一種高粱原生質體酶解製備法的製作方法
2023-08-11 04:27:46 3
專利名稱：一種高粱原生質體酶解製備法的製作方法
技術領域：
一種高粱原生質體酶解製備法屬於生物技術領域，更具體的說是一種利用細胞壁裂解酶來裂解高粱幼葉細胞壁來製備大量原生質體的方法。
背景技術：
原生質體是指除去細胞壁的細胞或一個被質膜包圍的裸露細胞。製備大量的原生質體在植物的基因功能研究方面有非常重要的作用。目前高粱原生質體的製備方法尚未見報導
發明內容
本發明的目的是採用一種酶解的方法大量製備高粱原生質體，製備的原生質體可以用於聞梁轉基因、基因的瞬時表達等方面。本發明是這樣實現的1. 一種高粱原生質體酶解製備法的特徵在於，以高粱嫩葉為對象，利用細胞壁消化酶來消化細胞壁釋放原生質體，它包括①高粱幼苗製備，②幼葉處理，③酶解，④過濾殘渣，⑤原生質體懸浮5個步驟。2.所述的5個步驟的具體過程如下
①高粱幼苗製備選取飽滿的高粱種子，種入營養缽，28°C培養10天。②幼葉處理剪取高粱的幼葉2g左右，用單面刀片將葉片切成Imm長。③酶解將切好的葉片放入到已加入IOmL酶解液的三角瓶中，錫箔紙蓋好瓶口放入28°C搖床，轉速80rpm，酶解3小時。倒掉酶解液，加入新的酶解液10ml，快速搖勻30秒，再放入28°C搖床，轉速80rpm，酶解I小時。(酶解液配方0. 645M甘露醇，IOmM氯化鉀，ImM氯化鈣，8mM 2-嗎啉乙磺酸，PH5. 5,0. 3%纖維素酶和O. 6%的離析酶R-10)。④過濾殘渣用200目尼龍布過濾解離後的葉片殘渣，濾液轉入50mL離心管，90 G離心5分鐘。⑤原生質體懸浮倒掉上清液,加入500 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質體，即可得大量的原生質體細胞(懸浮液配方0. 6Μ甘露醇，15mM氯化I丐，4mM 2-嗎啉乙磺酸，PH5. 7)。本發明的有益效果利用本方法製備的高粱原生質體量大，且製得的原生質體細胞完整性好，細胞死亡少，方法簡單。
具體實施例方式 下面結合具體實例對本發明進行進一步的描述。實施例1 :高粱Tx623B原生質體的製備1.高粱幼苗製備選取飽滿的高粱品系TX623B的種子，種入營養缽，28°C培養10天。2.幼葉處理剪取高粱的幼葉2g，將葉片切成Imm長。3.酶解將切好的葉片放入到已加入IOmL酶解液的三角瓶中，錫箔紙蓋好瓶口放Λ 28°C搖床，轉速80rpm，酶解3小時。倒掉酶解液，加入新的酶解液10ml，快速搖勻30秒，再放入28°C搖床，轉速80rpm，酶解I小時。(酶解液配方0. 645M甘露醇，IOmM氯化鉀，ImM氯化鈣，8mM 2-嗎啉乙磺酸，PH5. 5,0. 3%纖維素酶和O. 6%的離析酶R-10)。4.過濾殘渣用200目尼龍布過濾解離後的葉片殘渣，濾液轉入50mL離心管，90G離心5分鐘。5.原生質體懸浮倒掉上清液,加入500 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質體，即可得大量的原生質體細胞(懸浮液配方0. 6Μ甘露醇，15mM氯化I丐，4mM 2-嗎啉乙磺 酸，PH5.7)。經檢測，通過以上步驟在得到的原生質體數量達到107個左右，細胞完整性好，完全滿足實驗需求。
權利要求
1.一種高粱原生質體酶解製備法的特徵在於，以高粱嫩葉為對象，利用細胞壁消化酶來消化細胞壁釋放原生質體，它包括①高粱幼苗製備，②幼葉處理，③酶解，④過濾殘渣，⑤原生質體懸浮5個步驟。
2.根據權利要求1所述的高粱原生質體酶解製備法，其特徵在於，所述的高粱幼苗製備的做法是選取飽滿的高粱種子，種入營養缽，28°C培養10天。
3.根據權利要求1所述的高粱原生質體酶解製備法，其特徵在於，所述的幼葉處理的做法是剪取高粱的幼葉2g左右，將葉片切成Imm長。
4.根據權利要求1所述的高粱原生質體酶解製備法，其特徵在於，所述的酶解的做法是將切好的葉片放入到已加入IOmL酶解液的三角瓶中，錫箔紙蓋好瓶口放入28°C搖床，轉速80rpm，酶解3小時。
5.倒掉酶解液，加入新的酶解液10ml，快速搖勻30秒，再放入28°C搖床，轉速80rpm，酶解I小時。
6.根據權利要求1所述的高粱原生質體酶解製備法，其特徵在於，所述的過濾殘渣的做法是用200目尼龍布過濾解離後的葉片殘渣，濾液轉入50mL離心管，90 G離心5分鐘。
7.根據權利要求1所述的高粱原生質體酶解製備法，其特徵在於，所述的原生質體懸浮的做法是倒掉上清液，加入500 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質體，即可得大量的原生質體細胞。
全文摘要
一種高粱原生質體酶解製備法，屬於生物技術領域。高粱種子出苗後，將高粱幼葉切成一定大小，利用酶解液對幼葉細胞壁進行酶解，從而分離出大量高粱原生制體的方法。本方法簡便，操作容易，效果好。
文檔編號C12N5/04GK103013904SQ20131001903
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月19日 優先權日2013年1月19日
發明者李傑勤, 王麗華, 詹秋文, 張俊 申請人:安徽科技學院