枯草桿菌蛋白酶突變體的製作方法

2023-08-01 18:29:56

專利名稱：枯草桿菌蛋白酶突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的具有胺基酸順序的羰基水解酶突變體，在該順序中的羰基水解酶前體的一個或多個胺基酸殘基，特別在相當於解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliguefaciens)枯草桿菌蛋白酶中+123和/或+274殘基上的胺基酸殘基已被不相同的胺基酸取代。一般說來，這類突變體羰基水解酶可通過對編碼天然的或重組的羰基水解酶的前體DNA順序的離體修飾得到，所述順序用於僅僅編碼前體胺基酸順序中的1個或2個這種胺基酸的取代，或編碼與前體胺基酸順序中其他編碼、插入或缺失相結合的取代。
絲氨酸蛋白酶是羰基水解酶的一種亞組，它們包括具有廣譜專一性和生物作用的各種不同的酶(Stroud，R.M.1974，Sci.Amer.，131，74-88).儘管它們的功能各有不同，但是絲氨酸蛋白酶的催化機理至少有兩族酶在遺傳學上顯著不同，即枯草桿菌蛋白酶和哺乳動物糜蛋白酶與同種細菌絲氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶和S.cresius胰蛋白酶)。這兩族酶具有明顯相似的催化機理(Kraut，J.1977.Ann.Rev.Biochem.，46，331-358)。此外，雖然一級結構互不相關，但是這兩個酶族的三級結構都構成了由絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸組成的胺基酸的保守催化三分體。
枯草桿菌蛋白酶是一種由許多不同種的桿菌和其他微生物中大量分泌的絲氨酸蛋白內切酶(分子量27500)，枯草桿菌蛋白質順序至少已由四個不同種的桿菌中測定得到(Markland，F.S.，et al.1983，Honne-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，364，1537-1540)。解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶對2.5A解析度的三維晶相結構也已有報導(Wright，C.S.，et al.1969，Nature，221，235-242;Drenth，J.，et al.1972，Eur.J.Biochem.，26，177-181)。上述研究說明，雖然枯草桿菌蛋白酶在遺傳上與哺乳動物絲氨酸蛋白酶無關，但都具有相似活性部位結構。含有共價鍵肽抑制劑的枯草桿菌蛋白酶(Robertus，J.D.，et al.，1972，Biochemistry，11，2439-2449)或產物複合物(Robertus，J.D.，et al.，1976，J.Biol.Chem.，251，1097-1103)的X射線晶體結構也提供了有關枯草桿菌蛋白酶的活性部位和公認的底物結合裂口的信息。另外，還報導了有關枯草桿菌蛋白酶的大量動力學和化學方面的修飾研究(Philipp，M.，et al.，1983，Mol.Cell.Biochem.，51，5-32;Svendsen，B.1876，Carlsbera Res.Comm.，41，237-291;Markland，F.S.同上)，至少有一篇報告報導在枯草桿菌蛋白酶222位殘基上的蛋氨酸的側鏈通過過氧化氫轉化為蛋氨酸-亞碸(Stauffer，D.C.，et al.1965，J.Biol.Chem.，244，5333-5338)，在221殘基上的絲氨酸的側鏈通過化學修飾方法轉化為半胱氨酸(Polgar，et al.，1981，Biochimica et Biophysica Acta，667，351-354)。
美國專利4760025號和歐洲專利0130756號於1985年1月9日公開了枯草桿菌蛋白酶胺基酸殘基的修飾，這些殘基相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶。酪氨酸-1，天冬氨酸+32，天冬醯胺+155，酪氨酸+104，蛋氨酸+222，甘氨酸+166，組氨酸+64，甘氨酸+169，苯基丙氨酸+189，絲氨酸+33，絲氨酸+221，酪氨酸+217，穀氨酸+156和丙氨酸+152。1988年1月7日發表的歐洲專利0251446號公開了解澱粉芽孢桿菌中的枯草桿菌蛋白酶的其他胺基酸殘基以及它們的等同物，即可通過取代、插入或缺失方法進行修飾和可與修飾美國專利4760025號所證明的殘基相結合，形成有用的枯草桿菌蛋白酶突變體。但是，本申請所證明的特定殘基在上述文獻中均未被證明。
與此類似的還有1989年10月19日發表的PCT專利WO89/09819號和WO89/09830號。公開了通過誘變編碼枯草桿菌蛋白酶的核苷酸順序得到枯草桿菌蛋白酶。在這些文獻中業已證明，許多胺基酸殘基是可以進行修飾的，但是上述文獻均未證明本發明所述的殘基的修飾。
因此，本發明的任務在於提供含有取代羰基水解酶前體中胺基酸殘基的羰基水解酶突變體，所述被取代的殘基相當於解澱粉芽孢桿菌中的枯草桿菌蛋白酶+123和/或+274位上的殘基。這類突變體通過至少有一種不同於具有相關性質的衍生出所述突變體的胺基酸的羰基水解酶前體的性質。
本發明的另一個任務在於提供編碼這類羰基水解酶突變體的DNA順序和含有這類突變體DNA順序的表達載體。
本發明還有一個任務在於提供用這類載體轉化的宿主細胞和表達這類DNA的宿主細胞，從而在細胞內或細胞外產生羰基水解酶突變體。
本發明包括與衍生突變體胺基酸的羰基水解酶前體相比，具有不同蛋白水解活性、穩定性和/或性能特徵的非天然羰基水解酶突變體。該羰基水解酶前體可以是天然羰基水解酶，也可以是重組體水解酶。具體地說，這類羰基水解酶突變體具有在自然界尚未被發現的胺基酸順序，它是通過用1個或多個不同胺基酸取代1個或多個羰基水解酶前體的胺基酸殘基得到的。該酶前體的1個或多個胺基酸殘基相當於解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的第Asn+123和/或Ala+274位或其他羰基水解酶或枯草桿菌蛋白酶中等同的胺基酸殘基。
本發明還包括編碼這類羰基水解酶或枯草桿菌蛋白酶突變體的突變體DNA順序。
上述突變體DNA順序是由編碼天然的或重組的酶前體的前體DNA順序得到的。突變體DNA順序是通過修飾前體DNA順序得到的，用於編碼由相當於解澱粉芽孢桿菌中第+123和/或+274位的前體DNA順序編碼的1個或多個專一的胺基酸殘基的取代。這些重組DNA順序編碼具有新胺基酸順序的羰基水解酶突變體，一般說來這種突變體至少要有一個性能基本上不同於由前體羰基水解酶DNA順序編碼的相同性能的酶。以上所述的性能包括蛋白水解的活性、穩定性和/或更佳性能特徵。
本發明還包括在相當於解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中第Asn+123位上具有不同胺基酸殘基(例如絲氨酸)的原核和真核枯草桿菌蛋白酶和在相當於解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中第+274位上具有不同胺基酸殘基的枯草桿菌蛋白酶。
此外，本發明還包括含這類突變體羰基水解酶DNA順序的表達載體和用這類能產生這種突變體的載體轉化的宿主細胞。本發明還涉及含有本發明的羰基水解酶突變體的洗滌劑組合物。


如下圖1說明解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的DNA和胺基酸順序以及該基因的部分限制性基因圖;
圖2說明由解澱粉芽孢桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)varl168和地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)(carlsbergensis)得到的枯草桿菌蛋白酶中保守的胺基酸殘基;
圖3A和3B說明解澱粉芽孢桿菌、枯草桿菌varI168和地衣形芽孢桿菌中枯草桿菌蛋白酶的胺基酸順序;
圖4說明3種枯草桿菌蛋白酶的胺基酸順序。第一行表示解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中枯草桿菌蛋白酶的胺基酸順序(有時稱為枯草桿菌蛋白酶BPN′)。第2行表示粘性芽孢桿菌(Bacillus lentus)(在PCT專利WO89/06276號中為枯草桿菌蛋白酶309)。第3行表示本發明最佳實施例GG-RYSA的胺基酸順序。＊號表示與枯草桿菌蛋白酶BPN′相比，缺失特定的胺基酸殘基;
圖5說明質粒pGGA274的構建;
圖6說明質粒pGG-RYSA的中間體pGG-KVNA的構建;
圖7說明用於構建合成的粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因的寡核苷酸複製方法;
圖8說明構建用於編碼粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶合成基因的方法;
圖9說明用於在DNA+123密碼子位上通過盒式誘變進行取代的盒。XXX表示修飾的密碼子，用於編碼+123位上的胺基酸取代;
圖10說明本發明最佳實施例的DNA和胺基酸順序，其中DNA順序是合成的DNA。該圖中的DNA已被修飾，用於編碼27位上的精氨酸、78位上的絲氨酸、104位上的酪氨酸、123位上的絲氨酸和274位上的丙氨酸。
本申請公開了在羰基水解酶枯草桿菌蛋白酶中相當於在解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中+123位上的胺基酸殘基離體誘變產生具有經過改變的高於枯草桿菌蛋白酶前體的蛋白水解活性。
本申請還公開了在羰基水解酶枯草桿菌蛋白酶中在相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的+274位殘基上的離體誘變產生了具有改進的穩定性(例如經過改進的蛋白自水解穩定性)的枯草桿菌蛋白酶突變體。在若干實例中，當將這些突變體用於洗滌劑組合物時還具有更好的性能。
羰基水解酶是水解含有

鍵化合物的酶(其中X是氧或氮)。它們包括天然羰基水解酶和重組羰基水解酶。天然羰基水解酶基本上包括水解酶，例如肽水解酶(如枯草桿菌蛋白酶或含金屬蛋白水解酶)。肽水解酶包括α-氨醯肽水解酶、肽基胺基酸水解酶、醯氨基水解酶、絲氨酸羧肽酶、含金屬羧肽酶、硫醇蛋白酶、羧肽酶和含金屬蛋白酶。還包括絲氨酸、金屬硫醇和酸的蛋白酶以及蛋白內切酶和蛋白外切酶。
「重組羰基水解酶」係指編碼天然羰基水解酶的DNA順序經過修飾、用於產生能編碼羰基水解酶胺基酸順序中取代、插入或缺失1個或多個胺基酸的突變體DNA順序的羰基水解酶。本文公開了適合的修飾方法，1985年1月9日發表的EPO專利0130756號和1988年1月7日發表的EPO專利0251446號也均已公開了該方法。
枯草桿菌蛋白酶是細菌或真菌羰基水解酶，一般說來，其作用在於裂解蛋白質或肽的肽鍵。本發明中所用的「枯草桿菌蛋白酶」係指天然枯草桿菌蛋白酶或重組枯草桿菌蛋白酶。已知通過各種微生物產生和經常分泌出許多天然的枯草桿菌蛋白酶，其中有些酶的胺基酸順序不完全是同源的。但是其中的枯草桿菌蛋白酶具有相同或相似類型的蛋白水解活性。這類的絲氨酸蛋白酶具有限定催化三分體的共同的胺基酸順序，而該三分體使絲氨酸蛋白酶和與其相關的糜蛋白酶區分開來。與絲氨酸蛋白酶有關的枯草桿菌蛋白酶和糜蛋白酶都具有含天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三分體。在與蛋白酶有關的枯草桿菌蛋白酶中，上述胺基酸的相對順序，從N端至C端為天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸。但在與蛋白酶有關的糜蛋白酶中，其相對順序為組氨酸-天冬氨酸-絲氨酸。因此，本文所述的枯草桿菌蛋白酶係指具有與蛋白酶有關的枯草桿菌蛋白酶的催化三分體的絲氨酸蛋白酶。例子包括本文圖3給出的和在PCT專利WO89/06276號和EPO專利申請0283075號所述的各種枯草桿菌絲氨酸。
「重組枯草桿菌蛋白酶」係指編碼枯草桿菌蛋白酶的DNA順序經過修飾、用於產生能編碼天然枯草桿菌蛋白酶胺基酸順序中取代、缺失或插入1個或多個胺基酸的突變體DNA順序的枯草桿菌蛋白酶。產生這種修飾並可與本文所述方法相結合的適宜方法包括EPO專利-130756和0251446以及PCT專利WO89/06279、WO89/09830和WO89/09819中所公開的方法。
「非人羰基水解酶」和編碼該酶的DNA可從許多真核生物和原核生物中得到。原核生物適宜的例子包括革蘭氏陰性生物(如大腸桿菌或假單胞菌)和革蘭氏陽性細菌(例如小球菌或芽孢桿菌)。可得到羰基水解酶及其基因的真核生物的例子包括酵母(例如啤酒酵母)、真菌(麴黴sp.)和非人的哺乳動物(例如牛sp.)並由其得到編碼羰基水解酶糜蛋白酶的基因。作為枯草桿菌蛋白酶，許多羰基水解酶都可從各種相關種的生物中得到，它們具有的胺基酸順序並非完全同源，但卻具有相同或相似類型的生物活性。因此，用於本發明的非人羰基水解酶具有的功能定義，都涉及間接或直接地與原核生物和真核生物相聯繫的羰基水解酶。
「羰基水解酶突變體」具有由「羰基水解酶前體」的胺基酸順序得到的胺基酸順序。該羰基水解酶前體包括天然羰基水解酶和重組羰基水解酶。羰基水解酶突變體的胺基酸順序是由前體水解酶胺基酸順序通過取代、缺失或插入1個或多個前體胺基酸順序的胺基酸「得到」的。與其使用前體羰基水解酶本身，還不如對編碼前體羰基水解酶的胺基酸順序的「前體DNA順序」進行上述修飾。使用前體DNA順序的適宜方法包括本文和EPO專利0130756及0251446中公開的各種方法。
相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的+123位和+274位的特定殘基在本發明中被用於取代。這些胺基酸位數可參閱圖1中的成熟的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶順序。然而本發明並不限於該具體的枯草桿菌蛋白酶的誘變，而可引伸到含有「相當於」解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中已確認的殘基位上的胺基酸殘基的羰基水解酶前體。
如果前體羰基水解酶的殘基(胺基酸)是同等的(即在一級或三級結構的位上相對應)或類似於解澱粉芽孢芽菌枯草桿菌蛋白酶中的特定殘基或該殘基的一部分(即具有能在化學上結合、反應或相互作用的相同或相似的功能)，那麼它就相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的殘基。
為了建立相同的一級結構，將前體羰基水解酶的胺基酸順序直接與解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶一級順序，特別是已知順序的所有枯草桿菌蛋白酶的變體的一組殘基(圖2)進行對比。在將保守殘基排列後，為保持該排列可以進行必要的插入和缺失(即避免由於任意的缺失和插入而引起保守殘基的缺失)，應限定相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶一級順序中的具體胺基酸的殘基。保守殘基的排列最好保持100%的這類殘基。但是，大於75%或小至50%保守殘基的排列也適合於限定相應的殘基。還應保持催化三分體Asp32/His64/Ser221。
例如圖3所示，將由解澱粉芽孢桿菌、枯草桿菌var I168和地衣形芽孢桿菌(carlsbergensis)中的枯草桿菌蛋白酶的胺基酸順序排列後，可提供胺基酸順序之間最大量的同等性。這些胺基酸順序的對比證明，每個順序都含有大量保守殘基，即圖2中所確定的殘基。
因此，這些保守殘基可用於限定相應於諸如粘性芽孢桿菌中的枯草桿菌蛋白酶的其他羰基水解酶和本發明所用的較佳枯草桿菌蛋白酶突變體中與解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相等的胺基酸殘基(PCT專利WO89/06279，公開於1989年7月13日)。這些特定的胺基酸順序的排列示於圖4，該解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的順序用於產生最高等同性的保守殘基。由其可以看到，與解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相比較，在粘性芽孢桿菌的順序和本發明較佳的枯草桿菌蛋白酶突變體中存在大量缺失。因此，在其他的枯草桿菌蛋白酶中，與解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中Val-165相等的胺基酸是示於Val-165下面的特定的異亮氨酸。
在圖4中，123位上的胺基酸是解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的天冬醯胺。在粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中，相等的殘基是所示特定的天冬醯胺。但是，在本發明較佳的枯草桿菌蛋白酶突變體中，相等於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的+123位的胺基酸是另一個胺基酸，而不是天冬醯胺，最好是圖4所示的絲氨酸。與此相類似的是圖4所示的在解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中+274位上的胺基酸是丙氨酸。由此可見，粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中相等的胺基酸是圖4所示特定的蘇氨酸。在本發明特定的較佳枯草桿菌蛋白酶突變體中，274位上相等的胺基酸是圖4所示的丙氨酸。
因此，在+123和+274位上的由圖4所示的是粘性芽孢桿菌和本發明較佳實施例中的枯草桿菌蛋白酶的一級胺基酸順序。但是其他各種胺基酸殘基也可以修飾，它們相等於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的特定胺基酸。因此，在較佳的實施例中，在解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中27位的賴氨酸具有在粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中27位上相等的賴氨酸。正如實施例所述，含有本發明較佳實施例之一的枯草桿菌蛋白酶是通過修飾編碼粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的DNA順序得到的。上述修飾DNA包括相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的123和274位上密碼子的修飾。但是其他兩個修飾則是對在相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的殘基27和104位上粘性芽孢桿菌胺基酸順序的修飾。如圖4所示，將粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中相等的殘基27上的賴氨酸修飾為編碼較佳實施例中的精氨酸。與此相類似的是將相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的酪氨酸104的粘性芽孢桿菌104位上的纈氨酸殘基也被修飾為編碼酪氨酸。因此，圖4所示的較佳實施例含有由粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶衍生的胺基酸順序，它是通過修飾相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶27、104、123和274位上枯草桿菌蛋白酶的殘基得到的。
相等的殘基也可通過測定前體羰基水解酶三級結構的同等性予以確定，而其三級結構已用X射線結晶測定法測定。相等殘基的定義為在排列後，前體羰基水解酶和解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定胺基酸殘基的一個或多個主鏈原子的原子配位(N-N，CA-CA，C-C，和O-O)是在0.13nm內，尤以0.1nm為佳。在將最佳模型定向定位後獲得的排列，可以就所討論的解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的羰基水解酶非氫蛋白原子的原子配位達到最大的重疊。所述最佳模型係指在可用的最高解析度下，試驗衍射數據的最低R因子限定的結晶學模型。
R因子＝ (Σh｜FO(h)｜-｜FC(h)｜)/(Σh｜FO(h)｜)功能類似於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶特定殘基的相等殘基的定義為可以採用一種結構，由解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶特定殘基產生並對其進行適當限定，從而對它們進行改變、修飾或影響蛋白質結構、底物結合或催化。此外，它們是前體羰基水解酶的這樣一類的殘基(其三級結構已通過X射線結晶方法得到)，即其所具有的位置類似於至少殘基的2個側鏈原子的原子配位是在解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相應側鏈原子的0.13nm，儘管根據所具有等同位置，給定殘基的主鏈原子可以不滿足等同物的標準。解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的三維結構的配位已在EPO專利0251446給出，並且可以按如上所述，用於測定三級結構的等同殘基。
用於取代、插入或缺失的一些殘基系保守殘基，而其他一些則系非保守殘基。在非保守殘基的情況下，一個或多個胺基酸的取代限制於能產生具有與天然胺基酸順序不對應的胺基酸順序的突變體，這種取代不應導致天然存在的順序。本發明的羰基水解酶突變體包括成熟形式羰基水解酶突變體和前形式和早前形式的這類水解酶突變體。早前形式是一種較佳結構，因為它能促使羰基水解酶突變體的表達、分泌和成熟。
「前順序」係指與成熟形式的羰基水解酶的N端部分相結合的胺基酸順序，並且在除去時產生「成熟」形式的羰基水解酶。在自然界中已經發現許多蛋白水解酶，它們是轉譯原酶產物，並且在轉譯後不進行處理時，以這種方式表達。產生羰基水解酶突變體，特別是枯草桿菌蛋白酶突變體的較佳前順序是解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的前順序，雖然也可使用其他的枯草桿菌蛋白酶的前順序。在實施例中也使用了粘性芽孢桿菌(ATCC21536)中枯草桿菌蛋白酶的前順序。
「信號順序」或「先順序」係指與羰基水解酶的N端部分或與可參予成熟水解酶或前形式水解酶分泌的原水解酶的N端部分相結合的任何胺基酸順序。這個信號順序的定義是一種功能性定義，意味著包括在天然條件下由枯草桿菌蛋白酶基因或參予枯草桿菌蛋白酶或其他羰基水解酶分泌的其他能分泌羰基水解酶的N端編碼的所有這些胺基酸順序。本發明利用的這類順序都能有效地分泌如本文所定義的羰基水解酶突變體。用於實施例中的較佳信號順序包括枯草桿菌的枯草桿菌蛋白酶信號順序的前7個胺基酸殘基與之相融合的粘性芽孢桿菌(ATCC21536)的枯草桿菌蛋白酶信號順序的其餘胺基酸殘基。
「先前」形式的羰基水解酶突變體由具有可與水解酶氨基端控制連接的前順序和可與前順序氨基端控制連接的「前」或「信號」順序的成熟形式的水解酶組成。
「表達載體」係指含有可與能使DNA在適合的宿主中表達的適宜的控制順序控制連接的DNA順序的DNA結構。所述控制順序包括能進行轉錄的啟動區、控制該轉錄的操縱子順序、編碼適合的mRNA核糖結合位點的順序和控制轉錄和轉譯末端的順序。載體可以是質粒、噬菌體顆粒或只是可能的基因組的插入。一旦轉化到適合的宿主中時，載體可以複製並且獨自起著宿主基因組的作用，在有些實施例中，還可以整合到基因組中。在本文中，「質粒」和「載體」有時可相互換用，而在目前質粒是一種最廣泛使用的一種載體。但是本發明還可引伸為包括具有相同功能並且在本領域中系已知或可知的其他形式的表達載體。
本發明所用的「宿主細胞」是原核或真核宿主，它們最好能採用EPO專利0130756號中已公開的方法進行操作，使其成為不能分泌具有酶活性的內蛋白酶。表達枯草桿菌蛋白酶的較佳宿主細胞是缺乏具有酶活性的中性蛋白酶和鹼性蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶)的桿菌(Bacillus)株BG2036。菌株BG2036的構建在EPO專利0130756中已作了詳細介紹，而且Yang，M.Y.等(J.Bacteriol.，160，15-21，1984)又作了進一步的介紹。表達枯草桿菌蛋白酶的其他宿主細胞包括枯草桿菌I168(EPO專利0130756號)。
使用由重組DNA技術構建的載體轉化或轉染宿主細胞，經過轉化的這類宿主細胞能複製編碼羰基水解酶突變體和表達所需的羰基水解酶突變體。在編碼先或先前形式的羰基水解酶突變體的載體的情況下，這類突變體在被表達時，一般都由宿主細胞分泌到宿主細胞培養基中。
「控制連接」系在描述兩個DNA區之間關係時僅意味著它們在功能上彼此相關。例如先順序如果起著信號順序的功能作用並參予最好包括信號順序的裂解的成熟形式的蛋白質的分泌，則可與肽控制連接啟動區如果控制順序的轉錄，則可與編碼順序控制連接核糖體結合位點如果定位進行轉譯，則可與編碼順序控制連接。
編碼天然的前體羰基水解酶的基因可按EPO專利0130756和0251446所述的一般方法獲得。由本文中的實施例可見，所述方法一般包括合成具有有意義的水解酶順序編碼區的標記探針，由表達水解酶的有機體製備基因庫，和通過與探針的雜交篩選有意義基因的基因庫。然後繪製雜交克隆的基因圖和編制其順序。
然後將經過克隆的羰基水解酶用於轉化宿主細胞，供以表達水解酶。將水解酶基因連接到高拷貝數的質粒中。該質粒在宿主中進行複製，其意義就在於它含有質粒複製所需的公眾已知的成份可與基因連接的啟動區(如其可為宿主識別即轉錄，則提供作為基因的等同啟動區);轉錄終止區和多聚腺核苷酸化區(系穩定由宿主從某些真核宿主細胞水解酶基因轉錄mRNA所需)，後者由外源得到或由水解酶基因的內源終止區提供;需要時還可含有如抗菌素的抗性基因一類的選擇基因，能使由含抗菌素培養基培養的經質粒感染的宿主細胞保持連續培養。高拷貝數質粒還含有複製宿主的起始物，從而能在不受染色體限制的細胞質中產生大量的質粒。但是，屬於本發明範圍的還有將水解酶基因的多重拷貝整合到宿主基因組中。它們可通過對同源重組特別敏感的原核和真核有機體產生。
此外，還可產生編碼天然的或突變的前體羰基水解酶的合成基因。其所採用的方法是確定前體水解酶的DNA和/或胺基酸的順序。並聯後對重疊的合成單鏈DNA片段進行合成，通過雜交和連接，產生編碼前體水解酶的合成DNA。此方法與克隆天然基因相比具有若干優點，採用此方法，限制性位點可以整個插入到DNA中，而無需改變編碼的胺基酸順序，然後通過修飾形成突變體羰基水解酶。此外，合成方法還可調整密碼子在合成基因中的應用，從而與所用具體表達宿主的密碼子偏倚相一致。
當天然的或合成的前體羰基水解酶基因被克隆後，大量的修飾使基因的使用超過天然的前體羰基水解酶的合成。這類修飾包括如EPO專利0130756和0251446中所述重組羰基水解酶和本文所述羰基水解酶突變體的產生方法。
以下盒式誘變方法可用於構建和鑑別本發明的羰基水解酶突變體，儘管包括定位誘變在內的其他方法也可使用。首先，要得到編碼水解酶的天然基因，並進行全部或部分的編排順序。然後對該順序找出所需的位點，對編碼的酶中1個或多個胺基酸進行誘變(缺失、插入或取代)。鑑定在該點兩側的順序是否存在用寡核苷酸庫取代基因短片段的限制性位點，該寡核苷酸庫被表達時可編碼各種突變體。這類限制性位點最好是在水解酶基因內的單一位點，能夠取代基因片段。但是在水解酶基因中並非過份冗餘的任何適宜的限制性位點都可使用，只要由限制性消化所產生的基因片段能夠重新組合到原來的順序中。如果限制性位點不是在距所選擇點的範圍內(10-15個核苷酸)，那麼這種位點是由取代基因中的核苷酸所產生的，其讀碼和編碼的胺基酸在最終結構中都不發生變化。為了使其順序變為與所需順序相一致，根據通常所知的方法，基因的誘變可通過延長M13的引物來完成。適宜的側翼區的定位和獲得兩個適宜的限制性位點順序所需變化的確定，通過遺傳密碼的多重性、基因的限制酶譜圖和大量不同的限制酶等方法可解決這些問題。應予注意的是，如果獲得一個適宜的側翼限制性位點，那末上述方法必須僅與不含位點的側翼區結合使用。
當天然的DNA或合成的DNA被克隆後，需被誘變兩側的限制性位點可用近親限制酶消化，並將許多終端的末端互補寡核苷酸盒連接到基因上。採用此方法誘變異常簡單，因為所有寡核苷酸都能合成為具有相同限制性位點，並且不需要用合成的連接子去建立限制性位點。
本文所述的蛋白水解活性被定義為每毫克活性酶水解肽鍵的速率。許多已知的方法都可用於測量蛋白水解活性(K.M.Kalisz，.「Microbial Proteinases」，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，A.Fiechter ed.，1988)。
本發明的目的在於與前體羰基水解酶相比，能獲得具有較高蛋白水解活性的突變體羰基水解酶，從而能使酶更有效地作用於靶底物。在實施例中，給出了在相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+123位殘基上得到產生枯草桿菌蛋白酶型的羰基水解酶所用的特定胺基酸。在若干實施例中，也可獲得蛋白水解活性較底的蛋白水解酶。在這種情況下，可在相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+123位殘基上取代實施例中所用胺基酸，即可降低蛋白水解活性。
關於前體枯草桿菌蛋白酶，其中絲氨酸並不是相當於解澱粉芽孢桿菌+123位上的殘基，當前體的+123位上絲氨酸被取代時，即可獲得最大的蛋白水解活性。此外，已知非天然的枯草桿菌蛋白酶在相當於解澱粉芽孢桿菌的+123上含有絲氨酸。已知在該位上的絲氨酸能提高蛋白水解活性，本領域專業人員能夠篩選出天然桿菌中的枯草桿菌蛋白酶，以便鑑別和克隆含有在該位上的絲氨酸的天然突變體。這種天然桿菌中的枯草桿菌蛋白酶突變體也屬本發明的範圍。
如羰基水解酶由非桿菌得到，而絲氨酸則在前體酶的+123位，則取代可以是一種減低蛋白水解活性的取代。這種方法應是有用的，例如需要羰基水解酶的合成活性(例如用於合成肽)時，就可使用這種方法。人們需要降低這種蛋白水解的活性，它能破壞這種合成的產物。
本發明的另一個任務在於確定，相當於解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中+274上的殘基在調節酶在洗滌劑組合物中全部性能特徵方面的重要意義。因此，如本文實施例所述，在相當於+274位上的粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中的蘇氨酸，誘變為最佳實施例中的丙氨酸，從而產生高性能的突變體酶。如實施例中所示，用除蘇氨酸以外的胺基酸，如亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸和丙氨酸取代該殘基，從而降低突變體的穩定性。這種穩定性的降低被認為是突變體自催化降解的結果。因此，相當於桿菌的枯草桿菌蛋白酶+274位殘基的修飾能夠提高酶在洗滌劑組合物中整個性能並調節酶的整個穩定性。本發明在這方面的任務在於當突變體羰基水解酶用於洗滌劑組合物時，獲得具有高於前體羰基水解酶的性能。如本文中所述，洗滌劑中的高性能，其定義為提高某些酶敏感的顏色如禾本科植物或血液的洗淨程度，其洗淨程度是在經過常規洗滌周期後通過目測確定。
在實施例中給出了本發明的最佳實施例，其中在粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶27位上的賴氨酸被精氨酸取代，104位上的纈氨酸被酪氨酸取代，123位上的天冬醯胺被絲氨酸取代，274位上的蘇氨酸被丙氨酸取代。雖然這種酶的穩定性有時低於前體粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，但是在洗滌劑組合物中該酶的性能水平基本上提高了，與未修飾的粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶相比較，該粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶變體在使用一半量時，性能卻完全相同。
根據用該種或其他突變體枯草桿菌蛋白酶得到的結果，顯然相當於解澱粉芽孢桿菌+123和+274位上的羰基水解酶中的殘基對於這些酶的蛋白水解活性、性能和/或穩定性來說具有重要的意義。
本發明的許多羰基水解酶突變體，尤其是枯草桿菌蛋白酶，都可用於配製各種不同的洗滌劑組合物。大量已知化合物都適宜用於含本發明羰基水解酶突變體的組合物中的表面活性劑，包括如US-4404128(Barry J.Anderson)和US-4261868(Jiri Flora等)等專利中所公開的非離子的、陰離子的、陽離子的或兩性離子的洗滌劑。本領域非常熟悉能用作洗滌劑組合物的各種不同的配製劑。本發明的枯草桿菌蛋白酶能夠配製成約為0.01-5%(重量)(尤以0.1-0.05%為佳)、pH為6.5-12.0的已知粉末和液體的洗滌劑。上述洗滌劑還可包括其他酶，例如已知的蛋白酶和澱粉酶，以及助洗劑和穩定劑。
本發明的枯草桿菌蛋白酶加到常規清潔劑組合物時並不需要特別的使用限制。換言之，任何適合於洗滌劑的溫度和pH也適合於本發明的組合物，只要pH是在上述範圍內，而溫度則在本發明枯草桿菌蛋白酶變性溫度之下。此外，本發明的枯草桿菌蛋白酶還可用於不含洗滌劑的清潔劑組合物，而且既可單獨使用，也可與助洗劑和穩定劑結合使用。
以下實施例只是說明本發明而不限制要求保護的範圍。
實施例1在枯草桿菌蛋白酶中表達粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因的構建通過在枯草桿菌和解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶基因第7-8信號順序密碼子上共同的Sau3A限制位點，質粒pSAR(圖5)含有轉譯融合。如圖5所示，將EcoRⅠ-BamHⅠ 2.0Kb片段上的該基因亞克隆到M13mp19中，分離出用於定點誘變的單鏈模板DNA，形成pSAR-Q275R。誘變方法基本上按Zoller，M.等人所述方法(Methods Enzymol.，1983，100，468-500)(1)，並使用下列順序的合成寡核苷酸

順序中＊號表表示變自野生型基因順序，底線表示引入用於篩選編碼Q275R轉換的特定的突變體基因的PstⅠ核酸內切限制酶位點。這些改變可使(1)將該位上的胺基酸轉化為由粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中得到的胺基酸;(2)使pSAR終止區的掛鈎通過類似引入到粘性芽孢桿菌(ATCC 21536)中的pGG36的Pst位點掛聯到粘性芽孢桿菌的成熟編碼區。
質粒pGG36(圖5)含有編碼完全枯草桿菌蛋白酶基因的粘性芽孢桿菌(ATCC 21536)的2.1Kb基因組片段，該枯草桿菌蛋白酶基因是按常規方法用往復式載體pBS42克隆得到的(Band，L.，et al.，1984，DNA，3，17-21)。
用於該枯草桿菌蛋白酶的胺基酸順序與PCT專利89/06279所公開的用於枯草桿菌蛋白酶309的胺基酸順序相同。按上述定點誘變方法和使用下列順序的寡核苷酸，將該基因亞克隆到M13中

以便1)將相應於被引入位點的該基因中相同位置上的PstⅠ位點引入到上述的pSAR中;2)用丙氨酸取代274位上的蘇氨酸，構成pGG36-T274A。
在PatⅠ/BamHⅠ消化、片段分離和連接前，先將突變體pSAR-Q275R和pGG36-T274A基因再分別亞克隆到pBS42中，產生質粒GG-A274B，amy.term，(如圖5所示)，所採用的方法均為常規方法。
合成DNA連接物可通過下列順序的互補單鏈寡核苷酸的對合製取

得到圖6所示雙鏈DNA片段＃2。該複式結構連接物左右凹入兩端分別互補於pSAR的片段＃1的San3A端和pGG-A274 B.amy.term的片段＃3的ClaⅠ端。這3個片段在通過常規方法進行質粒的核酸內切限制酶消化、片段分離和連接後，與pSAR-Q275R的片段4結合，產生質粒pGG-KVNA。消化GG-KVNA表明該枯草桿菌蛋白酶含有由pGG-36編碼的枯草桿菌蛋白酶，其包括27位上的賴氨酸(K)、104位上的纈氨酸(V)、123位上的天冬醯胺(N)和在274位上用丙氨酸取代蘇氨酸(A)。
實施例2pGG-KNVA的修飾如圖6所示，使用具有下列順序的寡核苷酸，將GG-KVNA基因(2.1KbEcoRⅠ-BamHⅠ片段)亞克隆到定點誘變的3個連續圓圈的M13中


＊號表示變自野生型基因順序，底線表示(a)引入的XbaⅠ位點，(b)和(c)分別表示用於篩選連接的R27、Y104和S123誘變是否存在被引入的NheⅠ位點。此外，(c)中的頂線表示被破壞的SphⅠ位點。最後，再將2.1Kb GG-RYSA基因亞克隆到pBS42，用於在枯草桿菌宿主中的表達。
形成的質粒稱之為pGG-RYSA。該命名表明在pGG-KVNA質粒中有4個殘基被修飾。27位上的賴氨酸(K)被修飾為天冬醯胺(R)，104位上纈氨酸(V)被修飾為酪氨酸(Y)，123位上的天冬醯胺(N)被修飾為絲氨酸(S)。上述274位上的殘基被取代的丙氨酸在本方法中未被修飾。
根據枯草桿菌蛋白酶309的胺基酸順序，27位上的賴氨酸被精氨酸取代。如PCT專利WO89/06279號所示，賴氨酸位於27位上。但是在將該枯草桿菌蛋白酶蛋白獨自編順序後，起始數據證明，在27位上的殘基是精氨酸。在104位酪氨酸取代纈氨酸的情況下，根據上面獲得的關於解澱粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶(有時用BPN′表示)的結果，這種取代降低了酶的pH構型，提高了酶的性能。根據以下得到的結果，在123位上絲氨酸取代了天冬醯胺，其中測定表明，123位上絲氨酸的取代將酶在最相關的突變體中的蛋白水解活性增至最大程度。
實施例3合成的粘性芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因的構建編碼粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶胺基酸順序的DNA也是通過構建編碼合成DNA順序的基因進行製備的。
將質粒pGG36的2.1Kb HindⅢ基因組片段編順序。所得成熟的基因產物(GG36枯草桿菌蛋白酶)用於設計具有下列特性的合成成熟編碼順序(1)一般說來，除了在基因中按常規固定的限制酶識別位點所產生的更替密碼子外，可利用7個不同枯草桿菌基因(由密碼子使用表中得到，參閱Maruyama，T.，et al.所制的表2，發表在Nucl.Acids Res.，Supplement 14 pp，151-197)中每個胺基酸最常見的密碼子;(2)約在-0.8成熟編碼區每40-60bp，將經過專門選擇的2或3個密碼子結合在一起，引入間隔非常均勻的各單個限制位點，選擇這些位點能夠(a)進行以後的盒式誘變和篩選研究;(b)構建1個以上的誘變;(3)設1個PstⅠ識別位點，使之包括272-274密碼子，能掛鈎到用3個相同的密碼子經過類似修飾的解澱粉芽孢桿菌基因的終止區順序上，並且丙氨酸取代274位上的酪氨酸;(4)引入1個NruⅠ位點，包括成熟密碼子殘基9-11，用短合成雙鏈DNA連接物使之掛鈎到GG36的先、前編碼順序上。根據該設計合成寡核苷酸，使之通過對接到給出的-60bp編碼區的編碼和非編碼的寡核苷酸，在生成的雙鏈DNA片段的末端具有互補於另一個基因的復體片段末端的單鏈區(參閱圖7)。
將總共36個單獨的寡核苷酸(包含18個復體)用於如上所述的構建，從而得到-0.8Kb復體合成成熟編碼區(圖8中片段3)。
最後，再合成一對或合成的寡核苷酸，通過對接(圖8給出的片段2)，在其5′端具有NcoⅠ位點(互補於成熟密碼子5-6上的GG36的NcoⅠ位點)和在其3′端上具有NruⅠ位點(互補於片段3的3′端的5′端)。
最終構建得到完整的表達單位，含有枯草桿菌啟動區和掛鈎在編碼信號順序其餘部分的GG36順序上的信號順序前7個胺基酸、完整的前順序和前6個成熟胺基酸(GG-KVNA的片段1)，編碼解澱粉芽孢桿菌的成熟殘基7-274(片段2+3)和終止區(包括最終成熟基因密碼子279)(片段4)的合成基因按4條渠道進行連接(如圖6所示)。
最後，將另3個單獨的突變引入該全長雜交基因的成熟編碼區。其中，第一個由精氨酸取代27位上的賴氨酸，第二個由酪氨酸取代104位上的纈氨酸，第三個由絲氨酸取代123位上的天冬醯胺。生成的質粒稱之為pBC3-RYSA。下一個實施例將介紹修飾合成基因中123位所使用的方法。類似的方法還用於修飾合成基因中的27位和104位。
實施例4123位上突變體的構建採用定點誘變進行3個表型同義突變，在實施例3的合成基因111/112密碼子上引入XhoⅠ位點(M13中的引物延長誘變)。形成的質粒pX123(圖9)用XhoⅠ和AvaⅠ和由瓊脂糖凝膠電泳洗脫分離得到含載體大片段進行消化。將互補合成寡核苷酸對接，並用pX123大片段連接後，轉移到大腸桿菌株MM294中。這些盒編碼123位上20個胺基酸，此外還含有1個破壞pX123中XhoⅠ位點之間的單個SphⅠ位點的同義突變。由大腸桿菌轉化株形成的質粒用於篩選缺失單個的SphⅠ位點。按限制分析得正的(即SphⅠ為負的)編順序，確定被亞克隆到往復性載體pBS42中所需123位突變是否存在，並轉移到枯草桿菌BG2036中進行表達。
實施例5各種+123突變體的活性由上述經過修飾的+123位突變體編碼的各個枯草桿菌蛋白酶的蛋白水解活性的測定方法是將0.04ml經過離心的培養液上清液與0.56ml1%(W/V)酪蛋白的0.1M Tris溶液(pH8.60)相混合，在37℃溫育20分鐘後，用10%三氯乙酸(TCA)沉澱使反應驟冷。在波長280nm處，由10%TCA沉澱後的上清液的吸光率測定活性。
表Ⅰ各種正常的123密碼子與Asn-123突變體的相對蛋白水解活性密碼子123 蛋白水解活性(%)Ser 116Asn 100Cys 22Gly 12Ala 9Thr 7Gln 7Val 6Glu ＜5Ile ＜5Trp ＜5Phe ＜5Asp ＜5His ＜5Leu ＜5Met ＜5Pro ＜5Tyr ＜5在最終確認編碼酶BC3-RYSA的合成基因的DNA順序的方法中，發現在78位上是脯氨酸而不是絲氨酸(粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶在該位上的胺基酸)。對該BC3-RPYA酶(在78位上是脯氨酸)測定其123位上突變的起始特性。結果示於表Ⅰ。然後通過在基因的對應位置取代合成的DNA復體，將78位上的胺基酸改為絲氨酸，形成圖10所示的DNA和胺基酸順序。
還可看到，在+123位上用Ser取代Asn，基本上提高了蛋白水解的活性。本文討論的各種枯草桿菌蛋白酶在27、78、104、123和274位上相互間的關係概括示於表Ⅱ。
表Ⅱ27 78 104123274GG36(基因組)Lys(K) Ser(S) Val(V) Asn(N) Thr(T)合成的粘性芽孢桿菌基因Lys(K) Pro(P) Val(V) Asn(N) Ala(A)解澱粉芽孢桿菌Lys(K) Ser(S) Tyr(Y) Asn(N) Ala(A)枯草桿菌蛋白酶(BPN)巳公開的枯草桿菌 Arg(R) Ser(S) Val(V) Asn(N) Thr(T)蛋白酶309本發明的最佳實施例Arg(R) Ser(S) Tyr(Y) Ser(S) Ala(A)實施例6274位上突變體的穩定性BC3-RPY(在粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中，27位上精氨酸，78位上脯氨酸，104位上酪氨酸)274位突變體的穩定性示於表Ⅲ，所列數據是在37℃下於50mM EDTA中溫育60分鐘後保持的活性百分率。
表Ⅲ在274位上的胺基酸 活性(%)亮氨酸 2%絲氨酸 79%蘇氨酸 91%纈氨酸 42%丙氨酸 43%
該位上的突變清楚地說明對酶的穩定性是有效的。雖然該位上丙氨酸的突變不如絲氨酸或蘇氨酸那樣穩定，但是在所述使用條件下，相對粘性芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶而言，該酶提供了良好的性能。在274位上的其他胺基酸也可有各種不同的用途。
實施例7洗滌劑組合物製備了下列組合物的噴霧乾燥顆粒磷酸鹽洗滌劑。
組分 重量百分比線性烷基苯磺酸鈉C12 8.45牛脂醇硫酸鈉 4.23線性烷基硫酸鈉C14″15 4.23甲苯磺酸鈉 1.00三磷酸鈉 5.60焦磷酸鈉 22.40矽酸鹽(1.6r) 5.50硫酸鈉 29.83聚丙烯酸鈉(4500MW) 1.17增白劑 0.22碳酸鈉 12.30聚乙二醇(MW8000) 0.47C12″13聚乙氧基醇(6.5)＊ 0.50溶劑油+水 加至100%蛋白酶 0.034＊除去乙醇和單乙氧基醇。
＊＊mg活性酶/g(2.0mg活性酶/g原料)。
0.1%(重量)組合物的水溶液的pH為10.0。含有本發明枯草桿菌蛋白酶突變體(圖7)的組合物與0.068mg活性酶/g產物的粘性芽孢桿菌，分別於95°F(35℃)和每加倉6格令(gpg)硬性(3∶1 Ca/Mg)下進行洗滌對比，則本發明組合物對酶敏感的顏色提供了良好的洗滌效果。
整個使用都涉及由共同的1個字母和3個字母的密碼表示各種胺基酸。這種密碼在「Protein;Structures and Molecular Proteases」(Thomas E.Creighton，eds.W.N.Freeman，N.Y.N.Y.，1983，p.3)-書中已被確定使用。
雖然以上已對本發明的最佳形式作了介紹，但是很明顯，本領域的專業人員在理解了本發明以後，在不脫離所附權利要求書限定的本發明範圍的情況下，可以對本發明進行全部的、不同的修飾和等效改進。
所有出版物均以參考文獻列入本申請文件中。
權利要求
1.具有自然界中尚未發現的胺基酸順序的羰基水解酶突變體，該胺基酸順序由前體羰基水解酶通過取代所述前體中相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+123或+274位上胺基酸殘基的不同胺基酸得到的。
2.按權利要求1的羰基水解酶突變體，其中所述前體羰基水解酶是枯草桿菌蛋白酶。
3.按權利要求2的枯草桿菌蛋白酶突變體，其中所述取代是在相當於+123位上進行的。
4.按權利要求3的枯草桿菌蛋白酶，其中在所述位上的該枯草桿菌蛋白酶突變體中的胺基酸殘基是絲氨酸。
5.按權利要求2的枯草桿菌蛋白酶突變體，其是由桿菌的枯草桿菌蛋白酶得到的。
6.具有高蛋白水解活性的突變體桿菌枯草桿菌蛋白酶，其由天然的或突變前體桿菌枯草桿菌蛋白酶得到，該蛋白酶在相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的+123位上具有被改為絲氨酸的胺基酸殘基。
7.在相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的+123位上具有絲氨酸的桿菌枯草桿菌蛋白酶。
8.具有下列胺基酸順序的突變體桿菌枯草桿菌蛋白酶
9.編碼權利要求1的羰基水解酶突變體的DNA。
10.編碼權利要求9的DNA的表達載體。
11.用權利要求10的表達載體轉化的宿主細胞。
12.能降解蛋白質的酶清潔劑組合物，包括a)表面活性劑末端;b)具有自然界中尚未發現的胺基酸順序的羰基水解酶突變體，該胺基酸順序由前體羰基水解酶通過取代所述前體中相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+123或+274位上胺基酸殘基的不同胺基酸得到的。
13.按權利要求12的組合物，其中所述羰基水解酶包括枯草桿菌蛋白酶。
14.按權利要求13的組合物，其中所述枯草桿菌蛋白酶具有下列胺基酸順序
15.按權利要求12的組合物，其中表面活性劑包括洗滌劑。
16.按權利要求15的組合物，包括噴霧乾燥的顆粒洗滌劑。
全文摘要
本文公開了由天然的或重組的非人羰基水解酶的DNA順序得到的新的羰基水解酶突變體。一般說來，該突變體羰基水解酶的獲得是通過離體修飾編碼天然的或重組的羰基水解酶的前體DNA順序，從而在前體羰基水解酶的胺基酸順序中取代1個或多個胺基酸順序。這種突變體羰基水解酶具有不同於前體水解酶的特性，尤其可用於洗滌劑組合物。被取代的胺基酸殘基相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的+123位和/或+274位。
文檔編號C12N15/10GK1052897SQ9010889
公開日1991年7月10日 申請日期1990年10月31日 優先權日1989年10月31日
發明者羅伯特·馬克·孝德威爾, 戴維·艾倫·埃斯特爾, 託馬斯·保羅·格雷卡 申請人:詹倫卡國際有限公司