重組葡萄球菌蛋白a基因、含有該基因的表達載體及用途的製作方法

2023-07-11 05:28:11

專利名稱：重組葡萄球菌蛋白a基因、含有該基因的表達載體及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種重排的基因，尤其涉及重組葡萄球菌蛋白A基因，本發明還涉及 含有該基因的表達載體以及工程菌株，本發明進一步涉及它們在製備葡萄球菌蛋白A中的 用途，屬於葡萄球菌蛋白A基因工程領域。
背景技術：
葡萄球菌蛋白A (staphylococcus protein A, SPA)是從金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)細胞壁分離的一種蛋白質。葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，是最常 見的化膿性球菌，為醫院交叉感染的重要來源。菌體直徑約0. 8mm,小球形，常堆聚成葡萄 串狀，但在液體培養基的前期培養中，常常分散，菌細胞單獨存在。早在1940年，Verwey發 現在某些金黃色葡萄球菌中含有一種物質，在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉澱。 1959年Jensen發現此物質可與免疫球蛋白(主要為IgG)結合，並將其命名為A抗原。1963 年Lofkvist等分離了該抗原，並證明它是一種蛋白質。1964年，Grov將其命名為葡萄球菌 蛋白A，簡稱SPA或A蛋白(proteinA)。SPA為單鏈多肽，由於其結構中不含有胱氨酸及半 胱氨酸，所以無二硫鍵。SPA全長為1503bp，其核酸序列、胺基酸序列見SEQID N03，SEQ ID N04，主要分三部分第一部分是從N-端起的36個胺基酸殘基構成的信號肽序列S (在蛋白 質轉運後被切除)；第二部分是五個高度同源的IgG結合結構域E、D、A、B、C，每個結構域約 58個胺基酸殘基組成，為反3a螺旋束結構；第三部分是C-末端的X蛋白，是與細胞壁結合 的成分，不具有IgG結合活性。SPA粘度高於球蛋白，等電點為pH 5.1，其天然結構十分穩 定，在6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑的條件下，尚能保存某些三級結構，如將此變性劑除去， 則能自然矯正恢復原有結構。葡萄球菌蛋白A具有和很多種屬的哺乳動物IgG的Fc端結合的能力，所以在發現 之初就受到關注，經過多年的發展，蛋白A已經成為一種應用廣泛的免疫學試劑於抗體純 化和免疫學的相關研究中。蛋白A佔葡萄球菌菌體蛋白的1. 7%，且葡萄球菌為致病菌，所 以利用傳統的方法從葡萄球菌中提取蛋白A有一定的難度，已經無法滿足日益發展的生物 產業，所以近些年來利用基因重組技術對蛋白A的重組原核表達技術也逐漸發展起來，期 望以更簡單的方法獲得活性，穩定性更好的產品。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種重組葡萄球菌蛋白A基因，該基因可以在原核表達 系統中穩定、高效的表達重組葡萄球菌蛋白A ；本發明目的之二是提供含有上述重組葡萄球菌蛋白A基因的表達載體；本發明目的之三是提供由上述重組葡萄球菌蛋白A基因所轉化的工程菌株；本發明目的之四是提供一種製備重組葡萄球菌蛋白A的方法；本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的一種重組葡萄球菌蛋白A基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示，其編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO :2所示。 本發明的重組葡萄球菌蛋白A基因是以SUMO標籤和葡萄球菌蛋白A抗體結合區 域(SEQ ID NO 3)連接而成。SUMO標籤為pSUMO載體上自帶標籤，構建時在葡萄球菌蛋白 A抗體結合區域序列兩端添加酶切位點BsaI和BamHI用於與載體相連，並在下遊添加終止 密碼子TAA，上下遊的序列分別為
上遊 GGTCTCAAGGTAATGCTGCGCAACACG下遊CGCGGATCCTTAAGCATCGTTTAGCTTTTT。本發明的重組葡萄球菌蛋白A基因的結構由6個His、SUMO標籤、蛋白A抗體結合 功能區串聯而成，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，所編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO. 2 所示；其中，葡萄球菌蛋白A基因的序列為SEQ ID NO. 3所示，所編碼的胺基酸序列由SEQ IDN0. 4所示(由1185個核苷酸構成編碼395個胺基酸)。本發明還構建林含有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的重組表達質粒及由該重組表 達質粒的工程菌株。本發明的重組表達質粒可通過本領域的常規方法構建而成，即將SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使SEQ ID NO :1所示的核苷 酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為一個參考的實施方案，例如，可以將葡萄球菌 蛋白A抗體結合區基因(SEQ ID NO 3)與大腸桿菌表達載體pSUMO利用酶切位點BsaI和 BamHI 相連，命名為 p_SUM0_SPA。本發明所構建的重組表達質粒可通過各種常規的方法轉化宿主細胞。作為參考， 可以將含有重組蛋白A基因的表達載體p-SUMO-SPA轉化大腸桿菌Rosetta得到的菌株，命 名為 Escherichia coliRosetta/p-SUMO-SPA，簡稱 Rosetta/p-SUMO-SPA。利用大腸桿菌重組菌株Rosetta/p-SUMO-SPA生產重組蛋白A的具體方法可以1、種子液的製備將菌種劃線培養後獲得單菌落，將單菌落接種於IOmlLB培養基 中37°C培養12小時。LB培養基中加入100mg/L卡那黴素。2、發酵將獲得的種子液按1 :100接種於發酵培養基中，當培養至0. D600為0. 4 左右時加入IPTG誘導終濃度為5mM，37°C培養3小時左右收菌。本發明還提供一種製備重組葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步驟構建含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的重組表達質粒；培養用該重組表達質 粒所轉化的宿主細胞，得重組菌株；培養重組菌株，誘導重組蛋白的表達，分離並純化所表 達的重組蛋白。上述製備重組蛋白的方法中，優選的，所述的重組表達質粒優選是p-SUMO-SPA ； 所述的宿主細胞是大腸桿菌^scherichiacolDRosettaGSllS，所述的重組菌株優選為 Escherichia coliRosetta/p-SUMO-SPA。上述製備重組蛋白的方法中，優選的，所述的重組蛋白的分離和純化包括以下步 驟(1)將收集的菌體用磷酸鹽緩衝液懸浮，破碎後低溫離心收集上清，利用Ni親和 柱和AKTA蛋白純化系統進行蛋白粗提純；(2)將粗提純的蛋白再利用AKTA系統進行分子篩的純化，最終得到純度達到90% 以上的蛋白。
本發明將葡萄球菌蛋白A與小泛素融合表達，既利於蛋白的提純又增加了蛋白的 穩定性和活性，使得蛋白A的生產和應用得到了空前的發展。本發明的蛋白表達和純化方 法具有生產時間短、表達效率高、表達量大、易於純化的優點，並且經實驗證明，本發明所表 達的重組蛋白A與天然蛋白A的生物活性無明顯區別。本發明說明書所涉及的名詞或術語的解釋1.葡萄球菌蛋白A 簡稱SPA或蛋白A(I^roteinA)2. p-SUMO-SPA 為含有本發明目的蛋白A基因的p_SUM0載體3. p-SUMO 為一種大腸桿菌原核表達載體。4. E. coli Rosetta 大腸桿菌菌株 Rosetta05. E. coli Rosetta/p-SUMO-SPA 為轉化了 p-SUMO-SPA 的 E. coli Rosetta 菌。6.蛋白A抗體結合區域在蛋白A全長基因中起到與抗體Fc端結合作用的核酸 區域。


圖1本發明重組表達載體p-SUMO-SPA的構建示意圖。圖2重組葡萄球菌蛋白A的SDS-PAGE凝膠電泳結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例1葡萄球菌蛋白A抗體結合區基因的克隆通過化學合成的方法合成所需的引物(上遊5，GGTCTCAAGGTAATGCTGCGCAACACG 3，，下遊5，CGCGGATCCTTAAGCATCGTTTAGCTTTTT 3，)；利用PCR方法獲得葡萄球菌蛋白A抗
體結合區域基因
PCR體系25 μ 1體系IOXBuffer2. 5μ 1dNTP2μ 1引物1. 5μ 1X2模板(DNA)1 μ 1無菌水16 μ 1rTaq 酶0. 5μ 1反應程序1:95°C 5min，2:95°C lmin，3:57°C lmin，4:72°C lmin，5:2_4 循環24 次，672 °C 10min,4°CIh;擴增到的序列長度為867bp，兩端分別引入酶切位點BsaI和BamHI，包含終止密碼
子 TAA。上述過程見圖1。
實施例2葡萄球菌蛋白A抗體結合區基因與pSUMO載體的構建用限制性內切酶BsaI和BamHI將實施例1所克隆的重組葡萄球菌蛋白A基因切下，同時與被相同酶切割之後的PSUMO載體(高效可溶性重組蛋白表達載體的構建，姜媛 媛，劉銘瑤，任桂萍，朱慧萌，李德山。生物工程學報。2010,1,25 ；26(1) :121-129))相連接 並轉化大腸桿菌，篩選具有卡那黴素抗性的轉化子，經質粒提取、酶切鑑定、測序後證明葡 萄球菌蛋白A抗體結合區基因已克隆至pSUMO載體上。上述過程見圖1。實施例3能高效表達重組葡萄球菌蛋白A的大腸桿菌菌株E.coliRosetta/ p-SUMO-SPA 的構建用化學轉化方法將p-SUMO-SPA轉化至E. coli Rosetta(購自北京全式金生物技 術有限公司，商品代號CD801)，在含有卡那黴素的LB平板上篩選轉化子，經質粒提取、酶切 鑑定、測序分析獲得的重組子E. coli Rosetta/p-SUMO-SPA。實施例4利用大腸桿菌工程菌E. coli Rosetta/p-SUMO-SPA生產重組葡萄球菌蛋 白A1)菌種的培養發酵挑取大腸桿菌工程菌E. coli Rosetta/p-SUMO-SPA，接種於LB培養基中，37°C 恆溫培養12-14小時，次日1 100擴大培養至OD值為0. 4，加IPTG至終濃度0. 5mM繼續培 養3小時4000r/m 30m離心收集菌體。取少量菌體加入10倍的上樣緩衝液，煮沸5分鐘後進行SDS-PAGE凝膠電泳結果 見圖2。2)重組葡萄球菌蛋白A的純化將上述收集的菌體超聲破碎離心後收集上清，將上清過濾後利用AKTA蛋白純化 系統進行純化，先後進行親和層析和分子篩層析得到純化後的重組葡萄球菌蛋白A，電泳結 果見圖2。。試驗例1 Elisa檢測表達的重組葡萄球菌蛋白A抗體結合試驗1)包被將純化後的重組葡萄球菌蛋白A在96孔板沒孔包被100ul，4°C，12小時。2)封閉每孔加入IOOul 5%脫脂奶粉進行封閉，37°C，1小時。3) 一抗孵育每孔加入IOOul兔抗體，37°C，1小時。4) 二抗孵育沒孔加入約IOOul 1 5000辣根標記抗體，37°C，1小時。5)顯色。經Elisa檢測本發明得到的重組葡萄球菌蛋白A與兔抗體具有很好的結合活性， 與商業化的spa蛋白(spa蛋白購自本元正陽基因技術股份有限公司，產品目錄R00013) 相比活性相近。實施例6 SUMO標籤在不同條件下對spa抗體結合穩定性的作用一、spa-SUMO-agarose 禾口 spa_￡ig￡irose(1)將spa-SUMO和spa兩種蛋白分別製備5ml，溶劑為 CouplingBuffer (0. lMNaHC03，0. 5MNaCl, ph = 9. 0)，濃度均為 5mg/ml。(2)取活化好的agarose Iml用WashBuffer (ImM HCl)反覆衝洗凝膠15次以上 每次WashBuffer的體積為1ml，WashBuffer應在冰上進行預冷並在洗滌過程中保持冰浴狀 態。(3)將步驟(1)中製備好的5ml的兩種蛋白分別與Iml洗滌完畢的凝膠進行混合， 並將混合後的PH控制在9. 0左右，將混合物置於4°C震蕩條件下12小時。
6
(4)除去混合物中的液體，用5倍於凝膠體積的Coupling Buffer進行衝洗。(5)將步驟(4)中清洗過後的凝膠置於 5ml 的 Blocking Buffer (0. IMTris-HCl, pH 8.0)、4°C、震蕩條件下2小時。(6)除去 Blocking Buffer，用溶液 0. IMTris-HCl, 0. 5MNaCl, PH8-9 清洗凝膠數 次，每次為1ml，至少10次(7)最後將兩種凝膠分別保存在20 %乙醇溶液中既得Iml的spa-SUMO-agarose 禾口 spa_agarose，。二、試驗方法和結果1、分別將等量的spa-SUMO蛋白(本發明所製備的重組葡萄球菌蛋白A)和spa蛋 白分別置於不同PH值或不同溫度一段時間後，後利用ELISA方法測定兩種蛋白與抗體結合 的活性。試驗方法分別將等重量的spa-SUMO蛋白和spa蛋白分別置於pH值2，4，6，8，10 溶液中4個小時後利用ELISA方法測定兩種蛋白與抗體結合的活性，由表1中可以看出，無 SUMO標籤的spa蛋白在pH值為2，4，10的時候其抗體結合活性有明顯的下降，而有SUMO標 籤的spa-SUMO蛋白在pH值為2，4，10的時候很好的保持了其抗體結合的活性。表1 SUMO標籤在不同pH值下對spa抗體結合穩定性的作用
權利要求
1.一種重組葡萄球菌蛋白A基因，其特徵在於其核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示。
2.權利要求1的重組葡萄球菌蛋白A基因所編碼的蛋白質，其特徵在於其胺基酸序 列為SEQ ID NO 2所示。
3.含有權利要求1所述重組葡萄球菌蛋白A基因的重組表達載體。
4.按照權利要求3所述的重組表達載體，其特徵在於其為原核表達載體。
5.由權利要求3或4的重組表達載體所轉化得到的重組菌株。
6.一種製備重組葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步驟構建含有權利要求1所述重組葡萄球菌蛋白A基因的重組表達質粒；培養用該重組表 達質粒所轉化的宿主細胞，得重組菌株；培養重組菌株，誘導重組蛋白的表達，分離並純化 所表達的重組蛋白。
7.按照權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的重組蛋白的分離和純化包括以下 步驟(1)將收集的菌體用磷酸鹽緩衝液懸浮，破碎後0-4°C低溫離心收集上清，利用Ni親和 柱和AKTA蛋白純化系統進行蛋白粗提純；(2)將粗提純的蛋白再利用AKTA系統進行分子篩的純化，即得。
8.權利要求2所述的蛋白質在純化抗體中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種重組葡萄球菌蛋白A基因及其用途。本發明重組葡萄球菌蛋白A基因的核苷酸序列為SEQ ID NO1所示，所編碼的蛋白質胺基酸序列為SEQ ID NO2所示。本發明將葡萄球菌蛋白A與小泛素融合得到了重組葡萄球菌蛋白A基因，所表達的重組蛋白既利於蛋白的提純又增加了蛋白的穩定性和活性，經實驗證明，本發明所表達的重組葡萄球菌蛋白A與天然葡萄球菌蛋白A的生物活性無明顯區別。本發明重組葡萄球菌蛋白表達和純化方法具有生產時間短、表達效率高、表達量大、易於純化等優點。
文檔編號C12N15/63GK102140476SQ20101011075
公開日2011年8月3日 申請日期2010年1月28日 優先權日2010年1月28日
發明者任桂萍, 劉銘瑤, 李德山, 王文飛, 高學慧 申請人:哈爾濱市哈科隆生物製藥研究所