厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體及其構建方法

2023-08-01 04:52:56 2

厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體及其構建方法。該重組工程菌為SEQ ID NO.1所示的鹼基序列。本發明涉及的重組工程菌，通過提高該基因的表達量及功能活性，實現厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶在厭氧氨氧化工藝上的應用。
【專利說明】厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體及其構建方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體及其構建方法。

【背景技術】
[0002] 隨著社會的發展，人民生活水平的提高，人們的飲食結構發生改變，由此產生的生 活汙水中含氮量增加，形成了低碳氮比汙水。傳統的硝化/反硝化工藝處理低碳氮比汙水 時，因碳源不足脫氮效率更低，使出水總氮含量嚴重超過排放標準。這種汙水排放到自然水 體後，使水中藻類等浮遊生物大量生長繁殖，破壞水體生態平衡。同時，因碳源不足造成在 生物脫氮過程中，硝化/反硝化過程不完全，導致亞硝酸鹽大量累積。當含大量亞硝酸鹽的 汙水排放到自然水體中時，亞硝酸鹽濃度積累到〇. lmg/L後，將對水體中魚、蝦、蟹等產生 危害。其與血液中的攜氧蛋白結合，而使之失去攜帶氧氣的功能，從而表現為缺氧症狀。當 亞硝酸鹽通過水產動物進入食物鏈被誤食後，在胃酸作用下，與蛋白質分解產物二級胺反 應生成亞硝胺。此外，胃內的硝酸還原菌，也能使亞硝酸鹽與胺類結合成亞硝胺。亞硝胺具 有強烈的致癌作用，主要引起食管癌、胃癌、肝癌和大腸癌等，危害人體健康。由亞硝酸鹽引 起食物中毒的機率較高。攝入0.3-0. 5g的亞硝酸鹽即可引起中毒甚至死亡。因此，去除低 碳氮比汙水中的亞硝酸鹽迫在眉睫。
[0003] 厭氧氨氧化（Anammox)工藝，是由荷蘭Delft理工大學根據厭氧氨氧化原理研究 開發的一種新型汙水生物脫氮工藝。其作用機理是，在厭氧或者缺氧條件下，厭氧氨氧化微 生物以NCV-N為電子受體，將NH/-N氧化為氮氣的生物過程。該工藝核心厭氧氨氧化細菌 為自養型，無需外加碳源，只需無機碳源CO 2，避免了低碳氮比汙水處理過程中有機碳源不 足的缺陷。同時，Jensen M M和GUven D等研究發現，Anammox菌可成功的氧化丙酸，同時 葡萄糖、甲酸、丙氨酸不影響Anammox過程。這為Anammox工藝處理低碳氮比汙水的可行性 提供了理論支持。
[0004] 在厭氧氨氧化細菌中，各種酶機制的相互作用在整個過程中起關鍵作用。其中，亞 硝酸鹽還原酶GiA)將汙水體系中亞硝酸鹽還原，是整個厭氧氨氧化反應的關鍵步驟。因 此，近年對Anammox菌中酶的研究日益增多，Meng L等從分子生物學角度出發研究發 現，酶可作為檢測Anammox菌的新型功能性生物標記物。雖然厭氧氨氧化反應去除亞 硝酸鹽前景可觀，但厭氧氨氧化細菌對生長環境要求苛刻，存活率低，並且不能富集培養純 厭氧氨氧化菌，導致厭氧氨氧化反應的運用停滯不前。基因重組方法可有效解決厭氧氨氧 化細菌富集難問題，同時，重組細菌酶基因的高效表達可實現亞硝酸鹽的高效去除。 解除汙水中亞硝酸鹽對人體的潛在危害。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的之一在於提供一種厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體。
[0006] 本發明的目的之二在於提供該厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體的構建方 法。
[0007] 為達到上述目的，本發明採用如下技術方案： 一種厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體，其特徵在於該厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還 原酶表達載體為SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列。
[0008] -種宿主細胞，其特徵在於該宿主細胞包含上述的厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶 表達載體。
[0009] -種構建上述的厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體的方法，其特徵在於該方 法的具體步驟為： a. 厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶的DNA作為模板進行PCR擴增，所用的引物為： 正向引物 AnnirS379F :5，-TCTATCGTTGCATCGCATTT-3，， 反向引物 nirS821R :5'_ GGATGGGTCTTGATAAACA-3'； b. 將步驟a所得的PCR產物經DNA連接酶4°C過夜連接到pGEM-T載體，得到厭氧氨氧 化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體。
[0010] 上述的PCR擴增的具體步驟為： a. 所用的PCR擴增的體系為：每50ml反應體系中含： b. PCR擴增的反應條件為： 94 °C 5min

【權利要求】
1. 一種厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體，其特徵在於該厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽 還原酶表達載體為SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列。
2. -種宿主細胞，其特徵在於該宿主細胞包含根據權利要求1中所述的厭氧氨氧化菌 亞硝酸鹽還原酶表達載體。
3. -種構建根據權利要求1所述的厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體的方法，其 特徵在於該方法的具體步驟為： a. 厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶的DNA作為模板進行PCR擴增，所用的引物為： 正向引物 AnnirS379F :5，-TCTATCGITGCATCGCAm-3，， 反向引物 nirS821R :5'_ GGATGGGTCTTGATAAACA-3'； b. 將步驟a所得的PCR產物經DNA連接酶4°C過夜連接到pGEM-T載體，得到厭氧氨氧 化菌亞硝酸鹽還原酶表達載體。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的PCR擴增的具體步驟為： a. 所用的PCR擴增的體系為：每50ml反應體系中含： b. PCR擴增的反應條件為： 94 °C 5min
【文檔編號】C12N15/70GK104498518SQ201410749857
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】陸永生, 陳學萍, 楊興興, 劉冬秀, 錢光人 申請人:上海大學