用表面活性劑沉澱法分離提純蛋白質的方法
2023-07-11 12:51:36
專利名稱：用表面活性劑沉澱法分離提純蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質提取純化方法，特別是涉及一種用表面活性劑沉澱法分離純化蛋白質的方法，屬生物化學、生物資源綜合利用、生物製藥等技術領域。
蛋白質的分離純化是生物工程(尤其是蛋白質工程)和生化製藥(如胰臟中提取胰島素)的重要工序。因此，蛋白質(生物大分子)的分離提純，在實際生產和理論研究中均顯得十分重要。目前，從各種生物器官或發酵細菌中分離提純蛋白質的典型過程一般包括①、組織的破粹；②、溶液抽提；③、硫酸銨或乙醇或丙酮等有機溶劑分步沉澱；④、重新溶解而後再分步沉澱；⑤、分子篩或離子柱層析；⑥、冷凍乾燥(張龍翔編《生化實驗方法和技術》，1982年出版，北京大學出版社，P143-216)。在④分步沉澱的過程中，將要使用大量的硫酸銨(一般在溶液中的濃度達到50％以上)，或者有機溶劑(有機溶劑的用量濃度一般也在50％以上)；這種消耗通常是不可避免的。同時，工藝步驟也長，導致成本比較高。另外，一般生物組織中同時含有多種蛋白質或生物大分子(如胰臟中含有十幾個蛋白質)，能夠同時利用的不多(一般只能聯產胰島素和胰酶兩個產品)，造成生物資源的浪費。
本發明克服了上述方法的缺陷，其目的在於提供一種既能簡化純化步驟，又能充分利用原料的蛋白質分離純化方法。
發明具體內容如下對已知蛋白質的溶液，依次採取下列步驟提取①、利用酸或鹼或其它緩衝體系，調節溶液的pH大於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，控制溶液的pH小於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉澱30-60分鐘，離心，棄沉澱，即除去雜蛋白質。
②、用酸或鹼調節上清液的pH，使溶液的pH小於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，使溶液的pH大於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉澱30-60分鐘，離心，收取沉澱，即為所需蛋白質。
上述是對於已知等電點的蛋白質的分離提純，對於未知蛋白質，可從pH＝0或pH＝14開始，改變溶液的pH，仍按上述①、②操作，即可得到未知蛋白質；純度相同。
要利用溶液中的所有蛋白質，對於生物組織抽提液，可從pH＝0或pH＝14開始，逐次增大或降低溶液的pH0.5-1.0個單位，仍按上述①或②操作，逐次收集沉澱，即可將溶液中的蛋白質按等電點的不同分為14-28個等分。
上述方法中的酸可以是硫酸、鹽酸等強酸鹼可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀等強鹼緩衝體系是一價型的，如NaAc-HAc(醋酸鈉—醋酸)等陰離子表面活性劑可以是十二烷基硫酸鈉、烷基苯黃酸鈉等陽離子表面活性劑可以是溴化十二烷基三甲銨、氯化十四烷基三甲銨等上述方法所獲得的蛋白質，其純度用SDS凝膠電泳法測定為電泳單點純。
本方法具有以下優點①、步驟少。由於同一表面活性劑在某一pH下只沉澱某一等電點的蛋白質，因此，可以一次沉澱就得到電泳單點純級的蛋白質樣品(純樣品)。
②、藥品用量少。引起蛋白質沉澱所需要的表面活性劑量很少，僅1mM濃度(大約0.5％)就可引起蛋白質沉澱。
③、生物資源可以充分利用。溶液抽提得到的混合物，可以調節溶液為不同的PH，即把溶液按1-1.5個PH的級差分級沉澱，得到不同等電點的分離物。
由於上述的優點，該方法在生化制約，特別是酶製劑的分離提純方面具有廣闊的前景。
實施例一分離牛血清(等電點為4.9)和肌酸激酶(等電點為6.1)混合蛋白質配成1g/L的濃度，調節溶液的pH＝6.0(比肌酸激酶的等電點小0.1，比牛血清大1.1)，加十二烷基硫酸鈉(SDS，一種陰離子表面活性劑)使濃度為1000mmol/L沉澱60分鐘、離心，沉澱為牛血清。上清液調pH＝13(比肌酸激酶的等電點大7個pH)，加SDS30mmol/L，沉澱30分鐘，離心，沉澱為肌酸激酶。二者均為電泳單點純。
實施例二提取溶菌酶(等電點為11)雞蛋清用水調開，煮沸，取溶液(抽提液)；用鹼調節溶液的pH為11.5(溶菌酶的pH為11)，加溴化十二烷基三甲銨(CMBB，一種陽離子表面活性劑)20mmol/L，沉澱40分鐘、離心，棄沉澱(為雜蛋白質)。上清液調pH為10.5，加0.1mmol/LCMBB，沉澱60分鐘、離心，收集沉澱。即為溶菌酶，純度為電泳單點純。
實施例三未知蛋白質的提取對於心臟抽提液，先調溶液的pH＝0，加SDS使濃度達30mmol/L，沉澱30分鐘、離心，收集沉澱，即為等電點小於0的蛋白質組分。再調溶液的pH＝1.0，加SDS使濃度達50mmol/L，沉澱30分鐘，離心，收集沉澱，即為等電點在0-1之間的蛋白質組分。再調溶液的pH＝2，加SDS使濃度達80mmol/L，沉澱60分鐘，離心，沉澱即為等電點1-2的蛋白質組分。依次類推，得到不同等電點的蛋白質組分。
權利要求
1.一種用表面活性劑沉澱法分離提純蛋白質的方法，其特徵在於依次包括下列步驟①、利用酸或鹼或其它緩衝體系，調節溶液的pH大於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，控制溶液的pH小於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉澱30-60分鐘，離心，棄沉澱，即除去雜蛋白質。②、用酸或鹼調節上清液的pH，使溶液的pH小於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，使溶液的pH大於待提取的蛋白質的等電點0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉澱30-60分鐘，離心，收取沉澱，即為所需蛋白質。
全文摘要
一種用表面活性劑沉澱法分離提純蛋白質(主要用於酶的分離和提純)的方法，該方法是通過調節待提溶液的pH為一定值再加入一定濃度的陽離子或陰離子表面活性劑使所提蛋白質沉澱離心分離得到。該方法不僅能分離提取已知蛋白質，還能一次提取生物組織抽提液中的一系列蛋白質，從而充分利用資源。同時還具有操作簡單，成本低等優點，使其在生化製藥，特別是在提取酶製劑等方面具有廣闊的應用前景。
文檔編號C07K1/30GK1144807SQ9610625
公開日1997年3月12日 申請日期1996年5月10日 優先權日1996年5月10日
發明者李學剛 申請人:西南農業大學