用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球及製法和用途的製作方法

2023-07-23 03:32:36 2

專利名稱：用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球及製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於明膠衍生物材料的製備領域，特別涉及明膠與鈣磷酸鹽和
一種鹿茸多肽生物活性組織或骨形態發生蛋白(BMP)合成出的複合多孔 微球材料，該材料是一種具有良好的生物相容性和誘導成骨活性的骨修復 生物材料。
背景技術：
明膠是膠原降解的產物，它不僅很好地保持了膠原作為生物材料所特 有的一些優點，而且與膠原相比，明膠無抗原性，植入體內無排異反應； 明膠價廉易得；易溶於水；其物理化學性質的檢測手段已經發展得比較成 熟、規範。因此，明膠與鈣磷酸鹽複合物材料也是目前骨修復材料研究中 的一個熱點。
傳統的明膠與鈣磷酸鹽複合物材料大多為顆粒型或形狀不規則的塊 體(B. S. Chang， C. K. Lee， K. S. Hong， et al. Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations. Biomaterials， 2000, 21: 1291 1298.)，這種傳統材料在作為骨修復材 料使用時，會引起患者體內的炎症反應，而且新骨形成的速率較低，成骨 量較少。另外，傳統的明膠與鈣磷酸鹽複合物材料在力學性能及降解速率 方面都存在著嚴重的缺陷，使得該複合物材料在應用於骨修復時仍存在著 許多的問題。
研究表明將明膠和羥基磷灰石(HAP)以某種形式複合成微球形態， 改善了骨修復材料的力學性能和降解速率，利用該種複合微球材料良好的 柔韌性，填充骨缺損造成的各種不同形狀的空穴。最重要的是，以研製球 形形態的骨修復材料，增加了種植體與其周圍骨組織的接觸面積，大大促 進了界面與界面之間的緊密度，能更好地發揮材料的成骨性作用。鹿茸是哺乳類動物唯一可以再生的骨類組織，在藥典記載己有幾千年
歷史。鹿茸中存在著多種己知的生長因子，如胰島素樣生長因子I(IGF-1)、 生長激素(GH)以及與骨生長和骨重建有關的多細胞生長因子TGFP1和 TGF 0 2等，並認為正是這些生長因子的共同存在和綜合效應使鹿茸快速生 長。我們從鮮鹿茸中提取的鹿茸多肽為主要活性成分，與明膠和鈣磷酸鹽 合成為一體的多孔微球，這無論在材料的製備技術上還是材料本身，對骨 修復及治療功效上都是一大提高。 .
清華大學顏永年等應用鈣磷鹽粉體和甲殼素/殼聚糖纖維製成複合物 (專利申請號200410034109.3)，其中也添加了少量膠原(明膠)，及骨 形態蛋白，經細胞和動物實驗證實該材料具有良好的生物活性和誘導成骨 活性。崔福齋等(專利申請號01136246.4)在酸溶膠原液中，通過沉澱 法製備得到膠原/鈣磷酸鹽無定型粉體材料，其成分與天然骨類似。
天津大學(專利申請號200410019979.3)提出一種富含海藻酸鈉和 羥基磷灰石的複合微球的製備方法，該法採用羥基磷灰石粉體與海藻酸鈉 共同加入的方法，通過乳化作用形成粒徑在200um 300um左右複合微球。
本發明通過在明膠乳液中使可溶性鈣鹽與磷鹽共沉澱的方法，製備成 複合多孔微球，反應中添加適量鹿茸多肽或骨形態發生蛋白，製得骨修復 複合材料及該複合材料的製備方法還未見有文獻報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種生物相容性好，含有特定促骨活性物質(如 鹿茸多肽或骨形態發生蛋白)、容易批量製備、形貌可控、價格低廉的用 於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球。
本發明的再一目的是提供用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微 球的製備方法。
本發明的另一目的是提供用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微 球在用於骨修復材料方面的用途。
本發明的用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球是一種在明膠 微球中均勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽或骨形
態發生蛋白；其中，活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白是明膠重量的1°; 5%;形成轉磷酸鹽的可溶性鈣鹽為每克明膠的0.0003 0.03mo1，可 溶性磷酸鹽的量使得Ca元素與P元素的比例為1: 1 2: 1，優選Ca元素 與P元素的比例為1.5:1。
所述的明膠微球中進一步均勻分散有交聯劑，所述的交聯劑的量為在 反應中交聯劑的添加量為每克明膠添加30ul 1000ul的交聯劑，優選是 每克明膠添加500ul的交聯劑，交聯劑的質量濃度為5%。 15%。
所述的用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球的直徑在500nm 500um。
所述的用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球上的孔的直徑在 10nm 20um。
本發明的用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球的製備方法包
括以下步驟
1) 首先稱取一定量的明膠粉體，加入一定量的去離子水，加熱至30
7(TC，製備質量濃度為5% 30%的明膠溶液，然後向明膠溶液中添加可 溶性鈣鹽，其添加量為每克明膠粉體加入O. 0003 0. 03mol的可溶性鈣鹽； 隨後，再加入可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白，鹿茸 多肽或骨形態發生蛋白的添加量均為明膠重量的1%。 5。％;
2) 將步驟1)製得的混合液倒入含有表面活性劑的油中，攪拌形成明 膠溶液的油包水乳化液；表面活性劑在油中的含量是lg/200ml油 lg/20ml油；所用油的量為每克明膠5ml 250ml;
3) 將步驟2)製得的明膠溶液的油包水乳化液加熱，溫度控制在30 。C 7(TC，優選溫度是45。C，並持續攪拌0.5 3小時，優選攪拌1小時， 攪拌速度為100轉/分鐘 6000轉/分鐘；然後加入可溶性磷酸鹽溶液，可 溶性磷酸鹽溶液的質量濃度為5% 15%，磷酸鹽的加入量使混合液中的 Ca元素與P元素的比例控制在1: 1 2: 1，優選Ca元素與P元素的比例 為1.5:1;
4) 將步驟3)製得的混合液在3(TC 7(TC溫度下攪拌1 5小時，繼 續攪拌下，用冰浴冷卻20 80分鐘；形成明膠微球中均勻分散有鈣磷酸 鹽及可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白；
5) 向步驟4)製得的混合液中加入交聯劑，交聯劑的質量濃度為5%。 15%，交聯劑的添加量為每克明膠添加30ul 1000ul的交聯劑，優選是 每克明膠添加500ul的交聯劑，繼續攪拌20分鐘 100分鐘；
6) 取步驟4)或5)製得的混合液，加入丙酮，加入量為混合液中水 份體積的2 8倍，優選是混合液中水份體積的3倍，繼續攪拌0.5 6小 時後，優選繼續攪拌1 2小時後，過濾，得到複合多孔微球的粗品；
7) 將步驟6)得到的複合多孔微球的粗品用丙酮反覆洗滌後，得到用 於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球。
所述的可溶性鈣鹽選自氯化轉、硝酸鈣或醋酸鈣等中的一種或大於一 種的混合物。
所述的可溶性磷酸鹽選自磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉或磷酸氫胺等中的 一種或大於一種的混合物。
所述的表面活性劑是油包水型表面活性劑，包括司班(SPAN)系列(如 SPAN80、 SPAN60、 SPAN20)或琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT)表面活性劑之中 的一種。
所述的油選自矽油、豆油、橄欖油、茶油、菜籽油或調和油中的一種。 所述的交聯劑選自戊二醛、甲醛、雙醛葡萄糖等中的一種或大於一種 的混合物。
本發明製備的用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球，經細胞實 驗和動物實驗都表明該複合多孔微球材料具有良好的生物相容性和誘導 成骨活性，是一種可靠的體內可降解的組織修復及治療材料，能夠作為生 物組織(如骨、軟骨、牙)修復中的材料，具有廣泛的應用價值。
本發明以傳統粉體明膠製得明膠溶液，而後分散在油浴中變為明膠溶 液的油包水乳化液作為反應介質，通過向明膠溶液的油包水乳化液中添加 可溶性的鈣鹽和磷酸鹽，使可溶性鈣鹽和磷酸鹽在明膠微球內部進行沉澱 反應，反應過程中適量添加各種促骨生長活性物質(鹿茸多肽或骨形態發 生蛋白)，最終得到用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球，該複合 多孔微球表面有孔洞，便於細胞的攀附和生長。
本發明在製備出形態較好的複合多孔微球的基礎上又添加活性鹿茸 多肽或骨形態發生蛋白，這對於促進骨髓間質細胞分化，軟骨細胞、表皮細胞及成纖維細胞增殖等作用，具有明顯的加速骨組織再生、周圍神經組 織再生及創傷特別是潰瘍瘡面癒合等功效。該複合多孔微球材料可用於
骨、牙缺損的修復；可作為骨水泥的固相原料；可直接作為骨創手術中的 骨缺損部位的填充物。
具體實施例方式
實施例1.
1、 準確稱取1克明膠粉體放入100ml的燒杯中，加入5ml去離子水，將
其置於5o士rc水浴中攪拌溶解，隨後向燒杯中加入形成鈣磷酸鹽所需的 0.0025mol硝酸鈣固體，而後加入鹿茸多肽3mg，配成混合溶液。
2、 在轉速為500轉/分鐘的攪拌下，將上述溶液緩慢地滴加到50ml溶 1^雙iflHfrr土力'morAi、 ou，丄g/3um丄,tj、j立niKH卞，7r,;j乂"力/jx滑很trjiffl'ti/jv字L 化液，反應溫度保持在45 ± rc，並繼續攪拌2小時，再向乳液體系中
滴加質量濃度為5%的阪2朋04溶液(Ca/P摩爾比為5: 3)。
3、 反應結束後，45 ± rc的反應物迅速移入至冰水浴中，並保持攪拌，
冷卻40分鐘，使得含有鈣磷酸鹽的明膠微球凝膠化，形成明膠微球中均 勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽。
4、 向冷卻後的反應體系中，加入質量濃度為8X的戊二醛交聯劑600ul 進行交聯，攪拌30分鐘，再向體系中加入丙酮30ml，對複合物微球進行 脫水。
5、 反應物停止攪拌，將漿液抽濾、濾餅為複合多孔微球粗品，將其用 30ml丙酮重複洗滌3次，得到的最終產物為淺黃色明膠與f丐磷酸複合多孔 微球的粉末。
該粉末粒徑為25um士5um，表面孔徑為lum士50nm。複合多孔微球粉 末由鈣磷酸鹽、鹿茸多肽和交聯後的明膠組成，該複合多孔微球材料用於 骨、牙缺損的修復；作為骨水泥的固相原料；直接用於骨創手術中的骨缺 損部位的填充物。
實施例2.
1、準確稱取1克明膠粉體放入100ml的燒杯中，加入5ml去離子水，將 其置於5o士rc水浴中攪拌溶解，隨後向燒杯中加入形成鈣磷酸鹽所需的0.003mol氯化韓固體，而後向其中加入20mg鹿茸多肽，配成混合溶液。
2、 在轉速為500轉/分鐘的攪拌下，將上述溶液緩慢地滴加到100ml溶 有表面活性劑(SPAN 60-lg/50ml)的橄欖油相中，形成明膠溶液的油包水 乳化液，反應溫度保持在45 ± 1 °C，並繼續攪拌2小時，再向乳液體系 中滴加質量濃度為10XNa2HP04溶液(Ca/P摩爾比為5: 3)。
3、 反應結束後，45i:士rc的反應物迅速移入至冰水浴中，並保持攪拌，
冷卻40分鐘，使得含有鈣磷酸鹽的明膠微球凝膠化，形成明膠微球中均 勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽。
4、 向冷卻後的反應體系中，加入丙酮30ml，繼續攪拌40分鐘，對複合
物微球進行脫水，
5、 反應物停止攪拌，將漿液抽濾、濾餅為複合多孔微球粗品，將其用 30ml丙酮重複洗滌4次，得到的最終產物白色明膠/磷酸鈣複合多孔微球 的粉末。
該粉末粒徑為25um士5um，表面孔徑為lum土50nm。複合多孔微球粉 末由鈣磷酸鹽、鹿茸多肽和交聯後的明膠組成，該複合多孔微球材料用於 骨、牙缺損的修復；作為骨水泥的固相原料；直接用於骨創手術中的骨缺 損部位的填充物。
1、 準確稱取1克明膠粉體放入100ml的燒杯中，加入5ml去離子水，
將其置於4o士rc水浴中攪拌溶解，隨後向燒杯中加入形成鈣磷酸鹽所需
的0.01mol氯化鈣固體，配成含有一定鈣離子濃度的明膠溶液，而後向其 中加入20mg鹿茸多肽，並將其分散均勻。
2、 在轉速為200轉/分鐘的攪拌下，將上述溶液緩慢地滴加到75ml溶 有表面活性劑(琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT) -lg/50ml)的茶油相中，形成 明膠溶液的油包水乳化液，反應溫度保持在45 ± 1 °C，並繼續攪拌2 小時，再向乳液體系中滴加質量濃度為10XNa2HP04溶液(Ca/P摩爾比為 1.5: 1)。
3、 反應結束後，45 ± rc的反應物迅速移入至冰水浴中，並保持攪拌，
冷卻30分鐘，使得含有鈣磷酸鹽的明膠微球凝膠化，形成明膠微球中均 勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽。4、 向冷卻後的反應體系中，加入質量濃度為4X甲醛600ul交聯，攪拌 20分鐘，再向體系中加入丙酮30ml，對複合物微球進行脫水。
5、 反應物停止攪拌，將漿液抽濾、濾餅為複合多孔微球粗品，將其用 30ml丙酮重複洗滌3次，得到的最終產物為淺黃色明膠/磷酸鈣複合多孔 微球的粉末。
該粉末粒徑為45um士5um，表面孔徑為5um士50nm。複合多孔微球粉 末由鈣磷酸鹽、鹿茸多肽和交聯後的明膠組成，該複合多孔微球材料用於 骨、牙缺損的修復；作為骨水泥的固相原料；直接用於骨創手術中的骨缺 損部位的填充物。
實施例4.
1、 準確稱取1克明膠粉體放入100ml的燒杯中，加入5ml去離子水， 將其置於50 ± 1。C水浴中攪拌溶解，隨後向燒杯中加入形成鈣磷酸鹽所 需的0.004mo1醋酸鈣固體，配成含有一定鈣離子濃度的明膠溶液，而後 向其中加入骨形態發生蛋白3mg，並攪拌均勻。
2、 在轉速為200轉/分鐘的攪拌下，將上述溶液緩慢地滴加到150ml溶 有表面活性劑(SPAN 80-lg/50ml)的調和油相中，形成明膠溶液的油包水 乳化液，反應溫度保持在45 ± 1 'C，並繼續攪拌2小時，再向乳液體系 中滴加質量濃度為5XNaH2P04溶液(Ca/P摩爾比為2: 1)。
3、 反應結束後，45 ± rc的反應物迅速移入至冰水浴中，並保持攪拌，
冷卻50分鐘，使得含有鈣磷酸鹽的明膠微球凝膠化，形成明膠微球中均 勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質骨形態發生蛋白。
4、 向冷卻後的反應體系中，加入質量濃度8X戊二醛600ul交聯，攪拌 50分鐘，再向體系中加入丙酮30ml，對複合物微球進行脫水。
5、 反應物停止攪拌，將漿液抽濾、濾餅為複合多孔微球粗品，將其用 30ml丙酮重複洗滌3次，得到的最終產物為淺黃色明膠/磷酸鈣複合多孔 微球的粉末。
該粉末粒徑為45um士5um，表面孔徑為5um士50nm。複合多孔微球粉 末由鈣磷酸鹽、鹿茸多肽和交聯後的明膠組成，該複合多孔微球材料用於 骨、牙缺損的修復；作為骨水泥的固相原料；直接用於骨創手術中的骨缺 損部位的填充物。實施例5.
1、 準確稱取1克明膠粉體放入100ml的燒杯中，加入5ml去離子水，
將其置於50土 rc水浴中攪拌溶解，隨後向燒杯中加入形成鈣磷酸鹽所需
的0.0008mol硝酸f丐固體，配成含有一定鈣離子濃度的明膠溶液，而後向 其中加入骨形態發生蛋白20mg，並攪拌均勻。
2、 在轉速為2000轉/分鐘的攪拌下，將上述溶液緩慢地滴加到200ml 溶有表面活性劑(SPAN 80-lg/50ml)的菜籽油相中，形成明膠溶液的油包 水乳化液，反應溫度保持在45 ± 1 。C，並繼續攪拌2小時，再向乳液體 系中滴加質量濃度為10%(麗4)2朋04溶液(Ca/P摩爾比為1.5: 1)。
3、 反應結束後，45 ± rc的反應物迅速移入至冰水浴中，並保持攪拌，
冷卻60分鐘，使得含有鈣磷酸鹽的明膠微球凝膠化，形成明膠微球中均 勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質骨形態發生蛋白。
4、 向冷卻後的反應體系中，加入質量濃度8%甲醛500ul交聯，攪拌 60分鐘，再向體系中加入丙酮25ml，對複合物微球進行脫水。
5、 反應物停止攪拌，將漿液抽濾、濾餅為複合多孔微球粗品，將其用 30ml丙酮重複洗滌3次，得到的最終產物為淺黃色明膠/磷酸鈣複合多孔 微球的粉末。
該粉末粒徑為15um士5um，表面孔徑為200nm士30nm。複合多孔微球 粉末由鈣磷酸鹽、鹿茸多肽和交聯後的明膠組成，該複合多孔微球材料用 於骨、牙缺損的修復；作為骨水泥的固相原料；直接用於骨創手術中的骨 缺損部位的填充物。
權利要求
1. 一種用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球，其特徵是在明膠微球中均勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白；其中，活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白是明膠重量的1‰～5％；形成鈣磷酸鹽的可溶性鈣鹽為每克明膠的0.0003～0.03mol，可溶性磷酸鹽的量使得Ca元素與P元素的比例為11～2∶1。
2. 根據權利要求1所述的複合多孔微球，其特徵是所述的明膠微球中均勻分散有交聯劑。
3. 根據權利要求2所述的複合多孔微球，其特徵是所述的交聯劑的量為在反應中交聯劑的添加量為每克明膠添加30ul 1000ul的交 聯劑，交聯劑的質量濃度為5%。 15%。
4. 根據權利要求2或3所述的複合多孔微球，其特徵是所述的 交聯劑選自戊二醛、甲醛、雙醛葡萄糖中的一種或大於一種的混合物。
5. 根據權利要求1所述的複合多孔微球，其特徵是所述的可溶性磷酸鹽的量使得Ca元素與P元素的比例為1. 5:1。
6. 根據權利要求1或5所述的複合多孔微球，其特徵是所述的 可溶性磷酸鹽選自磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫胺中的一種或大 於一種的混合物。
7. 根據權利要求1所述的複合多孔微球，其特徵是所述的可溶性鈣鹽選自氯化鈣、硝酸鈣、醋酸鈣中的一種或大於一種的混合物。
8. 根據權利要求1所述的複合多孔微球，其特徵是所述的用於 骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球的直徑在500nm 500um。
9. 根據權利要求1或8所述的複合多孔微球，其特徵是所述的 用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球上的孔的直徑在10nm 20um。
10. —種根據權利要求1 9任一項所述的複合多孔微球的製備方 法，其特徵是，該方法包括以下步驟1) 取明膠粉體，加入去離子水，製備明膠溶液，然後向明膠溶液中添加可溶性鈣鹽，其添加量為每克明膠粉體加入0. 0003 0. 03mol 的可溶性l^鹽；隨後，再加入可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽或骨 形態發生蛋白，鹿茸多肽或骨形態發生蛋白的添加量均為明膠重量的1 %0 5%;2) 將步驟l)製得的混合液倒入含有表面活性劑的油中，攪拌形 成明膠溶液的油包水乳化液；表面活性劑在油中的含量是lg/200ml 油 lg/20ml油；所用油的量為每克明膠5ml 250ml;3) 將步驟2)製得的明膠溶液的油包水乳化液加熱，溫度控制在 30。C 7(TC，並持續攪，攪拌速度為100轉/分鐘 6000轉/分鐘；然 後加入可溶性磷酸鹽溶液，磷酸鹽的加入量使混合液中的Ca元素與P元素的比例控制在l: 1 2: 1;4) 將步驟3)製得的混合液在30。C 7(TC溫度下攪拌，繼續攪拌 下，用冰浴冷卻；形成明膠微球中均勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生 長的活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白；5) 向步驟4)製得的混合液中加入交聯劑，交聯劑的質量濃度為 5%。 15%，交聯劑的添加量為每克明膠添加30ul 1000ul的交聯劑， 繼續攪拌；6) 取步驟4)或5)製得的混合液，加入丙酮，加入量為混合液 中水份體積的2 8倍，繼續攪拌，過濾，得到複合多孔微球的粗品；7) 將步驟6)得到的複合多孔微球的粗品用丙酮反覆洗滌後，得 到用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球。
11. 根據權利要求IO所述的方法，其特徵是所述的表面活性劑 是SPAN系列或琥珀酸二辛酯磺酸鈉表面活性劑之中的一種。
12. 根據權利要求10所述的方法，其特徵是所述的油選自矽油、 豆油、橄欖油、茶油、菜籽油或調和油中的一種。
13. —種根據權利要求1 9任一項所述的複合多孔微球的用途，其特徵是所述的用於骨修復的明膠與鈣磷酸鹽複合多孔微球能夠作為骨、牙的修復中的材料。
全文摘要
本發明屬於明膠衍生物材料的製備領域，特別涉及明膠與鈣磷酸鹽和一種鹿茸多肽生物活性組織或骨形態發生蛋白(BMP)合成出的複合多孔微球材料。本發明的複合多孔微球是一種在明膠微球中均勻分散有鈣磷酸鹽及可促使骨生長的活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白；其中，活性物質鹿茸多肽或骨形態發生蛋白是明膠重量的1‰～5％；形成鈣磷酸鹽的可溶性鈣鹽為每克明膠的0.0003～0.03mol，可溶性磷酸鹽的量使得Ca元素與P元素的比例為1∶1～2∶1。所述的複合多孔微球材料還可含有交聯劑。該複合多孔微球材料是一種具有良好的生物相容性和誘導成骨活性的骨修復生物材料。
文檔編號A61L27/00GK101444646SQ200710178158
公開日2009年6月3日 申請日期2007年11月27日 優先權日2007年11月27日
發明者史京京, 孫瑞雪, 宇 宋, 鄧旭明, 郭燕川, 陳麗娟 申請人:中國科學院理化技術研究所