單純皰疹病毒抗體唾液快速檢測試紙條的製作方法

2023-07-11 18:22:51

專利名稱：單純皰疹病毒抗體唾液快速檢測試紙條的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物診斷技術領域，尤其涉及一種單純皰疹病毒抗體唾液快速檢測試紙條。
背景技術：
單純皰滲是由DNA病毒的單純皰滲病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)所致。人類單純皰滲病毒分為兩型，即單純皰滲病毒I型(HSV-I )和單純皰滲病毒II型(HSV-II )。
I型主要引起生殖器以外的皮膚、黏膜(口
腔黏膜)和器官(腦)的感染。n型主要引起生殖器部位皮膚黏膜感染。此兩型可用螢光免疫檢查及細胞培養法鑑別。
人是單純皰瘮病毒的唯一自然宿主。病毒經呼吸道、口腔、生殖器黏膜以及破損皮膚進入體內，潛居於人體正常黏膜、血液、唾液及感覺神經節細胞內。原發性感染多為隱性，大多無臨床症狀或呈亞臨床表現，僅有少數可出現臨床症狀。原發感染發生後，病毒可長期潛伏於體內。正常人
群中約有50%以上為本病毒的攜帶者。HSV在人體內不產生永久免疫力，
每當機體抵抗力下降時，如發熱、胃腸功能紊亂、月經、妊娠、病灶感染
和情緒改變時，體內潛伏的HSV被激活而發病。目前，4企測以上傳染病
最常用的方法是免疫4全測，此方法以抗原一抗體的特異性識別為基礎，包
括傳統的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和近來興起的膠體金法兩種。膠體金法分為免疫層析和免疫滲濾兩種方式，其中以免疫層析法最為方便、快捷。免疫層析膠體金技術是新型的診斷技術，已得到較為廣泛的應用，基本原理如下利用膠體金標記一種抗原或抗體，在試紙條的硝酸纖維素膜上包被相應的配對抗原或抗體，檢測時當樣品中含有相應的特異性抗體或抗原時，膠體金標記顆粒和樣品中配體相結合形成複合物，然後在硝酸纖維素膜上層析，再被包被的抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測線(T線)，通過檢測線的有無實現對結果的判定。但是傳統免疫層析技術大多是以血液為樣本，血液中成分複雜，在檢測前需要對血液進行處理，操作複雜，檢測成本較高。

發明內容
本發明提供了 一種單純皰滲病毒抗體唾液快速檢測試紙條，該試紙條 可以以唾液為樣品，解決了現有試紙條檢測成本較高，不適合現場檢測的 缺點。
一種單純皰滲病毒抗體唾液快速檢測試紙條，包括底板，底板上依次 粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上
附著有膠體金標記的可與HSV-I和HSV-II的IgM抗體特異性結合的鼠抗 人IgM抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有由人重組HSV-I抗原和HSV
鼠二抗抗;構成的質控線。P —' ^ '"
本發明所述的HSV-I和HSV-II的IgM抗體是檢測人是否感染單純皰 瘮病毒的標記物，該標記物與通過血液檢測人是否感染單純皰滲病毒的標 記物為同 一標記物，為本領域技術人員所公知。所述的鼠抗人IgM抗體、 人重組HSV-I抗原和HSV - II抗原、羊抗鼠二抗抗體均可通過現有傳統方 法製得。HSV-I的IgM抗體和HSV-II的IgM抗體是兩種不同的抗體，鼠 抗人IgM抗體可同時與HSV-I和HSV-II的IgM抗體結合。
優選地，所述的膠體金墊上附著有0.16 0.25^ig/cri^的可與HSV-I和 HSV-II的IgM抗體特異性結合的鼠抗人IgM抗體。 優選地，所述的力交體金墊可通過如下方法製備
取膠體直徑為15~35nm的膠體金溶液，調節pH值至8.0~8.2，以每 100ml膠體金溶液計加入0.65~1.0mg所述的鼠抗人IgM抗體，攪拌後用 牛血清蛋白封閉，離心去上清液，用膠體金溶液復溶至相同體積，將每毫 升溶液均勻鋪在20 40cri^玻璃纖維膜上，乾燥後製得膠體金墊。'
優選地，所述的檢測線中人重組HSV-I抗原的含量為0.01 0.4ng/cm, 人重組HSV-II抗原的含量為0.03 0.8嗎/cm;所述的質控線中羊抗鼠二抗 抗體含量為0.04-1.2pg/cm。
優選地，所述的4企測線包被方法如下
將所述的人重組HSV-I和人重組HSV-II抗原分別溶解在磷酸緩沖溶 液中製得濃度為0.04~0.8mg/ml的兩種溶液，將該兩種溶液以體積比1: 3的比例混合，將混合溶液以l~1.5nl/cm的用量在硝酸纖維素膜的一端劃線，乾燥後即得檢測線；
所述的質控線包被方法如下
將所述的羊抗鼠二抗抗體溶解在磷酸緩衝溶液中製得濃度為0.04~0.8mg/ml的溶液，將該溶液以l~1.5|il/cm的用量在硝酸纖維素膜的另一端劃線，乾燥後即得質控線。
本發明還提供了上述單純皰疹病毒抗體唾液快速#企測試紙條的檢測方法，包括以下步驟
取人唾液，用磷g吏緩沖溶液稀釋，取50-100^1稀釋後的唾液滴在樣品墊上，根據檢測線(T線)和質控線(C線)的顯色狀態，判斷檢測結果。
如C、 T線均出現，判定樣品為陽性；C線出現，T線不出現，判定樣品為陰性；C、 T線都不出現或者C線不出現T線出現，均判定試紙無效。
本發明試紙條採用免疫層析技術檢測唾液中HSV-I和HSV-II的IgM
抗體，從而確定人是否感染單純皰滲病毒，具有反應快速、敏感性高、特異性強的特點，而且操作簡單，適合自檢以及檢測成本較低。
具體實施方式
實施例1膠體金墊的製備
以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法製備直徑15nm的膠體金溶液，製備完成後取100ml膠體金溶液於燒杯內，用0.1MK2CO3調至pH8.0,以每100ml膠體金溶液計加入0.65mg可與HSV-I和HSV-II的IgM抗體特異性結合的鼠抗人IgM抗體(上海領潮生物科技有限公司)，室溫攪拌1小時，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時，12000rpm、 4°C離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶液復溶至100ml,按lml溶液鋪20cm2的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖維膜上，37。C乾燥30分鐘，製成膠體金墊。
硝酸纖維素膜的包被將可與HSV-I和HSV-II的IgM抗體特異性結合的人重組HSV-I抗原 和人重組HSV-II抗原(上海領潮生物科技有限^^司)分別溶解在0.01M、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS )配製成0.04mg/ml的兩種溶液，再將人重組HSV-I 抗原溶液和人重組HSV-II抗原溶液按照體積比1: 3的比例混合製成混合 溶液，將該混合溶液用噴膜儀在硝酸纖維素膜一端以lpl/cm的參數進行 劃線。
將可與上述鼠抗人IgM抗體特異性結合的羊抗鼠二抗抗體(上海領潮 生物科技有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩衝液(PBS)配製成 0.04mg/ml的溶液，將該溶液用噴膜儀分別在硝酸纖維素膜另 一端以 lnl/cm的參數進行劃線。
劃線後在室溫下乾燥8小時，分別^r測線和質控線。
檢測試紙的組裝
在乾燥室內，溫度20 25。C，溼度小於30%，將樣品墊(玻璃纖維膜)、 膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上，其中硝 酸纖維素膜位於底板中部，硝酸纖維素膜包被有T線的一端與膠體金墊的 1/3搭接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10搭接，樣品墊與膠體金墊的 1/5搭接。最後切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一個塑料 卡中製成檢測卡。
實施例2 膠體金墊的製備
以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法製備直徑15nm的膠體金溶液，製備完成 後取100ml膠體金溶液於燒杯內，用0.1MK2CO3調至pH8.0，以每100ml 膠體金溶液計加入l.Omg可與HSV-I和HSV-II的IgM抗體特異性結合的 鼠抗人IgM抗體(上海領潮生物科技有限公司)，室溫攪拌1小時，加入 重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時，12000rpm、 4°C 離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶液復溶至100ml，按lml溶液鋪40cm2 的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖維膜上，37-C乾燥30分鐘，製成膠體 金墊。
7硝酸纖維素膜的包被
將可與HSV-I和HSV-II的IgM抗體特異性結合的人重組HSV-I抗原和人重組HSV-II抗原(上海領潮生物科技有限公司)分別溶解在0.01M、pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配製成0.8mg/ml的兩種溶液，再將人重組HSV-I抗原溶液和人重組HSV-II抗原溶液按照體積比1: 3的比例混合製成混合溶液，將該混合溶液用噴膜儀在硝酸纖維素膜一端以1.5nl/cm的參數進行劃線。
將可與上述鼠抗人IgM抗體特異性結合的羊抗鼠二抗抗體(上海領潮生物科技有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配製成0.08mg/ml的溶液，將該溶液用噴膜儀分別在硝酸纖維素膜另 一端以lnl/cm的參數進行劃線。
劃線後在室溫下乾燥8小時，分別檢測線和質控線。
檢測試紙的組裝
在乾燥室內，溫度20 25。C，溼度小於30%，將樣品墊(玻璃纖維膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上，其中硝酸纖維素膜位於底板中部，硝酸纖維素膜包被有T線的一端與膠體金墊的1/3搭接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10招:接，樣品墊與膠體金墊的1/5搭接。最後切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一個塑料卡中製成檢測卡。
臨床樣品試驗
待檢人在採集唾液樣品前30分鐘禁食，取每位待檢人唾液0.5ml於紙杯中，用吸管取兩滴滴加到濃度0.02M、 pH8.0的磷酸緩沖溶液中稀釋，取稀釋的唾液lOOpl加到樣品墊中，肉目艮觀測30分鐘，記錄T線和C線的顯色狀態。同時將唾液樣品用單純皰滲病毒IgM抗體EUSA試劑盒檢測，若兩者檢測檢測結果不一致，再以另外兩種單純皰滲病毒IgM抗體ELISA試劑盒進行;險測，若兩種或以上的ELISA試劑為陽性，判定結果為陽性，兩種或以上的ELISA試劑為陰性，判定結果為陰性。
收集唾液樣品163份，其中ELISA試劑盒檢測出陽性樣品43份，本發明試紙條(實施例1 )檢測出陽性樣品44份，具 結果如下表1所示表1本發明試紙條對純皰疹病毒抗體臨床樣品的檢測結果
ELISA本試糹氏總數
+—+43043
—1119120
總數44119163
靈敏度=43/43=100%;特異性=119/120=99.2%
權利要求
1、一種單純皰疹病毒抗體唾液快速檢測試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，其特徵在於所述的膠體金墊上附著有膠體金標記的可與HSV-I和HSV-II的IgM抗體特異性結合的鼠抗人IgM抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有由人重組HSV-I抗原和HSV-II抗原構成的檢測線以及可與所述的鼠抗人IgM抗體特異性結合的羊抗鼠二抗抗體構成的質控線。
2、 根據權利要求1所述的單純皰滲病毒抗體唾液快速檢測試紙條， 其特徵在於所述的月交體金墊上附著有0.16 0.25嗎/cm2的可與HSV-I和 HSV-II的IgM抗體特異性結合的鼠抗人IgM抗體。
3、 根據權利要求1所述的單純皰滲病毒抗體唾液快速檢測試紙條， 其特徵在於取膠體直徑為15~35nm的膠體金溶液，調節pH值至8.0~8.2， 以每100ml膠體金溶液計加入0.65~1.0mg所述的鼠抗人IgM抗體，攪拌 後用牛血清蛋白封閉，離心去上清液，用膠體金溶液復溶至相同體積，將 每毫升溶液均勻鋪在20 400112玻璃纖維膜上，乾燥後製得膠體金墊。
4、 根據權利要求1所述的單純皰滲病毒抗體唾液快速4企測試紙條， 其特徵在於所述的檢測線中人重組HSV-I抗原的含量為0.01~0.4ng/cm, 人重組HSV-II抗原的含量為0.03 0.8嗎/cm;所述的質控線中羊抗鼠二抗 抗體含量為0.04~1.2|xg/cm。
5、 根據權利要求1單純皰滲病毒抗體唾液快速檢測試紙條，其特徵 在於，所述的檢測線包被方法如下將所述的人重組HSV-I和人重組HSV-II抗原分別溶解在磷酸緩沖溶 液中製得濃度為0.04 0.8mg/ml的兩種溶液，將該兩種溶液以體積比1: 3 的比例混合，將混合溶液以l~1.5jil/cm的用量在硝酸纖維素膜的一端劃 線，乾燥後即得檢測線；所述的質控線包被方法如下將所述的羊抗鼠二抗抗體溶解在磷酸緩沖溶液中製得濃度為 0.04~0.8mg/ml的溶液，將該溶液以l~1.5nl/cm的用量在硝酸纖維素膜的 另一端劃線，乾燥後即得質控線。
6、 一種權利要求1單純皰滲病毒抗體唾液快速4企測試紙條的檢測方法，包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩衝溶液稀釋，取50~100^d稀釋後的唾液滴在樣 品墊上，根據檢測線和質控線的顯色狀態，判斷檢測結果。
全文摘要
本發明公開了一種單純皰疹病毒抗體唾液快速檢測試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠體金標記的可與HSV-I和HSV-II的IgM抗體特異性結合的鼠抗人IgM抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有由人重組HSV-I抗原和HSV-II抗原構成的檢測線以及可與所述的鼠抗人IgM抗體特異性結合的羊抗鼠二抗抗體構成的質控線。本發明試紙條採用免疫層析技術檢測唾液中HSV-I和HSV-II的IgM抗體，從而確定人是否感染單純皰疹病毒，具有反應快速、敏感性高、特異性強的特點，而且操作簡單，適合自檢以及檢測成本較低。
文檔編號G01N33/569GK101639480SQ200910102100
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月31日 優先權日2009年8月31日
發明者李洪江, 鄭隆泗 申請人:杭州艾力康醫藥科技有限公司