagtattaggagcaagcggttcaggctctgtcagctctattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatcttagtttaggatctccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcctctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgctatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacttacccaggttcaacatatgccagcttaaacggtacatcaatggctactcctcatgttgcaggtgcggctgcacttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatcttaagaatacggcaactagcttaggaagcacaaacttgtatggaagcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgttaaaagcttaactcgagataaaaaaccggccttggccccgccggttttttat(SEQIDNO：2)用於在枯草芽孢桿菌中表達GG36蛋白酶的質粒pAC-GG36ci顯示於圖4中。質粒元件如下：pUB110＝來自質粒pUB110的DNA片段[McKenzieT.，HoshinoT.，TanakaT.，SueokaN.(1986)pUB110的核苷酸序列：與複製和其調節有關的一些突出特性(TheNucleotideSequenceofpUB110：SomeSalientFeaturesinRelationtoReplicationandItsRegulation)。Plasmid15：93-103]，pBR322＝來自質粒pBR322的DNA片段[BolivarF，RodriguezRL，GreenePJ，BetlachMC，HeynekerHL，BoyerHW。(1977)新載體II的構建和表徵。多目的克隆系統(Constructionandcharacterizationofnewcloningvehicles.II.Amultipurposecloningsystem)。Gene2：95-113]，pC194＝來自質粒pC194的DNA片段[HorinouchiS.，WeisblumB。(1982)pC194的核苷酸序列和功能圖，特異誘導氯黴素抗性的質粒(NucleotidesequenceandfunctionalmapofpC194，aplasmidthatspecifiesinduciblechloramphenicolresistance)，J.Bacteriol150：815-825]。質粒特徵如下：枯草芽孢桿菌的Ori＝來自pUB110的複製原點，CAT＝來自pC194的氯黴素抗性基因，pMB1複製原點＝來自pBR322的複製原點，bla＝來自pBR322的β-內醯胺酶，短aprE啟動予＝共有轉錄啟動子，信號肽＝信號肽，前肽＝GG36前區域，GG36ci成熟肽＝成熟GG36(被在本研究中表達的每一變體的編碼區替代)，BPN』終止子＝來自枯草桿菌蛋白酶BPN』的轉錄終止子。以下提供了GG36前體蛋白質的胺基酸序列(SEQIDNO：3)。在該序列中，黑體表示成熟GG36蛋白酶(野生型)，其也提供為SEQIDNO：4：MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR*(SEQIDNO：3)AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR*(SEQIDNO：4)遲緩芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶(＝GG36)組合電荷/疏水性文庫(CCHL)的設計和產生通過鑑定7種均勻分布的、表面暴露的胺基酸來設計遲緩芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶組合的電荷/疏水性文庫(CCHL)。這些殘基是S24、R45、S101、Q109、G118、T213和L217。替換位置的編號對應於在BPN』枯草桿菌蛋白酶中編號的位置(BPN』編號；圖1)。如表2-1顯示，通過在每一位置處進行可能的四種組合：野生型，穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、亮氨酸(L)和精氨酸(R)，產生了33個成員的組合疏水性文庫(GH2-GH33)。含有密碼子改進的GG36基因的pAC-GG36ci質粒發送到DNA2.0Inc.(MenloPark，CA)用於產生CHL。將枯草芽孢桿菌菌株(基因型：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE：amyE::xylRPxylAcomK-phleo)提供為用於轉化編碼GG36變體枯草桿菌蛋白酶的DNA的宿主菌株。變體提供為在96孔板中的甘油儲備物。表2-2顯示了在GG36中進行的替換以產生的變體。表2-1也提供了變體GG36和野生型之間的淨電荷和疏水性的差異。蛋白酶變體的表達用鋼製96孔複製器將來自甘油儲備物的克隆加到含有200μl的LB培養基+25μg/ml氯黴素的96孔培養板(BD，353075)中，複製含有GG36或FNA表達載體的枯草芽孢桿菌克隆，並37℃在溼潤的環境中220轉/分鐘生長過夜。將200μl過夜培養物接種在5ml塑料搖管中的2000μl確定成分培養基+25μg/ml氯黴素中。該培養基富含基於MOP緩衝液的半確定成分培養基，其用尿素作為主要的氮源，葡萄糖作為主要的碳源，並補充了1％大豆蛋白腖用於增強細胞生長。將搖管在37℃、220轉/分鐘溫育60小時。60小時後，將上清在大於8000×RCF的離心機中離心。將溶液倒入15ml聚丙烯圓錐管中儲存。不再進行另外的純化或濃縮。為了長期穩定性，將上清儲備物配製為40％丙二醇儲備物並儲存於4℃。實施例3枯草芽孢桿菌FNA枯草桿菌蛋白酶變體在枯草芽孢桿菌中產生FNA蛋白酶在該實施例中，進行實驗以在所述的枯草芽孢桿菌中產生FNA(也在本文中稱為枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN』-Y217L(＝FNA))。如本領域已知進行轉化(參見例如，WO02/14490)。使用在共有aprE啟動子和BPN』轉錄終止予的控制下，與aprE信號序列的第8個密碼子融合的FNA基因構建表達質粒pAC-FNAre。在以下提供的序列(SEQIDNO：5)中，黑字體和斜字體表示共有aprE啟動子，標準字體表示信號序列，下劃線字體表示前序列，且黑字體表示編碼FNA成熟蛋白酶的DNA，並且下劃線斜字體表示BPN』終止子。FNA成熟區含有用於克隆的KpnI和XhoI限制位點(參見圖5)。gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgcaggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagacgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagctagcgctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacgcgcagtccgtgccatatggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatccagatcttaaagtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctggtaccgttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagctcgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagccgcggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggcagctcagtaaaactcgagataaaaaaccggccttggccccgccggttttttat(SEQIDNO：5).用於在枯草芽孢桿菌中表達FNA蛋白酶的質粒pAC-FNAre顯示於圖5中。質粒元件如下：pUB110＝來自質粒pUB110的DNA片段[McKenzieT.，HoshinoT.，TanakaT.，SueokaN.(1986)pUB110的核苷酸序列：與複製和其調節有關的一些突出特性(TheNucleotideSequenceofpUB110：SomeSalientFeaturesinRelationtoReplicationandItsRegulation)。Plasmid15：93-103]，pBR322＝來自質粒pBR322的DNA片段[BolivarF，RodriguezRL，GreenePJ，BetlachMC，HeynekerHL，BoyerHW。(1977)新載體II的構建和表徵。多目的克隆系統(Constructionandcharacterizationofnewcloningvehicles.II.Amultipurposecloningsystem)。Gene2：95-113]，pC194＝來自質粒pC194的DNA片段[HorinouchiS.，WeisblumB。(1982)pC194的核苷酸序列和功能圖，特異誘導氯黴素抗性的質粒(NucleotidesequenceandfunctionalmapofpC194，aplasmidthatspecifiesinduciblechloramphenicolresistance)，J.Bacteriol150：815-825]。質粒特徵如下：枯草芽孢桿菌的Ori＝來自pUB110的複製原點，CAT＝來自pC194的氯黴素抗性基因，pMB1複製原點＝來自pBR322的複製原點，bla＝來自pBR322的β-內醯胺酶，短aprE啟動子＝共有轉錄啟動子，信號肽＝信號肽[指定的]，前肽＝FNA前區域，FNA成熟肽＝成熟FNA(被在本研究中表達的每一變體的編碼區替代)，BPN』終止子＝來自枯草桿菌蛋白酶BPN』的轉錄終止予。以下提供了FNA前體蛋白質的胺基酸序列(SEQIDNO：6)。在該序列中，黑體表示成熟FNA蛋白酶(野生型)，其也提供為SEQIDNO：7：MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQIDNO：6)AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQIDNO：7)枯草桿菌蛋白酶BPN』-Y217L(＝FNA)組合電荷/疏水性文庫(CCHL)的設計和產生通過鑑定7種均勻分布的、表面暴露的胺基酸來設計枯草桿菌蛋白酶BPN』-Y217L組合的電荷/疏水性文庫。這些殘基是S24、A45、S101、N109、N118、K213和L217。在如表3-1顯示，通過在每一位置處進行4種可能的組合：野生型，穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、亮氨酸(L)和精氨酸(R)產生了32個成員的組合疏水性文庫(FH2-FH33)。含有FNA基因的pAC-FNAre質粒發送到DNA2.0Inc.(MenloPark，CA)用於產生組合疏水性文庫。提供枯草芽孢桿菌菌株(基因型：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE:：xylRPxylAcomK-phleo)用於編碼FNA變體替代物的DNA的轉化。變體提供為在96孔板中的甘油儲備物。表3-1顯示了在FNA中進行的替換以產生的變體。表3-1也提供了變體FNA和野生型之間的淨電荷和疏水性的差異。蛋白酶變體的表達用鋼製96孔複製器將來自甘油儲備物的克隆加到含有200μl的LB培養基+25μg/ml氯黴素的96孔培養板(BD，353075)中，複製含有GG36或FNA表達載體的枯草芽孢桿菌克隆，並37℃在溼潤的環境中220轉/分鐘生長過夜。將200μl過夜培養物接種在5ml塑料搖管中的2000μl確定成分培養基+25μg/ml氯黴素中。該培養基富含基於MOP緩衝液的半確定成分培養基，其用尿素作為主要的氮源，葡萄糖作為主要的碳源，並補充了1％大豆蛋白腖用於增強細胞生長。將搖管在37℃、220轉/分鐘溫育60小時。60小時後，將上清在大於8000×RCF的離心機中離心。將溶液倒入15ml聚丙烯圓錐管中儲存。不再進行另外的純化或濃縮。為了長期穩定性，將上清儲備物配製為40％丙二醇儲備物並儲存於4℃。實施例4去汙和相對表達的評價該實施例描述了在BMI微布料樣品測定中測試GG36和FNA組合疏水性文庫變體。使用在實施例1中提供的方法。表4-1(GG36)和4-2(FNA)中顯示的結果是性能指標，其中與分別的親本比較了相對蛋白質表達(TCAPI)和去汙活性(BMIPI)方面的變體的性能。具有性能指數大於0.5(PI>0.5)的那些變體具有改善的性能。將性能指數小於或等於0.05規定為0.05並表示為黑斜體。ND表示沒有測定。本說明書中提及的所有專利和文獻表現出了本發明所屬領域的技術人員的水平。本領域技術人員應當容易的理解，本發明適合於實施該目的並獲得所提及的結果和優點，以及其特性。本文中所述的組合物和方法表示為示例性的優選實施方案，並不意為限制本發明的範圍。本領域技術人員應當容易的理解，可以對本文中公開的發明進行不同的替換和修飾，並不背離本發明的範圍和精神。本文中說明性描述的發明可以合適地在沒有本文中具體公開的因素、限制存在的情況下實施。使用的術語和表達用作為描述性並非限制性術語，並且這些術語和表述的使用並不意圖排除其顯示和描述的任何等價特徵以及其部分。但是應當理解，多種修飾可以在本發明所權利要求的範圍內。因此，應當理解，儘管本發明已經通過優選的實施方案具體地公開，並且本領域技術人員可以採用本文中公開的觀點的任選特性、修飾和變化，並且如本文中所定義，認為此類修飾和變化是在本發明的範圍內的。在本文中已經廣泛且概括性地描述了本發明。屬於概括性公開內的每一較窄的種類和次概括也構成了本發明的一部分。這包括具有限制或者否定性限制條件的本發明概括性公開，以從種類中排除任何物質而不論該物質是否被本發明明確地描述為排除。當前第1頁1 2 3