一種調控根系發育的蘋果多肽激素基因MdCEP7及其應用的製作方法

2023-07-13 01:10:41

本發明涉及一種調控根系發育的蘋果多肽激素基因mdcep7及其應用，屬於分子生物學技術領域。

背景技術：

生長素在植物根系發育過程中發揮重要作用，生長素極性運輸存在於植物的莖、根和葉中，其極性運輸由定位於質膜上的生長素運輸載體負責。生長素運輸載體，包括生長素輸入載體(aux1)和生長素輸出載體(pins)，它們通過調節生長素的運輸和分布影響植物生長發育的各個方面。生長素的合成過程由多種酶的參與，其中taa1與yuc基因起到關鍵作用，生長素的合成與轉運影響到植物根系發育過程。

近年來的研究結果表明植物體內的多肽分子在調控植物萌發、生長、分化、發育、信號轉導等各個方面同樣發揮著重要作用，因此也被稱為多肽激素。包括clavata3(clv3)、clv3/embryosurroundingregionrelated(cle)、trachearyelementdifferentiationinhibitoryfactor(tdif)、phytosulfokine(psk)、plantpeptidecontainingsulfatedtyrosine1(psy1)、c-terminallyencodedpeptide1(cep7)等。cep基因編碼一個小肽肽前體，由n-端分泌信號肽、可變域、一個或多個cep結構域和一個短的c-末端延伸組成，ceps參與了植物根發育過程，並且影響到株高、穗粒數表型；atceps通過與下遊激酶受體atcepr1結合，調控擬南芥根系發育；在苜蓿中，mtcep7作用與下遊肽受體mtcar2，減少了側根數目並促進根瘤形成。

蘋果是世界上重要的水果作物，對果樹生長素合成、轉運以及根系發育調控的研究有助於調節植株形態結構和根系生長。在多年生木本植物中，多肽合成基因cep的研究還未有報導。在本研究中，我們克隆了一個具有cep結構的mdcep7蛋白，在擬南芥中異位表達mdcep7能夠調控植株根系發育。

技術實現要素：

本發明的目的之一，是提供一種調控根系發育的蘋果多肽激素基因mdcep7。本發明的申請人從蘋果中分離並鑑定的一個新型的調控根系生長素合成、運輸以及根系發育的多肽編碼基因mdcep7。實驗發現mdcep7超量表達擬南芥表現出主根長度與側根數目受到抑制的表型；揭示該基因在調控生長素合成、轉運與根系發育中發揮重要作用。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種調控根系發育的蘋果多肽激素基因mdcep7，所述mdcep7的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。

本發明的申請人從嘎啦蘋果組培苗中提取總rna，反轉錄得到cdna。根據國際基因庫中已發布的擬南芥中atceps的保守胺基酸序列，設計引物，進行常規聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,pcr)。將合適大小的pcr產物與pmd18-t載體連接，轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，篩選重組子，並進行測序分析確認，最後得到cdna全長序列。

該基因開放閱讀框(openreadingframe,orf)為366bp。由此推得，該基因編碼121個胺基酸，基因序列號為mdp0000886459，位於第15號染色體，包括22個外顯子和21個內含子。將其胺基酸序列在國際基因庫中檢索，發現與已公布的擬南芥相關基因atcep7有較高的同源性，所以本發明的申請人將該基因命名為mdcep7。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述蘋果多肽激素基因mdcep7來自嘎啦蘋果。

進一步，所述mdcep7的核苷酸序列編碼的胺基酸序列如seq.id.no.2所示。

本發明的目的之二，是提供一種調控根系發育的蘋果多肽激素基因mdcep7在調節植株根系發育中的應用。本發明的蘋果多肽激素基因mdcep7能夠直接優化根繫結構，主根變短能夠抑制地上部莖幹伸長，尤其是在果樹中，可應用於喬化砧木的遺傳改良。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種調控根系發育的蘋果多肽激素基因mdcep7在調節植株根系發育中的應用。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述應用為降低主根長度並抑制側根數目。

採用上述進一步的有益效果是：抑制根系的發育，能夠減少光合能耗，進一步將光合產物應用到碳物質積累中。同時，通過優化根系，能夠調節地上部形態，尤其是在果樹中，可應用於喬化砧木的遺傳改良。

由實驗結果可知，蘋果mdcep7基因影響生長素合成和運輸，並抑制了主根和側根的發育。

本發明的目的之三，是提供一種核酸構建體。本發明利用強啟動子(花椰菜花葉病毒35s啟動子)驅動原理的轉基因技術，將mdcep7基因的超量表達載體轉入擬南芥中，從而獲得轉基因植株。mdcep7超量表達擬南芥表現出主根長度受到抑制，側根數目減少的表型，說明mdcep7基因在植株生長素合成、運輸和根系發育中發揮重要作用。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種核酸構建體，包含處於強啟動子控制下的如上所述蘋果多肽激素編碼基因mdcep7。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述強啟動子為花椰菜花葉病毒35s啟動子。

本發明的有益效果是：

1.本發明的申請人首次從蘋果中分離並鑑定的一個新型的調控根系生長素合成、運輸以及根系發育的多肽編碼基因mdcep7。實驗發現mdcep7超量表達擬南芥表現出主根長度與側根數目受到抑制的表型；揭示該基因在調控生長素合成、轉運與根系發育中發揮重要作用。

2.本發明的蘋果多肽激素基因mdcep7能夠直接優化根繫結構，主根變短能夠抑制地上部莖幹伸長，尤其是在果樹中，可應用於喬化砧木的遺傳改良。

3.本發明利用強啟動子(花椰菜花葉病毒35s啟動子)驅動原理的轉基因技術，將mdcep7基因的超量表達載體轉入擬南芥中，從而獲得轉基因植株。mdcep7超量表達擬南芥表現出主根長度受到抑制，側根數目減少的表型，說明mdcep7基因在植株生長素合成、運輸和根系發育中發揮重要作用。

附圖說明

圖1為載體的構建及轉基因擬南芥的獲得。其中，a為蘋果mdcep7基因pcr擴增產物電泳mdcep7:mdcep7基因擴增產物，mark:分子量標記dm2000；b為rt-pcr分析mdcep7基因在轉基因擬南芥l1、l2、l3株系中的表達水平。

圖2為mdcep7對植株生長素合成、運輸相關基因表達的影響，如圖2所示，attaa1、atyuc1/2/3為生長素合成相關基因，ataux1、atpin1/2/3為生長素轉運相關基因在mdcep7轉基因擬南芥中表達)。

圖3為mdcep7調節根系發育。如圖3,所示，生長10天的野生型擬南芥(col-0)和轉基因擬南芥(l1、l2、l3)根系系統觀察。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。

實施例1嘎啦蘋果mdcep7基因的克隆

1.嘎啦蘋果組培葉片rna提取

通過ctab法提取嘎啦蘋果組培葉片的總rna，包括以下步驟：

1)取1.5g經200mmnacl鹽處理24小時的嘎啦蘋果組培苗，放入預冷的研缽，加液氮磨碎，轉入預冷的50ml離心管中；

2)迅速加入10ml預熱到65℃的提取緩衝液(ctab20％w/v、tris-hcl0.1mol/l、edta25mol/l、nacl2mol/l、巰基乙醇2％w/v、pvp2％w/v、無rna酶的雙蒸水定容，其中pvp和巰基乙醇現用現加)，輕輕混勻，65℃水浴中0.5小時；

3)加入與上步離心管液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩0.5小時，4℃、12,000rpm離心20分鐘；將上清液轉移到新的50ml離心管中；

4)加入1/3上清液體積的10mol/l預冷licl，-20℃放置3小時，12,000rpm離心30分鐘，棄上清液；

5)加入500μlsste緩衝液(nacl1mol/l、sds0.5％w/v、edta10mol/l、無rna酶的雙蒸水定容)充分懸浮沉澱後，平均分裝到2支1.5ml離心管中；

6)分別加入與懸浮液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘；將上清液轉移到新的1.5ml離心管；

7)分別加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘；將上清液轉移到新的1.5ml離心管；

8)加入2.5倍上清液體積的預冷無水乙醇，-20℃放置1-2小時；

9)於4℃、12,000rpm離心20分鐘，70％乙醇洗2次；

10)於4℃、14,000rpm離心10分鐘，超淨臺上風乾沉澱；加入20μldepc水溶解rna；

11)置-80℃儲藏備用，或立即進行以下反轉錄實驗。

2.將總rna反轉錄得到cdna

總rna的反轉錄使用市售的反轉錄試劑盒，獲得反轉錄cdna。

3.mdcep7全長dna序列的擴增

設計引物(mdcep7-f/mdcep7-r)，以上述反轉錄cdna為模板進行pcr擴增。

mdcep7-f：5』-gattgcgattcagctcaat-3』(seq.id.no.3)；

mdcep7-r：5』-gtgctcaaagatgtgatgtcct-3』(seq.id.no.4)。

pcr擴增體系：純化的cdna產物25μl、5×tdt緩衝液10μl、0.1％bsa5μl、10mmdctp2.5μl、tdt15u、雙蒸水定容至50μl。

pcr擴增程序：94℃預變性5分鐘；循環參數為94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，進行32個循環；72℃充分延伸10分鐘。

pcr反應結束後，回收pcr產物並將其連接到pmd-18t載體上，獲得pmd18-t-mdcep7質粒。測序(北京六合華大基因科技股份有限公司)結果顯示，mdcep7基因核苷酸序列如seq.id.no.1所示；其胺基酸序列如seq.id.no.2所示。測序正確的單克隆，鹼法提取pmd18-t-mdcep7的質粒dna，-20℃保存，用於後續功能驗證實驗(圖1-a)。

實施例2mdcep7基因載體的構建

為進一步研究mdcep7基因的功能，將包含有mdcep7基因編碼區在內的共1863bp片段正確插入表達載體pri上。

1.利用dnaman軟體，分析mdcep7基因的酶切位點，將實施例1保存的pmd18-t-mdcep7的質粒dna進行酶切反應，並連接到pri載體上，構建正確的重組子pri-mdcep7。

2.用構建好的重組子pri-mdcep7轉化農桿菌lb4404感受態細胞。進行pcr鑑定，挑取陽性菌落進行測序。測序正確的重組子pri-mdcep7單克隆用於後面擬南芥的轉化。

實施例3獲得轉基因擬南芥

將獲得的擬南芥種子，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水衝洗5次，吸乾水。播種於種子萌發培養基上(直接鋪於表面)，光培養(25-28℃，16h長日照/8h短日照，10d)，至小苗長出。移栽到基質培養到開花。

挑取農桿菌單克隆菌落接種於10mlyep液體培養基(含50mg/l潮黴素)中，28℃、200rpm，振蕩培養至od600為0.6-0.8(約48h)；取其中1ml菌液加入20mlyep液體培養基內，28℃、200rpm，振蕩培養至od600為0.6-0.8(約5h)。離心收集菌體，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％silweet)懸浮稀釋20倍，備用。

將擬南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果莢，50mg/l卡那黴素抗性篩選後，pcr檢測得到陽性轉基因植株，經過連續3代篩選得到t3代純合體，收取種子，進行表型分析。

利用篩選培養基(含50mg/l卡那黴素)篩選抗卡那黴素陽性的候選轉基因株系，共獲得3個35s:mdcep7陽性株系(l1、l2、l3)；為進一步鑑定轉基因株系，在進行繼代培養時，每株系各取0.1g左右的組培苗，提取相應的rna，反轉錄並進行半定量pcr檢測，以確定這些株系中mdcep7的表達水平。結果顯示，mdcep7基因在l1、l2及l3中過量表達(圖1-b)。

實施例4mdcep7調控生長素合成、運輸相關基因表達

定量pcr檢測野生型與轉基因擬南芥中生長素合成基因(ataux1,atpin1,atpin2,atpin3,atyuc1，atyuc2，atyuc6，attaa1)表達量。結果顯示，擬南芥與轉基因擬南芥中生長素合成和轉運相關基因均有顯著差異，暗示mdcep7基因調控生長素的合成和轉運(圖2)。

實例6mdcep7調控根系發育

為進一步確定轉基因植株的功能，將擬南芥播種在豎直的ms培養基上，觀察擬南芥根系發育表型。

(1)種子處理。將獲得的擬南芥種子(col-0，l1，l2，l3)，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水衝洗5次，吸乾水。播種於種子萌發培養基上。4℃層積處理4天後至光下培養(21-24℃，16h長日照/8h短日照)。

(2)選擇萌發後4天左右、根系發育一致的野生型擬南芥(col-0)和轉基因擬南芥(l1、l2、l3)，轉移到ms培養基上豎直培養(21-24℃，16h長日照/8h短日照)。繼續培養6天後，觀察擬南芥根系表型並拍照。

結果發現，與野生型擬南芥相比，超量表達mdcep7的轉基因擬南芥主根長度和側根數目明顯受到抑制(圖3)。

綜上所述，mdcep7基因不僅影響生長素合成、轉運，對根系發育也有顯著影響。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

序列表

〈110〉山東農業大學

〈120〉一種調控根系發育的蘋果多肽激素基因mdcep7及其應用

〈160〉2

〈170〉patentinversion3.5

〈210〉1

〈211〉366

〈212〉dna

〈213〉蘋果

〈400〉1

atggccttgaacaagttaacccttattgcttgctcattcctagtttccctactcatctca

acctgggaaattcagtccattgatgcaaggcctttgaaatcaaggagtaaaaatgaactc

caaaacctcccaattcacaccaaaacccacaaaaacaaatcggaggataatgcaggtcac

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〈210〉2

〈211〉121

〈212〉prt

〈213〉蘋果

〈400〉1

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