乳製品中微晶纖維素的檢測方法及其應用的製作方法
2023-07-18 11:48:51 1
專利名稱：：乳製品中微晶纖維素的檢測方法及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於食品質量安全檢測
技術領域：
，具體涉及應用透析處理、纖維素酶水解、還原糖測定的流程對乳製品中的微晶纖維素進行檢測，並對乳製品中微晶纖維素含量進行定量。二.
背景技術：
：微晶纖維素是由天然植物原料經稀酸水解成a-纖維素後，再經部分解聚後形成的結晶狀纖維，其本質是葡萄糖單體通過P-l，4糖苷鍵結合形成的直鏈多糖，聚合度一般不超過400。微晶纖維素在製藥和食品工業中被廣泛使用。晶體顆粒大小為O.l-5ym的膠態微晶纖維素可分散在乳飲料中形成三維網狀結構，在不影響乳飲料黏度和流變性前提下提高乳飲料的穩定性，使之獲得與純牛奶類似的口感並起到脂肪替代作用，因此常被用作含乳飲料的穩定劑和脂肪替代物。然而，一些不法廠商在巴氏殺菌乳等純牛奶製品中也通過添加微晶纖維素的方法維持產品的口感和穩定性，從而彌補牛奶純度和品質的缺陷。因此，建立乳製品尤其是巴氏殺菌乳中微晶纖維素的檢測方法對乳製品質量控制具有重要的實踐意義。目前，包括各國藥典、JECFA和FCC在內的所有標準中關於微晶纖維素檢測和定量的唯一方法是使用硫酸重鉻酸鉀氧化_硫酸亞鐵銨滴定的氧化還原滴定法。然而，這種方法主要適用於藥品製劑中高純度微晶纖維素的定量，乳製品成分複雜，其中多種還原性物質如還原酶類、巰基蛋白和乳糖等均可被硫酸重鉻酸鉀氧化而對微晶纖維素的測定產生幹擾，因此，此方法由於特異性過低而不能用於乳製品中微晶纖維素的檢測。目前，乳製品中微晶纖維素的檢測方法尚為空白。三.
發明內容本發明需要解決的問題是利用透析處理、纖維素酶水解加還原糖測定的方法流程，對乳製品尤其是巴氏殺菌乳中的微晶纖維素進行檢測，從而彌補乳製品中微晶纖維素檢測方法的空白，為乳品的質量控制和安全檢測探索新的途徑。本發明中，我們從微晶纖維素的結構特徵出發，利用特異性地作用於P-l，4糖苷鍵的纖維素酶對巴氏殺菌乳中的微晶纖維素進行水解，通過測定反應後牛奶中還原糖水平的變化檢測微晶纖維素，為乳製品中微晶纖維素的檢測探索了一種可靠、靈敏、便捷、安全的新方法。本發明的技術方案包括1.對牛奶等乳製品的透析處理，以降低其還原糖本底水平。2.牛奶中纖維素酶水解微晶纖維素的活力、纖維素酶最佳用量以及最佳酶反應時間的確定，建立纖維素酶法測定乳製品中微晶纖維素的方法流程，並考察方法的特異性和靈敏度。3.根據以上方法流程對模擬樣品的測定結果，總結乳製品中微晶纖維素檢測的判定標準和大致定量的經驗公式。檢測方法流程見附圖l。1.將巴氏殺菌乳200mL於4t:對去離子水5000mL透析24h，沉澱蛋白後定容，使用鹼性酒石酸銅法滴定分別測定透析前後的還原糖水平。結果表明，透析前後巴氏殺菌乳的還原糖水平(以葡萄糖計)分別為25.0mg/mL和0.4mg/mL。因此，通過透析可使牛奶中的還原糖降低了98%以上，基本去除了牛奶中還原糖的本底值，從而可達到增大取樣量、提高檢測靈敏度的目的。2.將經透析處理的巴氏殺菌加入過量的乳微晶纖維素標準品和不同濃度的纖維素酶溶液，PH4.8、5(TC水浴24h，在含10mL牛奶的酶反應體系中，不同濃度的纖維素酶水解過量微晶纖維素24h後產生還原糖的總量見附圖1。由圖中可見，在纖維素酶使用量從5mg到100mg之間時，酶量與還原糖的產生總量呈顯著的線性關係，表明纖維素酶在牛奶中活力穩定。經計算，纖維素酶活力在此區間的平均值為139士10U。由於乳製品中加入微晶纖維素的量一般在1.5-3g/L之間，為了既保證牛奶中的微晶纖維素被充分水解，又結合成本上的考慮，因此確定最佳的纖維素酶使用量為50mg。在含10mL透析後牛奶的反應體系中加入過量的乳微晶纖維素標準品和50mg纖維素酶，PH4.8、5(TC水浴，反應體系中還原糖總量隨時間變化曲線見附圖2。在反應的最初24h內，還原糖的產生與時間基本呈線性關係，24h後還原糖生成速度顯著降低。因此，確定24h為最佳反應時間。在透析後的牛奶原奶中加入不同濃度的微晶纖維素標準品，使用上述最佳條件對之進行水解，即50mg纖維素酶，PH4.8、5(TC水浴24h，測定酶解前後還原糖水平的變化。纖維素酶作用後含不同濃度微晶纖維素的牛奶中還原糖水平的變化見表1(以5mL濾液中的還原糖毫克數表示)。由表中可見，當微晶纖維素含量在O.5mg/mL以上時，酶作用後牛奶中還原糖水平均顯著性升高(P0.05)，因此，本方法具有針對外源微晶纖維素的特異性。表1纖維素酶作用後含不同濃度微晶纖維素的牛奶中還原糖的變化tableseeoriginaldocumentpage4反應結束後，含10mL牛奶的反應體系定容至50mL，測定每5mL濾液所含還原糖水平的變化。*:與未加酶的反應體系相比，還原糖水平顯著性升高(P0.5mg/mL);當微晶纖維素含量在1.5_5.Omg/mL之間時，我們總結了以下經驗公式對微晶纖維素進行初步定量微晶纖維素含量(mg/mL)"5mL濾液中還原糖升高的毫克數X1.5本發明的有益效果是本發明是目前乳製品中微晶纖維素檢測的唯一方法，彌補了乳製品尤其是巴氏殺菌乳中微晶纖維素檢測手段的缺失，同時還具有成本較低、檢測周期較短、操作方便等有益效果，本發明所述方法已在乳製品質量控制和質量安全檢測中應用。四.圖1纖維素酶法檢測乳製品中微晶纖維素流程圖。圖2含lOmL牛奶的反應體系中纖維素酶用量與產生還原糖總量的關係曲線。反應條件為PH4.8、50。C水浴24h。圖3含10mL牛奶的反應體系中使用50mg纖維素酶時還原糖產生的時間曲線。反應條件為PH4.8、50°C。五.具體實施例方式1.實驗材料與試劑纖維素酶購自美國Worthington公司；透析膜(截留分子量14000)購自美國Millipore公司；微晶纖維素標準品購自美國FMC公司；鹼性酒石酸銅甲乙液、乙酸鋅溶液、亞鐵氰化鉀溶液、葡萄糖標準溶液均按GB/T5009.7-2008配製；PBS緩衝液按GB/T601-2002配製；乙酸_乙酸鈉緩衝液(5X，8)為乙酸鈉4.92g加冰乙酸2.4mL加雙蒸水定容至200mL。所有化學品均為分析純。牛奶原奶採自南京衛崗養殖場。2.透析前後牛奶原奶還原糖水平的變化將牛奶原奶200mL於4。C對去離子水5000mL透析24h，每8h更換透析液。分別取透析前後的原奶各lOmL，加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各lOmL後，未透析原奶定容至250mL，透析後原奶定容至50mL。過濾除去蛋白沉澱，分別取濾液5mL加入10mL鹼性酒石酸銅甲乙液l:l混合液中，在沸騰狀態下用葡萄糖標準溶液滴定至藍色消失，計算透析前後牛奶中還原糖(以葡萄糖計)的含量。3.牛奶中纖維素酶水解微晶纖維素的活力測定用PBS緩衝液將纖維素酶配製成濃度為100mg/mL的溶液。在10mL透析後的原奶中加入微晶纖維素標準品200mg和乙酸-乙酸鈉緩衝液2mL後，分別添加纖維素酶溶液0、5、10、20、50、100iig，充分混勻，5(TC水浴24h，按照前述方法沉澱蛋白後定容至50mL並過濾，測定每5mL濾液中的還原糖水平，並根據濾液總體積計算還原糖總量。根據酶用量和還原糖總量升高數值計算牛奶中纖維素酶水解微晶纖維素的活力，繪製含10mL原奶的反應體系中兩者間變化的動力學曲線，確定最佳酶使用量。1酶活力單位定義為lg纖維素酶每分鐘水解產生lPg還原糖。4.最佳酶反應時間的確定在5份各10mL透析後的原奶中加入微晶纖維素標準品200mg和乙酸-乙酸鈉緩衝液2mL後，再加入纖維素酶50iig，充分混勻，5(TC水浴，分別於反應4、8、24、48、72小時後取一管樣品，按上述方法測定還原糖總量。5.纖維素酶法測定牛奶中微晶纖維素的檢測靈敏度和特異性5在各20mL透析後的原奶中加入乙酸_乙酸鈉緩衝液4mL後，分別加入微晶纖維素標準品0、10、20、40、100mg，等分為兩管，其中10mL再加入500纖維素酶溶液，另10mL不加酶，充分混勻，5(TC水浴24h，沉澱蛋白後定容至50mL並過濾，按前述方法測定5mL濾液中的還原糖含量，探究檢測的靈敏度和特異性。重複上述實驗6次，計算每5mL濾液中還原糖的均數±標準差用以統計學分析，並總結根據還原糖變化估算微晶纖維素含量的經驗公式。6.市售巴氏殺菌乳與模擬乳製品樣品中微晶纖維素的盲樣檢測我們使用上述方法流程對2種市售巴氏殺菌乳(光明金裝倍醇、衛崗)和4份模擬牛奶樣品(其中1份未加微晶纖維素，另兩份分別加入微晶纖維素標準品1.7和3.lmg/mL)中的微晶纖維素進行盲樣檢測，根據本發明所總結的判定標準對樣本中的微晶纖維素進行陰陽性判定，並使用經驗公式對陽性樣品中的微晶纖維素含量進行估算，並將檢測結果與實際情況進行比對。結果表明，兩種市售的巴氏殺菌乳和未添加微晶纖維素的原奶檢測結果均呈陰性，添加了微晶纖維素的模擬乳製品樣品檢測結果均呈陽性；利用經驗公式對呈陽性的模擬樣品中微晶纖維素大致定量的數值均在實際添加值的±20%以內。以上結果表明本方法的實用性良好，檢測結果與乳製品中微晶纖維素的實際添加情況吻合，可用於乳製品中微晶纖維素的定性檢測和定量。權利要求一種乳製品中微晶纖維素的檢測方法，其特徵是由以下步驟構成(1)對可能含有微晶纖維素的巴氏殺菌乳、含乳飲料進行透析處理；(2)應用纖維素酶對上述處理後的乳製品進行水解；(3)測定水解前後乳製品中還原糖水平的變化，從而對牛奶中的微晶纖維素進行定性檢測和定量，按照本方法對乳製品中微晶纖維素陽性的判定標準為將含10mL牛奶的酶反應體系酶解後定容至50mL並過濾，5mL濾液中的還原糖水平較未加酶的反應體系升高0.6mg以上即可判定微晶纖維素陽性，乳製品中微晶纖維素的定量公式當微晶纖維素含量在1.5～5.0mg/mL之間時，每毫升乳製品中微晶纖維素的毫克數≈5mL濾液中還原糖升高的毫克數×1.5。2.根據權利要求1所述乳製品中微晶纖維素的檢測方法在乳製品質量控制和質量安全檢測中的應用。全文摘要本發明屬於食品質量安全檢測
技術領域：
。具體涉及應用透析處理、纖維素酶水解、還原糖測定的流程對乳製品中的微晶纖維素進行檢測，並對乳製品中微晶纖維素含量進行定量。檢測方法流程見附圖。結果表明，透析處理可將牛奶中的還原糖水平降低98％以上，減少了牛奶中還原糖的本底值；纖維素酶在牛奶中活力穩定，可有效地水解微晶纖維素產生還原糖；通過測定水解前後還原糖水平的變化可準確地對牛奶中的微晶纖維素進行定性檢測，其檢測靈敏度可達0.5mg/ml以下。根據本發明總結的檢驗公式可對乳製品中的微晶纖維素進行大致定量，定量結果均在實際添加值的±20％以內。以上結果表明，使用本發明提供的纖維素酶法可有效地對乳製品中的微晶纖維素進行定性檢測和大致定量，為乳製品尤其是巴氏殺菌乳的質量控制提供了新方法途徑。文檔編號G01N33/02GK101726565SQ200910264058公開日2010年6月9日申請日期2009年12月29日優先權日2009年12月29日發明者凌睿,吳寶慶,張馳,楊軍申請人:南京市產品質量監督檢驗院