測定水樣及水產品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量的酶聯免疫吸附分析方法
2023-07-23 12:08:31
專利名稱：測定水樣及水產品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量的酶聯免疫吸附分析方法
技術領域：
本發明涉及一種測定水樣及水產品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量的酶聯免疫吸 附分析方法(ELISA)，屬於食品安全監督或食品分析的研究領域。
二.
背景技術：
孔雀石綠(Malachite Green, MG)又名鹼性綠、鹽基塊綠、孔雀綠和中國綠，為帶 有金屬光澤的綠色結晶體，化學名稱四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式為C23H25N2CI， 分子量為364.92，易溶於水、甲醇和乙醇，溶液呈藍綠色。孔雀石綠是一種人工合成的 三苯基甲垸類工業染料，主要用於制陶、紡織、皮革和食品等產業上的顏色劑和細胞化 學上的染色劑等。孔雀右綠具有抗菌、殺蟲等功效，是藥用染料中抗菌效力較強的一類, 被廣泛用作驅蟲劑和殺菌劑，以殺滅水產動物體外的寄生蟲，原生動物和魚卵中的黴菌 等。孔雀石綠對防治水黴病等有特效，在水產養殖中曾大量使用。孔雀石綠在生物體內 會很快轉化為無色孔雀石綠(LeucomalachiteGreen， LMG)。無色孔雀石綠是孔雀石綠在 生物體內的主要代謝物和主要存在形式。孔雀石綠及無色孔雀石綠在環境水體和水生物 體內均可存留較長時間。
近年來國內外研究表明孔雀石綠為潛在的致癌、致畸、致突變物質，而其代謝物無 色孔雀石綠被確證具有高毒、高殘留和三致作用，因此，孔雀石綠的使用汙染水環境， 其代謝物無色孔雀石綠對水生物及人體健康造成極大危害。美國、加拿大、日本、歐盟 等許多國家都將孔雀石綠列為水產養殖禁用藥物。歐盟規定水產品中孔雀石綠和無色孔 雀石綠總量不得超過2pg/kg。我國於2002年5月也將孔雀石綠列入《食品動物禁用的 獸藥及其化合物清單》中。
測定孔雀石綠和無色孔雀石綠的主要方法是色譜分析方法，包括氣相色譜(GC)、高 效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)等。HPLC-紫外可見檢測器(UV) 為最常用的檢測方法。孔雀石綠的最大吸收波長為618nm，利用HPLC-UV檢測，背景 幹擾小，測量結果準確。無色孔雀石綠在可見區無吸收，利用HPLC-UV檢測，背景幹 擾嚴重，難以獲取精確的結果，故常利用氧化劑如二氧化鉛或2,3-二氯-5，6-氰基-1,4
4-苯醌將無色孔雀石綠氧化為孔雀石綠後進行檢測。無色孔雀石綠也可利用高效液相色 譜-螢光檢測法檢測。色譜分析方法雖然靈敏度較高、準確性較好，但是色譜法儀器昂 貴、樣品預處理複雜、費時、檢測成本高，不適用於大量樣品的篩選。
酶聯免疫吸附分析法(ELISA)具有靈敏度高、特異性強、分析快速的優點，己廣 泛用於臨床、藥物、食品和環境等分析領域。到目前為止，僅有一篇用ELISA測定孔雀 石綠和無色孔雀石綠的文獻報導(Yang, et al. / /I^r/c. /^odC力棚.2007. 55, 8851-8856)， 但抗體的交叉反應小，孔雀石綠或無色孔雀石綠只能由相應的抗體所建立的ELISA測定。 最近，測定孔雀石綠或無色孔雀石綠總量的ELISA試劑盒也已上市(Bioscientific Com),但此試劑盒價格昂貴，且需要一個額外的樣品處理步驟，即在測定前須將無色孔 雀石綠氧化成孔雀石綠。 三.
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種測定水樣及水產品中孔雀石綠和 無色孔雀石綠總量的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)，其特點是利用抗無色孔雀石綠 抗體與孔雀石綠的髙交叉反應率，同時測定孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留總量，而無需 氧化步驟。
本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外，均為重量份數。
測定水樣及水產品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量的酶聯免疫吸附分析法
(1) 無色孔雀石綠衍生物的製備
取5.5 7.5g對硝基苯甲醛溶於14 18gN，N-二甲基苯胺中，加入4.8 6.8g ZnCl2，於 溫度80~100°(:攪拌反應直至綠色溶液形成固體，冷卻至室溫，固體溶於丙酮，同時過濾 除去ZnCl2顆粒，粗產品過柱純化、乾燥，得硝基無色孔雀石綠黃色粉末，取0.17 (U7g 硝基無色孔雀石綠溶於6 10mL甲醇中，以5%鈀碳為催化劑，加入反應釜中，通入氫氣， 於溫度100 120'C反應1 5小時，過濾反應物，收集濾液，用旋轉蒸發儀旋幹溶液，粗 產品用體積比為95:5的甲醇:苯混合液重結晶，得到氨基無色孔雀石綠白色粉末；
(2) 免疫原及包被抗原的製備
取30~40mg純化的氨基無色孔雀石綠溶於0.6mL水中，緩慢滴加濃度為15mg/mL 的NaN02溶液0.33mL，用鹽酸調節混合液的pH值至1.5,在暗處、溫度4"C反應過夜， 取少量上述溶液，滴加到N， N-二甲基苯胺中，溶液顏色由無色變為淡黃色，表明重氮 化反應完成；將10.5 mg氨基磺酸胺溶於0.21 mL純水中，緩慢滴加到重氮鹽溶液中，終止反應；
稱取牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)各100 mg，分別溶於1.5mL濃度為 0.01mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩衝溶液中;將重氮化溶液緩慢滴加至上述蛋白質溶液中， 用NaOH溶液調節pH值為7.5，攪拌下於溫度4'C反應過夜；將混合物離心，取上清， 裝入透析袋中，透析數天，獲得兩種無色孔雀石綠-蛋白質溶液，冷凍乾燥，在溫度-20'C 保存待用；無色孔雀石綠-牛血清白蛋白(LMG-BSA)和無色孔雀石綠-卵清蛋白 (LMG-OVA)分別用作免疫原及包被抗原；
(3) 無色孔雀石綠多克隆抗體的製備
用免疫原免疫兩隻紐西蘭大白兔，將l~4mg免疫原溶於0.5~4mL的生理鹽水中， 加入0.5~3mL完全福氏佐劑，混合成油包水的乳濁液，每隻兔子每次吸取0.5~2.0mL 乳濁液，多點皮下注射入兔子背部，1~5周後，對兔進行第二次免疫，使用不完全福氏 佐劑，其餘與第一次免疫相同，第二次免疫後，2 5周進行下一次免疫，並且第三次、 第四次免疫後，5 7天抽取0.1 0.5mL耳血，檢測抗體產生的情況，第五次免疫後，5~15 天處死兔子，取全血，將血液在冰箱中放置過夜，吸取上層清液，分裝，於低溫冰箱中 儲存，即得兔抗無色孔雀石綠多克隆抗體；
(4) 建立測定無色孔雀石綠含量的酶聯免疫吸附分析方法
對所得抗體性能進行表徵，在最優試驗條件下，建立測定無色孔雀石綠的ELISA; 本發明的優點
1. 製備出抗無色孔雀石綠多克隆抗體，且所製備出的抗體與孔雀石綠的交叉反應率 為95.25%，以此抗體為基礎建立了測定水樣及水產品中孔雀石綠和無色孔雀石 綠總量的酶聯免疫吸附分析方法。
2. 靈敏度高，與已報導的最靈敏的ELISA結果相近。
3. 樣品處理簡單、測試量大、測試費用低。
4. 對樣品的測定，ELISA與HPLC有很好的相關性。 四
圖1.無色孔雀石綠(LMG)、牛血清白蛋白(BSA)和無色孔雀石綠-牛血清白蛋白 (LMG-BSA)交聯物的紫外-可見光譜圖 LMG和BSA分別在260 nm和280 nm處有特徵吸收峰，LMG-BSA在367nm出 現一峰，為LMG與BSA交聯所形成的更大的共軛體系的特徵峰，表明無色孔雀石綠 已成功與蛋白交聯。
6無色孔雀石綠(LMG)、卵清蛋白(OVA)和無色孔雀石綠-卵清蛋白(LMG-OVA) 交聯物的紫外-可見光譜圖與圖1相似 圖2. ELISA測定無色孔雀石綠的平均標準曲線(『9)。
無色孔雀石綠標準溶液濃度範圍為0.1 100ng/mL,靈敏度IC5o值在0.9-2.6ng/mL，最 低檢出線(S/N-3)為0.02-0.10 ng/mL。包被抗原LMG-OVA, 1:9,000 (即110 ng/well);抗 體，1:3,000;羊抗兔lgG-辣根過氧化物酶(GaRIgG-HRP), 1:5,000; 圖3.ELISA和HPLC對7個加標樣品中無色孔雀石綠的檢測結果的相關曲線
以HPLC為橫坐標，ELISA為縱坐標作圖，得相關曲線，回歸方程為 Y=1.0305X-0.7307，相關係數為0.975, n=7，說明二者的相關性很好 五具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進行具體的描述,有必要在此指出的是本實施只用於對發 明進行進一步說明，但不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術熟練人員可 以根據上述發明的內容作出一些非本質的改進和調整。
實施例
1. 無色孔雀石綠衍生物的製備
取5.5 7.5g對硝基苯甲醛溶於14^8gN,N-二甲基苯胺中，加入4.8 6.8g ZnCl2,於 溫度80 100'C攪拌反應直至綠色溶液形成固體，冷卻至室溫，固體溶於丙酮，同時過濾 除去ZnCl2顆粒，粗產品過柱純化、乾燥，得硝基無色孔雀石綠黃色粉末，取0.17 0,27g 硝基無色孔雀石綠溶於6 10mL甲醇中，以5%鈀碳為催化劑，加入反應釜中，通入氫氣， 於溫度100 120'C反應1 5小時，過濾反應物，收集濾液，用旋轉蒸發儀旋幹溶液，粗 產品用體積比為95:5的甲醇:苯混合液重結晶，得到氨基無色孔雀石綠白色粉末；
2. 免疫原和包被抗原的製備
取30 40mg純化的氨基無色孔雀石綠溶於0.6mL水中，緩慢滴加濃度為15mg/mL 的NaN02溶液0.33mL，用鹽酸調節混合液的pH值至1.5，在暗處、溫度4'C反應過夜， 取少量上述溶液，滴加到N, N-二甲基苯胺中，溶液顏色由無色變為淡黃色，表明重氮 化反應完成；將10.5 mg氨基磺酸胺溶於0.21 mL純水中，緩慢滴加到重氮鹽溶液中， 終止反應；
稱取牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)各100 mg,分別溶於1.5mL濃度為 0.01mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩衝溶液中；將重氮化溶液緩慢滴加至上述蛋白質溶液中， 用NaOH溶液調節pH值為7.5，攪拌下於溫度4'C反應過夜；將混合物離心，取上清，裝入透析袋中，透析數天，獲得兩種無色孔雀石綠-蛋白質溶液，冷凍千燥，在溫度-20'C 保存待用；無色孔雀石綠-牛血清白蛋白(LMG-BSA)和無色孔雀石綠-卵清蛋白 (LMG-OVA)分別用作免疫原及包被抗原；
LMG、 BSA和LMG-BSA交聯物的紫夕卜可見光譜圖如圖1所示，LMG、 OVA和 LMG-OVA交聯物的紫外-可見光譜圖與圖1相似。 3.無色孔雀石綠多克隆抗體的製備 用免疫原免疫兩隻紐西蘭大白兔，將14mg免疫原溶於0.5 4mL的生理鹽水中， 加入0.5~3mL完全福氏佐劑，混合成油包水的乳濁液，每隻兔子每次吸取0.5~2.0mL 乳濁液，多點皮下注射入兔子背部，1~5周後，對兔進行第二次免疫，使用不完全福氏 佐劑，其餘與第一次免疫相同，第二次免疫後，2 5周進行下一次免疫，並且第三次、 第四次免疫後，5 7天抽取0.1 0.5mL耳血，檢測抗體產生的情況，第五次免疫後，5~15 天處死兔子，取全血，將血液在冰箱中放置過夜，吸取上層清液，分裝，於低溫冰箱中 儲存，即得兔抗無色孔雀石綠多克隆抗體；
4.優化實驗條件，建立測定無色孔雀石綠的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA) 對所得抗體性能進行表徵，在最優試驗條件下,建立測定無色孔雀石綠的ELISA; (1)溶液配製
(a) 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液
稱取2.606g Na2CO3'10H2O,3.434g NaHC03,用800mL超純水混勻溶解後，調 節pH值，加水至1L，配成0.05mol/L, pH=9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液；
(b) 磷酸緩衝液(儲備液，PBSxlO)
稱取21.961gNa2HP04.12H20， 6.031gNaH2PO4.2H2O， 87.666gNaCl，加800 mL 超純水混合，加熱溶解；用1 mol/L的NaOH調節pH=7.5,加超純水至1 L， 配成含0.15mol/LNaCl， pH=7.5的0.1 mol/L磷酸緩衝液(儲備液)；
(c) 酪蛋白溶液
稱取酪蛋白加熱溶解於0.01 mol/L的PBS中，配成1.0%酪蛋白溶液；
(d) 磷酸緩衝液-吐溫儲備液(含l%Tween20的0.1 moi/L磷酸緩衝儲備液， PBSTxlO， pH=7.5);
(e) 無色孔雀石綠標準溶液的配製(1 mg/mL) 2mgLMG溶解於2mL甲醇；
(f) LMG-OVA和LMG-BSA交聯物的配製(1 mg/mL)用微量天平稱LMG-OV或LMG-BSA交聯物2 mg，加入2 mL碳酸鈉-碳酸氫 鈉緩衝液溶解；
(g) 底物溶液(20 mL純水；1 mL醋酸鈉緩衝液；200 nL四甲基聯苯胺(TMB) (1%) ; 20^L過氧化氫(5%)); (!)醋酸鈉緩衝液
稱取3.450g CH3COONa'3H20,用100mL超純水溶解，再用lmol/L擰檬酸 (21.031gC6HsOrH20溶解於100mL水中)調節pH-5.8後，再用水定容到 250 mL,配成0.1 mol/L醋酸鈉緩衝液；
(2) TMB:稱取0.0717gTMB，用7,17 mL 二甲基亞碸溶解，混勻，配成1%， w/v;
(3) 過氧化氫取2030%的過氧化氫加入100超純水中，混勻，配成5%; (h)H2S04溶液移取25 mL濃H2S04，溶解於475 mL的超純水中，配成5% H2S04溶液。
(2) 主要儀器
洗板機A5082, Tecan， Austria;酶標儀A2082, Tecan, Austria;高效液 相色譜儀Agilent,帶螢光檢測器
(3) 間接競爭ELISA步驟
(a) 用包被抗原包板，每孔200^L， 4'C過夜；
(b) PBST緩衝液(PBST儲備液1: 10稀釋)，每孔280pL，洗滌三次
(c) 加入酪蛋白溶液封阻，每孔280pL，室溫放置l小時；
(d) PBST緩衝液洗板三次；
(e) 依次每孔加入100 nL的標準溶液和100 pL的一定稀釋度的多克隆抗體，室溫 放置1小時；
(f) PBST緩衝液洗板三次；
(g) 加入酶標二抗(羊抗兔lgG-辣根過氧化物酶，GaRIgG-HRP)，每孔200 pL， 室溫放置1小時；
(h) PBST緩衝液洗板三次；
(i) 加入底物液顯色，每孔200pL，振搖15 20分鐘； (j)加入5% H2S04溶液，每孔80 nL,終止反應；
(k)用酶標儀測定吸光度值，做出標準曲線，進行結果分析與討論。
(4) ELISA實驗條件的優化本發明對包被抗原的濃度、抗體的稀釋度、酶標二抗的稀釋度，樣品稀釋液等 作了優化，優化結果為包被抗原110ng/well，抗體的稀釋度為l: 3000，酶標二抗 的稀釋度為l: 5000,實驗溫度在室溫下進行。 (5) ELISA的靈敏度及穩定性
無色孔雀石綠標準溶液的濃度為0， 0.1， 0.3， 1， 3， 10, 30, 100 ng/mL， 由無色孔雀石綠的儲備液1.0 mg/mL經過0.01X酪蛋白溶液稀釋而得。以無色孔雀 石綠濃度的對數為橫坐標，以相對信號B/BXlOOy。為縱坐標做標準曲線(BQ:無色 孔雀石綠濃度為0 ng/mL所對應的吸光度值；B:其他各濃度對應的吸光度值)。 圖2為ELISA測定無色孔雀石綠的平均標準曲線(n-9), IC5。值為0.9-2.6 ng/mL; (6) ELISA的特異性
ELISA特異性可用交叉反應率來表示。交叉反應率(CR%)=(無色孔雀石綠 'ICso/測試物質的IC幼)xiOO%。交叉反應率越小，ELISA的特異性越高。
本發明選擇3種結構相近的三苯基甲垸類工業染料孔雀石綠、結晶紫、無色結 晶紫及其它8種常見抗生素進行交叉反應實驗，交叉反應物及交叉反應實驗如表1 所示。所製得的抗無色孔雀石綠抗體與孔雀石綠，結晶紫，無色結晶紫的交叉反應 率分別為95.25%, 29.07%和212.38%,與其他8種常見抗生素藥物幾乎沒有交叉反 應。
無色結晶紫與無色孔雀石綠的結構極為相似，故抗體與無色結晶紫的交叉反應 率最大(212.38%),但與文獻報導值相近(200%)。
所製備出的抗體與孔雀石綠的交叉反應率分別為95.25%，因此以此抗體為基礎 建立的酶聯免疫吸附分析方法可以測定孔雀石綠和無色孔雀石綠的總量。 5.ELISA對加標樣品中無色孔雀石綠含量的測定 選擇了4種樣品自來水，食用魚養殖水樣，魚樣I,魚樣II進行加標實驗。不同加 標樣品萃取方法不同，(l)水樣自來水不需任何預處理，食用魚養殖水樣用0.45 um的 濾膜過濾。取水樣lml，加入LMG儲備液，使水樣LMG加標濃度分別為1， 2， 5ng/ml; (2):魚樣稱取1.0g魚樣品於10ml離心管中，加入LMG儲備液，使魚樣LMG中加標濃 度為20， 50， 100pg/g，樣品室溫下放置30min，加入3ml乙腈，渦旋混勻5min，超聲波 振蕩提取15min， 4000r/min離心10min，上清液轉至25ml梨型瓶中，重複上述步驟， 合併兩次萃取液，將收集液在35'C下減壓旋轉蒸發至體積約2 3mL，移取樣品溶液加至 已活化的中性氧化鋁柱上，4mL乙腈洗漆中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45'C旋轉蒸發至幹，用1.00mL 0.01%酪蛋白溶液溶解後待測。無色孔雀石綠加標回收率在 76.2-95.0%之間，相對標準偏差為2.7-13.1%，說明方法準確性和精密度都比較好；
6. ELISA和HPLC的比較
無色孔雀石綠的HPLC條件為Agilent高效液相色譜儀，配備螢光檢測器，柱溫 35°C，流動相為體積比80:20的乙腈:0.125mol/LHAc/NH4Ac,pH4.5的混合液，流速為 1.3mL/min，進樣50 jiL,螢光激發波長265nm，螢光發射波長360nm，無色孔雀石綠 標準溶液進樣量分別為1.0， 5.0, 10.0, 15.0， 20.0， 25.0 ng，樣品萃取液用0.45 pm的 濾膜過濾後直接測定；
所建立的ELISA的可靠性用HPLC進行進一步驗證，7種加標樣品，即食用魚養 殖水樣，加標濃度5ng/L;魚樣I，加標濃度20ng/kg， 50Mg/kg， 100 pg/kg;魚樣II， 加標濃度20嗎/kg， 50嗎/kg， 100 Mg/kg;加標樣品用上述方法處理並用ELISA和HPLC 測定，測定結果以HPLC為橫坐標，ELISA為縱坐標作圖得兩者的相關曲線，回歸方 程為￥=1.0305乂-0.7307，相關係數為0.975， n=7，說明二者的相關性很好。
7. ELISA測定真實樣品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總含量
以自來水，兩個食用魚養殖水樣，1個觀賞魚養殖水樣及從農貿市場中購得兩種魚 樣，用所建立的ELISA對上述6個樣品進行測定，測定結果如表3所示。結果表明， 在觀賞魚水樣及魚樣I中測得孔雀石綠及無色孔雀石綠殘留總量分別為L84ug/L, 1.38 ug/kg，其它樣品中未測出。表l.交叉反應實驗結果
CompoundIC50(ng/mL)Cross-reactivity (%)
Leucomalachite green Malachite green Leucocrystal violet Crystal violet Pararosaniline Methyl blue Stilboestrol Olaquindox Clenbuterol Chloramphenicol Bright blue Erythromycin2.23a 2.34 1.05 7.67 1394 〉10000 >10000 >10000 >10000 〉10000 〉10000 >10000100 95.25 212.38 29.07 0.16 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0,01 <0.01 <0.01
a在交叉反應實驗中，測得的無色孔雀石綠的IC5G : 2.23ng/mL:ELISA測定真實樣品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量
樣品種類檢出濃度 (ng/ml或ng/g)相對標準偏差 (%)n=3
自來水未檢出-
食用魚養殖水樣I未檢出-
食用魚養殖水樣II未檢出-
觀賞魚水樣1.84±0.2614.1
魚樣I1.38±0.064.3
魚樣II未檢出_
權利要求
1. 測定水樣及水產品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量的酶聯免疫吸附分析方法，其特徵在於該方法包括以下步驟(1)無色孔雀石綠衍生物的製備取5. 5～7.5g對硝基苯甲醛溶於14～18g N，N-二甲基苯胺中，加入4.8～6.8g ZnCl2，於溫度80～100℃攪拌反應直至綠色溶液形成固體，冷卻至室溫，固體溶於丙酮，同時過濾除去ZnCl2顆粒，粗產品過柱純化、乾燥，得硝基無色孔雀石綠黃色粉末，取0.17～0.27g硝基無色孔雀石綠溶於6～10mL甲醇中，以5％鈀碳為催化劑，加入反應釜中，通入氫氣，於溫度100～120℃反應1～5小時，過濾反應物，收集濾液，用旋轉蒸發儀旋幹溶液，粗產品用體積比為95∶5的甲醇∶苯混合液重結晶，得到氨基無色孔雀石綠白色粉末；(2)免疫原及包被抗原的製備取30～40mg純化的氨基無色孔雀石綠溶於0.6mL水中，緩慢滴加濃度為15mg/mL的NaNO2溶液0.33mL，用鹽酸調節混合液的pH值至1.5，在暗處、溫度4℃反應過夜，取少量上述溶液，滴加到N，N-二甲基苯胺中，溶液顏色由無色變為淡黃色，表明重氮化反應完成；將10.5mg氨基磺酸胺溶於0.21mL純水中，緩慢滴加到重氮鹽溶液中，終止反應；稱取牛血清白蛋白和卵清蛋白各100mg，分別溶於1.5mL濃度為0.01mol/L pH
全文摘要
本發明公開了測定水樣及水產品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)，其特點是合成氨基無色孔雀石綠的修飾物並將其與蛋白聯接，製得免疫原及包被抗原，通過免疫動物獲得兔抗無色孔雀石綠的多克隆抗體，ELISA標準曲線的濃度範圍為0.1～100ng/mL，IC50為0.9-2.6ng/mL，加標回收率為76.2-95.0％，ELISA與HPLC的相關係數為0.975，n＝7；由於所制抗體與孔雀石綠的交叉反應率分別為95.25％，故ELISA可以用於測定孔雀石綠和無色孔雀石綠的總量，而無需將任何氧化步驟。
文檔編號G01N33/53GK101482559SQ20091005831
公開日2009年7月15日 申請日期2009年2月12日 優先權日2009年2月12日
發明者李大偉, 紅 楊, 王玉珍, 莉 賀, 鄧安平, 邢瑋瑋 申請人:四川大學