結縷草屬植物耐鹽性遺傳模型的鑑定方法
2023-07-17 00:54:51 2
專利名稱：結縷草屬植物耐鹽性遺傳模型的鑑定方法
技術領域：
本發明屬於遺傳學研究領域，特別涉及結縷草屬(Zoysia Willd.) 植物耐鹽性遺傳模型的鑑定方法。
背景技術：
結縷草屬(hysia Willd.)植物是禾本科(Poaceae)畫眉草亞科 (Eragrostoideae Pilger)的多年生草本植物，是優良的暖季型草坪草。被廣泛應用於觀賞草坪、運動草坪、休憩草坪以及庭院草坪等各種草坪草的建設中，深受人們的喜愛。隨著濱海鹽鹼地區的開發和園林綠化的需要，對草坪草的耐鹽性提出越來越高的要求，結縷草屬植物作為一種重要的草坪草，培育優質耐鹽的結縷草屬植物新品種是一項非常重要的任務。前期研究結果表明，結縷草屬植物具有較強的耐鹽性，屬內的不同種以及同一種的不同種源間的耐鹽性存在較大的遺傳變異。耐鹽性是一種複雜的數量性狀，其遺傳模型和基因效應如何，對結縷草屬植物耐鹽性的遺傳改良和選擇適當的育種方法具有重要的指導意義，若數量性狀是由一至兩個主基因控制則可採用單交重組或簡單回交轉育的方法；若數量性狀由多個微效基因控制，則因為涉及的基因多、單個基因效應小、增效基因集中到一個個體的概率低、從表型鑑別基因型的難度大等特點，則要採用聚合回交(或雙回交)及輪迴選擇累積增效基因的方法。然而，由於結縷草屬植物為常異交植物，親本異質性很高，在雜交育種中，Flft即發生分離現象，而常規的遺傳分析方法中親本一般為純合親本，F1不分離，F2才發生分離，因此無法應用常規的遺傳分析方法對結縷草屬植物的耐鹽性進行遺傳分析。這些原因導致了結縷草屬植物的耐鹽性遺傳背景知識一直處於缺乏狀態。蓋鈞鎰等(蓋鈞鎰，章元明，王建康.植物數量性狀遺傳體系.北京科學出版社， 2003)建立了 「植物數量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析方法」，該方法中針對單個分離世代F2的分析方法，若只研究主基因的遺傳效應可直接通過F2群體進行計算(王建康，蓋鈞鎰.利用雜種F2世代鑑定數量性狀主基因一多基因混合遺傳模型並估計其遺傳效應.遺傳學報，1997，M (5) :432 440)，不需要純合親本及其雜交的同質F1群體，而結縷草屬植物F1代的分離群體與純合親本雜交的F2群體相當，本發明就利用這一特點借鑑純合親本雜交所獲得的單個分離世代F2群體的遺傳分析方法對結縷草屬植物的耐鹽性遺傳模型進行鑑定。
發明內容
技術問題本發明是針對上述情況，提供一種結縷草屬植物耐鹽性遺傳模型的鑑定方法，以解決結縷草屬植物耐鹽性遺傳育種和遺傳改良時缺乏耐鹽性遺傳背景知識的問題，同時為結縷草屬植物以及其它常異交植物耐鹽性遺傳模型的研究提供一條新的思路。 技術方案上述的結縷草屬植物耐鹽性遺傳模型的鑑定方法，主要包括以下步驟(1)以強耐鹽結縷草種源材料Z105為母本和敏鹽結縷草種源材料Z061為父本進行雜交，獲得F1群體；
(2)通過相關序列擴增多態性SRAP分子標記技術，用父本具有特異性條帶的7對引物的8個特異性片段對F1進行雜種真實性鑑定，7對引物及其對應的8個特異性片段為:Me4Em8-130b 和 150bp, MelEm2_150bp，Me2Em4_220bp，Me4Em9_190bp，Mel6Eml_350bp， Mel2Em3-360bp，Me2Em8-380bp，具有上述任一引物的父本特異性條帶的F1單株鑑定為真雜種，其餘F1單株為假雜種；(3)以( 中鑑定的F1單株真雜種為材料，通過水培法對F1群體的耐鹽性進行鑑定，得到以葉片枯黃率數據為鑑定指標的耐鹽性鑑定結果；(4)對耐鹽性鑑定結果葉片枯黃率數據，應用EXCEL2003對&群體的次數分布進行分析，得到F1群體的耐鹽性呈混合正態分布，符合「參考文獻蓋鈞鎰，章元明，王建康.植物數量性狀遺傳體系.北京科學出版社，2003. P70」所述主基因+多基因的遺傳特徵；(5)參考文獻王建康，蓋鈞鎰.利用雜種F2世代鑑定數量性狀主基因一多基因混合遺傳模型並估計其遺傳效應.遺傳學報，1997，M (5) :432 440所述植物數量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析中的「單個分離世代F2群體的數量性狀分離分析」方法，將F1 群體的葉片枯黃率測定數據，當作模型中的F2群體的數據代入模型進行分析，得到結縷草屬植物耐鹽性的遺傳模型。有益效果(1)通過本發明提供了一種直接應用F1分離群體對結縷草屬植物耐鹽性遺傳模型進行鑑定的方法，同時也為類似於結縷草屬植物的其它常異交植物耐鹽性遺傳模型的鑑定提供了一條新的思路。(2)通過本發明在國際上首次公開了結縷草屬植物耐鹽性的遺傳模型，明確了結縷草屬植物的耐鹽性存在主效加性基因，可通過單交重組或簡單回交轉育的方法進行雜交育種，為結縷草屬植物的雜交育種和遺傳改良提供技術指導。(3)通過本發明發現結縷草屬植物的耐鹽性存在主效基因，並且主基因的遺傳率較高，為與耐鹽性相關聯的遺傳標記的研究及相關基因的克隆奠定了基礎。
圖1 葉片枯黃率(％ )次數分布圖(橫坐標為葉片枯黃率(％ )，縱坐標為分布次數)
四、具體實施方案(1)結縷草屬植物耐鹽種源材料Z105(Z. japonica)和敏鹽種源材料Z061 (Ζ. japonica)(均為公知公用品種，見參考文獻李亞，耿蕾，劉建秀.中國結縷草屬植物抗鹽性評價.草地學報，2004，12(1) :8-11,16.)的雜交育種及雜種真實性鑑定根據李亞等(李亞，耿蕾，劉建秀.中國結縷草屬植物抗鹽性評價.草地學報， 2004，12(1) :8-11,16.)對36份結縷草屬植物種源材料的耐鹽性鑑定結果，2006年以耐鹽材料Z105為母本(耐鹽係數為0. 72)，敏鹽材料Z061為父本(耐鹽係數為0. 14)進行雜交育種，共獲得了 164個雜交後代。用SRAP分子標記的7對引物及其對應的8個特異性片段:Me4Em8-130b 和 150bp, MelEm2_150bp，Me2Em4_220bp，Me4Em9_190bp，Mel6Eml_350bp，Mel2Em3-360bp, Me2Em8_380bp (SRAP標記編號及序列同文獻陳宣，郭海林，薛丹丹，鄭軼琦，劉建秀.結縷草屬植物耐鹽性SRAP分子標記研究.草業學報，2009，18 O) :66-75.)進行F1單株的雜種真實性鑑定，具有上述任一引物的父本特異性條帶的F1單株鑑定為真雜種，其餘F1單株為假雜種，結果132個後代單株被鑑定為真雜種(表1)。其中SRAP分子標記雜種鑑定的反應體系、反應程序及鑑定過程如下SRAP-PCR採用10 μ L的反應體系，其中包括50ng模板DNA，10XPCR緩衝液， Mg2+L 5mmol · Λ dNTPs 200 μ mol ·廠1，弓丨物 0. 2 μ mol · Λ Taq DNA 聚合酶 0. 5U。SRAP-PCR 擴增程序94°C 預變性 ^iin ；94°C變性 lmin，37°C 退火 lmin，72°C 延伸 10sec，5個循環；94°C變性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸10sec，;35個循環；循環結束後 72°C延伸7min，4°C保存。擴增反應在英國TECHNE公司的TC-412型PCR儀上進行。擴增產物通過10%的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳進行檢測。雜種鑑定過程首先用引物Me4Em8對雜交後代進行鑑定，結果具有父本特異性條帶Me4Em8-130bp和Me4Em8_150bp的84個後代被鑑定為真雜種，再用MelEm2對剩下的後代進行鑑定，結果具有父本特異性條帶MelEm2-150bp的18個後代也被鑑定為真雜種，然後依次用Me2Em4，Me4Em9, Mel6Eml, Mel2Em3, Me2Em8對前一對引物鑑定後剩下的後代進行鑑定，結果通過這5對引物的特異性條帶Me2Em4-220bp，Me4Em9_190bp，Mel6Eml-350bp, Mel2Em3-360bp, Me2Em8_380bp分別將剩下的10個、8個、2個、1個和9個，共30個後代鑑定為真雜種，其餘則為假雜種；表1雜種真實性鑑定引物的特異性片段及鑑定的真雜種數量
權利要求
1.結縷草Willd.)植物耐鹽性遺傳模型的鑑定方法，其特徵在於，(1)以強耐鹽結縷草種源材料Z105為母本和敏鹽結縷草種源材料Z061為父本進行雜交，獲得F1群體；(2)通過相關序列擴增多態性SRAP分子標記技術，用父本具有特異性條帶的7對引物的8個特異性片段對F1進行雜種真實性鑑定，7對引物及其對應的8個特異性片段為 Me4Em8-130b 禾口 150bp， MelEm2_150bp， Me2Em4_220bp， Me4Em9_190bp， Mel6Eml-350bp, Mel2Em3-360bp，Me2Em8-380bp，具有上述任一引物的父本特異性條帶的F1單株鑑定為真雜種，其餘F1單株為假雜種；(3)以(2)中鑑定的F1單株真雜種為材料，通過水培法對F1群體的耐鹽性進行鑑定，得到以葉片枯黃率數據為鑑定指標的耐鹽性鑑定結果；(4)對&群體耐鹽性鑑定結果葉片枯黃率數據，應用EXCEL2003對F1群體的次數分布進行分析，得到F1群體的耐鹽性呈混合正態分布，符合「參考文獻蓋鈞鎰，章元明，王建康.植物數量性狀遺傳體系.北京科學出版社，2003. P70」所述主基因+多基因的遺傳特徵；(5)參考文獻王建康，蓋鈞鎰.利用雜種F2世代鑑定數量性狀主基因一多基因混合遺傳模型並估計其遺傳效應.遺傳學報，1997，M (5) :432、40所述植物數量性狀主基因+ 多基因混合遺傳模型分析中的「單個分離世代F2群體的數量性狀分離分析」方法，將F1群體的葉片枯黃率測定數據，當作模型中的F2群體的數據代入模型進行分析，得到結縷草屬植物耐鹽性的遺傳模型。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，水培法採用在溫室用1/2的Hoagland營養液對材料進行通氣培養，鹽處理濃度為20g/L，該濃度維持1個月後統計鹽脅迫下不同材料的葉片枯黃率，以進行耐鹽性評價。
全文摘要
本發明涉及結縷草屬植物耐鹽性遺傳模型的鑑定方法，屬於遺傳學研究領域。本發明發現結縷草屬植物耐鹽性的最適遺傳模型為「一對主基因的加性模型」，主基因遺傳率為66.83%。該方法以極端耐鹽和敏鹽的材料雜交，獲得F1分離群體，對F1單株進行雜種鑑定和耐鹽性鑑定，然後對F1群體耐鹽性作次數分布分析，在此基礎上，利用「單個分離世代F2群體的數量性狀分離分析」方法，將F1群體的耐鹽性測定數據，當作模型中的F2群體的數據進行遺傳模型及其遺傳參數分析。本發明一方面解決了結縷草屬植物耐鹽育種過程中缺乏耐鹽性遺傳背景知識的問題，另一方面為結縷草屬植物以及其它常異交植物耐鹽性遺傳模型的研究提供了一條新的思路。
文檔編號A01H1/02GK102492770SQ20111038070
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者丁萬文, 劉建秀, 郭海林, 陳宣, 陳靜波 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所