一種基於雙酶偶聯高通量檢測d-阿洛糖的新方法

2023-07-11 16:22:41

一種基於雙酶偶聯高通量檢測d-阿洛糖的新方法
【專利摘要】本發明涉及一種基於雙酶偶聯反應的高通量檢測D-阿洛糖的新方法。具體涉及利用吡喃糖氧化酶和過氧化物酶偶聯，檢測D-阿洛糖。該方法既可用於液體培養基中反應產物D-阿洛糖的檢測，也可用於檢測固體培養基中反應產物D-阿洛糖的生成。當用於液體培養基的檢測時，反應產物與N-（2-羥基-3-磺丙基）-3，5-二甲氧基苯胺鈉（HSDA）作用產生藍色水溶性醌類物質，利用96孔酶標板在583nm處讀取吸光值。吸光值與其濃度成線性關係，能夠根據標準曲線計算濃度，並利用96孔酶標板進行高通量檢測。當該方法用於固體培養基中D-阿洛糖的檢測時，反應產物與二氨基聯苯胺(DAB)作用生成不溶於水的褐色吩嗪聚合體，利用此顯色反應可在培養皿中挑出陽性菌落。
【專利說明】-種基於雙酶偶聯高通量檢測D-阿洛糖的新方法
[0001]

【技術領域】 本發明屬於糖轉化工業微生物的篩選和開發利用領域，特別涉及一種基於雙酶偶聯反 應的高通量檢測D-阿洛糖的新方法。
[0002] 技術背景 高通量篩選的意義 近年來，隨著系統代謝工程與合成生物學的日新月異的發展，以及蛋白質構象預測、結 構分析和定點突變方法研究的不斷深入，加速了人們利用微生物以及微生物來源的關鍵酶 的步伐。
[0003] 然而，由於生物體的複雜性和人類認識的局限性，除了少數成功的實例外，設計合 成的工程菌株經常不能完全達到高效的生產要求，企圖通過理性設計達到改善生產關鍵酶 性能的目的也仍然非常困難。因此，需要通過誘變進化的方法進一步彌補理性設計的不足， 而非理性的誘變則通常需要結合高效高通量的篩選。只有建立有效的高通量篩選方法，在 先進的現代自動化技術和儀器設備幫助下，才能大大突破人工篩選在速度、效率和標準化 等方面的限制。
[0004] 阿洛糖的生理活性和篩選意義 在碳水化合物研究領域中，稀少糖是一類重要的研究內容。儘管在自然界中含量極少， 但稀少糖卻在膳食、保健、醫藥等領域中發揮著非常重要的功能。D-阿洛糖是一種功能廣泛 的稀少糖。它可以顯著抑制中性分葉核白細胞的生成，因此能夠在器官和組織移植中作為 一種免疫抑制劑顯示重要功能。此外，D-阿洛糖還能夠有效抑制腫瘤細胞的增生繁殖，並 誘導卵巢癌細胞0VCAR-3的凋亡。D-阿洛糖的衍射物因其結構特點在許多具有生物活性的 天然化合物、糖類衍射物、核苷類似物及非糖化合物的合成中應用廣泛。
[0005] D-阿洛糖的生物轉化目前主要是以D-阿洛酮糖為底物，利用L-鼠李糖異構酶將 D-阿洛酮糖轉化為D-阿洛糖。然而，目前發現的L-鼠李糖異構酶大多催化效率不高，作用 條件嚴苛，並不適用於工業化大生產。篩選和誘變篩選表達高效L-鼠李糖異構酶或其生產 菌株因此極為重要。
[0006] 傳統檢測方法的局限 傳統定性或定量檢測D-阿洛糖的方法非常有限。主要的檢測方法為液相色譜法和以 半胱氨酸咔唑法為代表的化學方法。液相色譜法操作繁瑣，儀器、耗材的成本高，示差檢測 的靈敏度也比較低，如果檢測的樣品比較多，也會存在保留時間的偏移等問題。半胱氨酸咔 唑的化學檢測方法需要濃硫酸試劑，操作比較危險，而且對樣品的純度要求嚴格，受其他物 質的幹擾比較多。因此，研究建立簡便、快速、準確、處理量大和應用廣泛的分析方法，可以 促進生物法生產D-阿洛糖的理論研究，加快其產業化進程，對L-鼠李糖異構酶及其生產菌 株的快速進化也能起到很好的促進作用。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的： 本發明的目的在於提供一種基於雙酶偶聯反應的高通量檢測D-阿洛糖的新方法。通 過吡喃糖氧化酶和過氧化物酶偶聯的方法測定D-阿洛糖，高通量篩選目標微生物或酶。與 傳統篩選方法相比，基於雙酶偶聯反應的高通量篩選方法具有成本低、效率高、目的性強， 能夠批量操作的優點，能夠從廣泛的自然界中篩選性能優良的菌株。
[0008] 本發明的思路： 利用吡喃糖氧化酶和過氧化物酶偶聯的方法，測定D-阿洛糖和的含量。該方法包含兩 個方面內容。
[0009] -方面，在氧氣存在條件下，D-阿洛糖被其吡喃糖氧化酶氧化，生成過氧化氫，形 成的過氧化氫與4-安替比林和HSDA在過氧化氫酶作用下形成一種水溶性的藍色醌類物 質，在583nm處有特徵吸收值。藉助96孔黑色微孔板和酶標儀，篩選高產D-阿洛糖的菌 株或高效的催化用酶，為基礎和應用研究提供寶貴的菌種和酶資源。
[0010] 另一方面，D-阿洛糖被吡喃糖氧化酶作用形成的過氧化氫與DAB作用生成不溶於 水的褐色吩嗪聚合體，可以用於固體培養基中指示D-阿洛糖的生成。同樣可以用於高效菌 株和酶的篩選。
[0011] 本發明的技術路線： 技術路線1 :液體反應液中 (1) 將固體培養基上長出的單菌落或者一種純化後的酶轉入到含有液體培養基和轉 化底物的96深孔培養板中，每個孔對應一個單菌落或一種酶，用矽膠蓋蓋好，培養0-24小 時； (2) 將96深孔培養板利用冷凍離心機進行離心，去除菌體； (3) 將96深孔培養板中的上清液與HSDA、4-安替比林、吡喃糖氧化酶和過氧化物酶在 96孔板中反應，37 °C保溫20分鐘； (4) 將反應結束的96孔板板利用酶標儀測定583nm處的光吸收值，並將測得的吸收值 與標準曲線進行比對，計算D-阿洛糖的濃度。
[0012] 技術路線2 :固體培養基上 (1) 利用培養基將待篩選樣品進行活化培養12-24小時； (2) 將富集培養的混合菌利用無菌水進行稀釋，獲得單菌落，塗布到表面有滅菌醋酸纖 維素薄膜的固體培養基上，培養6-18小時； (3) 將長有單菌落的醋酸纖維素薄膜揭下置於一乾淨的培養皿中； (4) 製備轉化顯色膠：含有DAB、吡喃糖氧化酶、過氧化物酶和轉化底物的瓊脂糖凝膠； (5) 將溶融態的轉化顯色膠倒入步驟（7)所得的培養皿裡，轉化顯色膠冷凝後覆蓋在醋 酸纖維素薄膜上，37°C保溫，實時觀察膠上的褐變效應。
[0013] 本發明的優點： (1) 效率高，吡喃糖氧化酶和過氧化物酶偶聯能夠快速檢測D-阿洛糖的含量； (2) 通量高，96深孔培養板和96孔板板結合酶標儀一起使用，大大提高了篩選的速度， 固體培養基上的篩選也很直觀，一個平板可以同時篩選上百個單菌落； (3) 操作簡便，檢測過程不需要任何危險試劑的參與，反應條件溫和，顯色結果靈敏； (4) 成本低，能夠以較低成本獲得大量菌種。 具體實施例
[0014] 實施例1 : 步驟：在96孔板上依次加入lg/L D-阿洛糖50 μ L，150 μ L試劑A，吡喃糖氧化酶和 過氧化氫酶液100 μ L，總體積300 μ L。對照組加10g/L D-阿洛酮糖。設置酶標儀溫度為 37°C，讀取0_21min的583(nm)光吸收值。從時間變化圖（附圖1)中可以看出，隨著時間的 增加，光吸收值增加，因此可以設定一個合適的時間觀測點，如反應開始後20min為檢測的 時間點。此外，對照組的光吸收值一直非常低，可以認為，反應底物D-阿洛酮糖對檢測無幹 擾。
[0015] 實施例2 :利用吡喃糖氧化酶和過氧化物酶偶聯的方法測D-阿洛糖的標準曲線。
[0016] 步驟：在96孔板上依次加入0、0· 2、0· 4、0· 6、0· 8和L Og/L D-阿洛糖50μ L， 150 μ L試劑Α,吡喃糖氧化酶和過氧化氫酶液100 μ L,總體積300 μ L。設置酶標儀溫度為 37°C，讀取20min的583(nm)光吸收值（附圖2)。R2=0.997,說明D-阿洛糖在一定範圍內 與測定的Ab(583nm)值呈顯著線性關係。
[0017] 實施例3 :液體反應體系中篩D-阿洛糖的生產菌 步驟：固體培養基上培養含有待篩選L-鼠李糖異構酶及其突變體的大腸桿菌，將得到 的單菌落轉接到含有液體培養基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)和底物10g/L的D-psicose 的96深孔培養板中，每個孔接種一個單菌落，用矽膠蓋蓋好，37°C培養12小時；將96深孔 培養板離心，取上清液50 μ L轉入96孔板中，加入含HSDA、4-安替比林的溶液A以及含吡喃 糖氧化酶和過氧化物酶的溶液，37°C保溫20分鐘，再在583nm測光吸收。對照組用液體培 養基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)代替培養液上清參加反應，測583nm的光吸收（附圖3)。 對照組的光吸收值在21min內一直很低，可以認為液體培養基（LB Amp IPTG)對檢測無幹 擾。
[0018] 實施例4 :固體培養基上的D-阿洛糖的生產菌的篩選 步驟：在固體培養基LB(含抗生素 Amp和IPTG)表面覆蓋一層滅過菌的硝酸纖維素 薄膜，並在薄膜上塗布含有待篩選L-鼠李糖異構酶及其突變體的大腸桿菌，待單菌落長出 後，將膜揭下置於一乾淨的培養皿中；預製溶融狀態的含DAB、轉化底物D-阿洛酮糖、吡喃 糖氧化酶和過氧化物酶的顯色膠，覆蓋到長有單菌落的硝酸纖維素薄膜上冷凝，至於37°C 的培養箱中實時觀測上述膜上各菌落生產D-阿洛糖的進程(附圖4)。
[0019] 實施例5 :液體反應體系中篩D-阿洛酮糖-3-差向異構酶和L-鼠李糖異構酶的 雙酶共表達工程菌 步驟：構建D-阿洛酮糖-3-差向異構酶和L-鼠李糖異構酶的雙酶共表達工程菌，以 D-果糖為底物，轉化生產D-阿洛糖。將固體培養基上培養含有待篩選D-阿洛酮糖-3-差 向異構酶和L-鼠李糖異構酶的雙酶共表達工程菌，將得到的單菌落轉接到含有液體培養 基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)和底物100g/L的D-果糖的96深孔培養板中，每個孔接種 一個單菌落，用矽膠蓋蓋好，37°C培養12小時；將96深孔培養板離心，取上清液50 μ L轉入 96孔板中，加入含HSDA、4-安替比林的溶液Α以及含吡喃糖氧化酶和過氧化物酶的溶液， 37°C保溫20分鐘，再在583nm測光吸收。對照組用液體培養基（LB添加抗生素 Amp、IPTG 和100g/L的D-果糖)代替培養液上清參加反應，測583nm的光吸收（附圖5)。對照組的光 吸收值在21min內一直很低，可以認為液體培養基對檢測無幹擾。
[0020] 附圖表說明： 附圖1 :D-阿洛糖（D-all〇se)和D-阿洛酮糖（D-psicose)吸光隨時間變化的曲線 附圖2 :雙酶偶聯法檢測D-阿洛糖的標準曲線 附圖3 :液體培養基（LB Amp IPTG)的吸光值隨時間的變化曲線 附圖4 :固體培養基上的D-阿洛糖的生產菌的篩選 附圖5 :液體培養基（LB Amp IPTG D-果糖100g/L)的吸光值隨時間的變化曲線。
【權利要求】
1. 一種利用吡喃糖氧化酶和過氧化物酶偶聯反應的檢測D-阿洛糖的高通量篩選新方 法，當用於液體培養基時，步驟如下： (1) 將單菌落或純化後的酶轉入含轉化底物的96深孔培養板中； (2) 將96深孔培養板利用冷凍離心機在合適的條件下離心，取其上清液進行測定； (3) 利用雙酶偶聯的方法，在96孔板板中結合試劑A測定上述上清液中D-阿洛糖的含 量。
2. -種利用吡喃糖氧化酶和過氧化物酶偶聯反應的檢測D-阿洛糖的高通量篩選新方 法，當用於固體培養基時，步驟如下： (1) 將菌群塗布到固體培養基表面的硝酸纖維素薄膜上，待單菌落長出後，將膜揭下置 於一乾淨的培養皿中； (2) 預製溶融狀態的含試劑B、轉化底物以及雙酶的顯色膠，接著覆蓋到長有菌落的硝 酸纖維素薄膜上冷凝，利用雙酶偶聯的方法實時觀測上述膜上各菌落生產D-阿洛糖的進 程。
3. 按權利要求1中所述的方法，其特徵是：所述的雙酶是吡喃糖氧化酶和過氧化物酶。
4. 按權利要求1中所述的方法，其特徵是：結合試劑A是4-氨替比林和HSDA的磷酸 鹽緩衝溶液(包括但並不局限於)。
5. 按權利要求1中所述的方法，其特徵是：待試劑A、吡喃糖氧化酶和過氧化物酶的雙 酶以及樣品加入到深孔板中後，37°C下反應20min。
6. 按權利要求1中所述的方法，其特徵是：所述的測定條件為：在583nm波長下測光吸 收(包括但並不局限於)。
7. 按權利要求2中所述的方法，其特徵是：所述的雙酶是吡喃糖氧化酶和過氧化物酶。
8. 按權利要求2中所述的方法，其特徵是：結合試劑B是DAB的磷酸鹽緩衝溶液(包括 但並不局限於)。
9. 按權利要求2中所述的方法，其特徵是：待試劑、吡喃糖氧化酶和過氧化物酶的雙酶 以及樣品加入到深孔板中後，37°C下反應l_24h。
【文檔編號】C12Q1/28GK104195219SQ201410472672
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】柏瑋, 朱玥明, 李星碩, 門燕, 孫媛霞 申請人:中國科學院天津工業生物技術研究所