同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法
2023-07-14 11:32:01 1
同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法，其特徵是，包括如下步驟：將小鼠麻醉處死後，U型剖開腹腔，經門靜脈，以膠原酶、蛋白酶灌注，肝臟變軟後剝離肝包膜製成細胞懸液，Nycodenze梯度離心分離；吸取細胞層，加入大鼠抗小鼠THY1抗體，該抗體為0.2-0.25μg/L×106細胞終濃度，4℃孵育25-30min；用PBS?buffer洗滌細胞一次，並將細胞濃度定為1-2×106個/ml，然後加入山羊抗大鼠IgG?Dynabeads免疫磁珠，混勻後置2-8℃孵育15-20min；將分離柱安裝入磁場中1-2min分離出成纖維母細胞；吸取上清混懸後分離出肝星狀細胞。
【專利說明】同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於小型動物肝纖維化研究時肝星狀細胞和成纖維母細胞的同時分離方法。
【背景技術】
[0002]肝纖維化是多種慢性肝病病情發展的共同病理基礎，是臨床肝硬化發展的必經中間環節。近年來研究認為肝纖維化經有效治療，仍有逆轉可能。目前認為肝星狀細胞的激活及表型轉化在肝纖維化過程中起關鍵作用，是肝纖維化發生的中心環節，是肝纖維化病理形成的細胞學基礎。在正常情況下，肝星狀細胞處於「靜止狀態」，受炎性細胞因子等病理因素刺激後活化，激活的肝星狀細胞轉分化為成纖維母細胞，成纖維母細胞的活化不僅表現為數量及表型的改變，更重要的是生物學功能發生很大變化，開始分泌大量的膠原，轉變為肝纖維化甚至肝硬化。研究區別兩種細胞間的差異、特性，進而阻斷肝星狀細胞向成纖維母細胞轉化，成為針對性研究防治肝纖維化的靶標。如何高純度、便捷的分離肝星狀細胞和成纖維母細胞成為研究的難點。
【發明內容】
[0003]針對現有技術的上述不足，根據本發明的實施例，希望提供一種高效、便捷的同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法，既保證了細胞的高純度，也能保障細胞的活力，為下一步研究提供了聞質量的細胞。
[0004]根據實施例，本發明提供的一種同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法，其創新點在於，包括如下步驟:
[0005]將小鼠麻醉處死後，U型剖開腹腔，經門靜脈，以膠原酶、蛋白酶灌注，肝臟變軟後剝離肝包膜製成細胞懸液，Nycod`enze梯度離心分離；
[0006]吸取細胞層，加入大鼠抗小鼠THYl抗體，該抗體為0.2-0.25 μ g/L X IO6細胞終濃度，4°C孵育25-30min;用PBS buffer洗滌細胞一次，並將細胞濃度定為1-2X IO6個/ml，然後加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混勻後置2-8°C孵育15_20min ;將分離柱安裝入磁場中l_2min分離成纖維母細胞；吸取上清混懸後分離出肝星狀細胞。
[0007]根據一個實施例，本發明前述同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法中，分離出纖維母細胞和肝星狀細胞後，加入適量含10%胎牛血清的DMEM，細胞懸液按1-2 X IO5個/ml細胞接種至12孔細胞培養板上，370C，5%C02培養箱中培養。
[0008]相對於現有技術，本發明用於小動物，同時分離肝星狀細胞中和成纖維母細胞的方法，Nycodenze梯度離心分離後的細胞懸液,進一步和包被THYl抗體的磁珠混合,在磁場中分離出成纖維母細胞，上清液洗滌後分離肝星狀細胞。本發明方法具有高效高純度分離兩種細胞的特點，節省研究經費和時間，具有良好的推廣應用價值。本發明具有如下優點:(I)從同一個體同時分離兩種細胞，減少了細胞個體差異的影響，更接近體內細胞間的相互作用；(2)同時分離兩種細胞，節約研究經費和時間；(3)操作簡便，高效高純度的分離細胞，能夠用於研究細胞間表型轉化，肝纖維化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為螢光顯微鏡觀察到的細胞形態圖(HSC分離培養Id)。
[0010]圖2為螢光顯微鏡觀察到的細胞形態圖(HSC分離培養6d)。
[0011]圖3為螢光顯微鏡觀察到的細胞形態圖(成纖維母細胞Id)。
[0012]圖4為螢光顯微鏡觀察到的細胞形態圖(成纖維母細胞培養6d，DAPI染色)。
[0013]圖5為螢光顯微鏡觀察到的細胞形態圖(肝星狀細胞a -SMA染色)。
[0014]圖6為螢光顯微鏡觀察到的細胞形態圖(成纖維母細胞THYl染色)。
【具體實施方式】
[0015]下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用於說明本發明而不用於限制本發明的保護範圍。在閱讀了本發明記載的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限定的範圍。
[0016]一、主要試劑:
[0017]EGTA、I型膠原酶、DNase 1、鏈酶蛋白酶E、Nycodenz均購自美國Sigma公司，胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司，免疫磁珠購自美國Invitrogen公司，大鼠抗小鼠a -SM, THYl單克隆抗體購自美國eBioscience公司，SABC免疫組織化學染色試劑盒、 DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司。其餘試劑為國產分析純產品。
[0018]二、主要儀器:`
[0019]螢光顯微鏡、超速離心機、倒置顯微鏡、C02培養箱、電子天平、水浴鍋、恆流泵、磁力加熱攪拌器。
[0020]三、主要灌流液:
[0021]HBSS 液:NaC18.0g/L, KC10.4g/L, KH2P040.06g/L, Na2HP04 ? 12H200.1344g/L, NaHCO30.35g/L。用雙蒸水配置後，調整pH=7.4分裝於潔淨的250ml玻璃瓶中，過濾滅菌後低溫保存。
[0022]DNase I溶液:DNase I 25mg,加0.9%生理鹽水2.5ml,過濾除菌，_20°C保存。懸浮緩衝液:HBSS 液 100ml, DNase I (10mg/ml) 0.08ml。
[0023]8%Nycodenz 溶液:Nyxodenz7.75g 加入 23ml 左右 HBSS 最終 27ml, 0.22um 濾器過
濾除菌。
[0024]酶灌流液及消化液:DNA酶I (10mg/ml) 0.275ml，鏈酶蛋白酶E150mg。補充 HBSS220ml，取140ml加入膠原酶I 75mg，作為酶灌注液；剩下的80ml加入80mg牛血清白蛋白，作為消化液，酶灌流液及消化液過濾除菌。
[0025]四、主要操作步驟:
[0026]試驗例I
[0027]小鼠麻醉後，U型剖開腹腔，經門靜脈，以膠原酶、蛋白酶灌注，肝臟變軟後剝離肝包膜製成細胞懸液，Nycodenze梯度離心分離。吸取細胞層，加入加入大鼠抗小鼠THYl抗體(0.25 u g/LX IO6細胞終濃度)，4°C孵育30min ;用PBS buffer洗滌細胞一次，並將細胞濃度定為I X IO6個/ml然後加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混勻後置2_8°C孵育20min ;將分離柱安裝入磁場中2min分離成纖維母細胞；吸取上清混懸後分離出肝星狀細胞。加適量含10%胎牛血清的DMEM，細胞懸液按2X IO5個/ml細胞接種至12孔細胞培養板上，37 0C，5%C02培養箱中培養。
[0028]試驗例2
[0029]小鼠麻醉後，U型剖開腹腔，經門靜脈，以膠原酶、蛋白酶灌注，肝臟變軟後剝離肝包膜製成細胞懸液，Nycodenze梯度離心分離。吸取細胞層，加入加入大鼠抗小鼠THYl抗體(0.2 u g/LX IO6細胞終濃度)，4°C孵育25min ;用PBS buffer洗滌細胞一次，並將細胞濃度定為2X IO6個/ml然後加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混勻後置2_8°C孵育15-20min ;將分離柱安裝入磁場中Imin分離成纖維母細胞；吸取上清混懸後分離出肝星狀細胞。加適量含10%胎牛血清的DMEM，細胞懸液按I X IO5個/ml細胞接種至12孔細胞培養板上，37 0C，5%C02培養箱中培養。
[0030]五、試驗結果:
[0031]細胞形態觀察:實施例1和實施例2剛分離的HSC均為折光性很強的小圓細胞，形態均一；體外培養Id後HSC大多貼壁生長，光鏡下可見脂肪顆粒(如圖1所示);體外培養6d 後，脂滴消失胞漿開始伸展，胞體變得伸展(如圖2所示)。實施例1和實施例2剛分離的成纖維母細胞為多邊形(如圖3所示)，培養6d後伸展成為梭形(如圖4所示)。
[0032]六、成纖維母細胞及肝星狀細胞的鑑定:
[0033]a -SM,THYl細胞免疫螢光方法檢測實施例1和實施例2分離出的肝星狀細胞及成纖維母細胞。4°C預冷PBS緩衝液洗細胞爬片2minX2次，4%多聚甲醛室溫固定15min， PBS緩衝液洗5minX2次；含0.03%Triton_X100的PBS室溫孵育30min，室溫PBS緩衝液洗5minX3次；3%羊血清室溫下孵育Ih封閉非特異性抗原；封閉液稀釋的一抗(a -SMA，I: 100 ；THY1,1: 200) 4°C孵育過夜；室溫PBS緩衝液洗5min X 3次，PBS稀釋相對應的螢光二抗(I: 100)避光室溫孵育20min ;室溫PBS緩衝液洗5minX 3次，DAPI復染細胞核，螢光顯微鏡下觀察(如圖5-6所示)。
【權利要求】
1.一種同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法，其特徵是，包括如下步驟: 將小鼠麻醉處死後，U型剖開腹腔，經門靜脈，以膠原酶、蛋白酶灌注，肝臟變軟後剝離肝包膜製成細胞懸液，Nycodenze梯度離心分離； 吸取細胞層，加入大鼠抗小鼠THYl抗體，該抗體為0.2-0.25 μ g/LX IO6細胞終濃度，4°C孵育25-30min;用PBS buffer洗滌細胞一次，並將細胞濃度定為1-2X IO6個/ml，然後加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混勻後置2-8°C孵育15_20min ;將分離柱安裝入磁場中l_2min分離出成纖維母細胞；吸取上清混懸後分離出肝星狀細胞。
2.根據權利要求1所述的同時分離肝星狀細胞及成纖維母細胞的方法，其特徵是，分離出成纖維母細胞和肝星狀細胞後，加入適量含10%胎牛血清的DMEM，細胞懸液按1-2 X IO5個/ml細胞接種至12孔細胞培養板上，37°C，5%C02培養箱中培養。
【文檔編號】C12N5/071GK103555656SQ201310507049
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】孫姍姍, 周時高, 何頌華, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:上海中醫藥大學附屬龍華醫院