蜈蚣毒素抗腫瘤活性多肽的製作方法

2023-08-12 22:07:21

專利名稱：蜈蚣毒素抗腫瘤活性多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬生物化學中的多肽藥物技術領域。
背景技術：
蜈蚣為節肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物，蜈蚣藥用在中國已有2000多年的 歷史，始載於《神農本草經》，具有熄風止痙、解毒散結、通絡止痛的作用，主治中風、驚癇、破 傷風、百日咳、結核、燙傷、瘡瘍腫毒等。現在藥理研究，蜈蚣還具有抗腫瘤作用、止痙作用、 抗真菌和治療糖尿病的作用。蜈蚣的分布範圍雖廣，但對蜈蚣毒的研究遠遠落後於蛇、蠍等其它有毒動物的毒 液，有關蜈蚣毒素方面的報導也較少。蜈蚣毒素中包含5-羥色胺，組胺，酸性和鹼性磷酸 酶，心臟毒蛋白以及神經遞質釋放物等物質。據報導蜈蚣全蟲水提物具有明顯抑瘤活性。但 迄今為止，對蜈蚣抑瘤成分的研究多停留在蜈蚣粗提物的水平，對蜈蚣中的單一組分的研 究較少。原發腫瘤的生長和轉移都依賴於既存血管的新生血管生成，越來越多的研究證明 血管生成對實體瘤的生長和轉移至關重要，腫瘤轉移前血管生成明顯增強，其血管生成的 增強程度和腫瘤轉移能力呈正相關，這表明腫瘤組織必須從宿主中獲取營養才能在局部生 長.因此阻斷腫瘤血管生成，切斷腫瘤組織獲得營養途徑已經成為新的抗腫瘤治療靶點， 而且也成為抗腫瘤治療中熱門的研究內容.大量實驗已證實，許多肽類可影響血管生成的開關，使其激活開放或抑制關閉，這 些多肽稱為血管生成調節因子，並可分為血管生成因子和血管生成抑制因子兩類.正常情 況下二者平衡，血管處於靜止狀態，在腫瘤細胞惡性轉化過程中，因微環境改變，則啟動腫 瘤細胞的血管生成開關，激活血管生成因子，促使內皮細胞遷移，增殖，形成血管芽及微血 管，同時亦激活基質金屬蛋白酶活性，使細胞外基質降解利於血管形成，伸延及腫瘤生長， 浸潤和轉移.一些具有抗腫瘤活性的多肽就是通過抑制血管內皮細胞生長從而抑制腫瘤生長 的。本發明基於上述研究，從蜈蚣毒素中分離純化出一個由十二個胺基酸組成的多 肽，通過測定其對人臍靜脈內皮細胞的作用來確定其抗腫瘤活性。

發明內容
本發明涉及一種對人臍靜脈內皮細胞有抑制作用，從而抗腫瘤的多肽，該多肽 是蜈蚣毒素來源的，用電刺激法取得蜈蚣毒素，凍幹後溶於PBS溶液中，用超濾管超濾、 RP-HPLC分離純化後得峰7，命名為re-12。本發明所提供的蜈蚣毒素抗腫瘤多肽是利用Edman降解法測得其胺基酸序列的， 序列為 Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Ser-Arg-Ile-Gln-Glu-Gly。本發明所提供的蜈蚣毒素抗腫瘤多肽，經質譜測定其分子量為1296Da。
本發明所提供的多肽，經測試具有抗腫瘤活性在給藥劑量為2.25X10_8mol/L到 2. 80X10_9mol/L範圍內可抑制人臍靜脈內皮細胞的生長，且呈現量效關係。
具體實施例方式1.蜈蚣毒素抗腫瘤活性多肽的製備a.取1000條蜈蚣，產地安徽滁州，用電刺激法取毒，凍幹。稱取0.4g蜈蚣毒素，溶 於 20ml PBS 溶液中，10000r/min 離心 5min。b.上述溶液用IOOOODa超濾管超濾，7000r/min離心15min。c.收集濾過液，用C18-HPLC柱分離純化，柱高25cm，直徑0. 46cm。用5%乙腈(含0.05% TFA) 20ml平衡後，500μ 1濾過液上樣，先用5%乙睛(含 0. 05% TFA) 20ml洗脫，然後用95%乙腈(含0.05% TFA) 30ml進行0-60%梯度洗脫，流速 為lml/min，收集活性峰7，冷凍乾燥。下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的 本發明發明範圍。


圖1為經RP-HPLC分離純化的色譜圖活性峰為峰7，命名為TO-122.蜈蚣毒素抗腫瘤多肽的測序本發明所提供的蜈蚣毒素抗腫瘤多肽用Edman降解法進行測序。Eadam降解法是一種對蛋白質進行測序的化學方法，是從多肽鏈游離的N末端測 定胺基酸殘基序列的過程。N末端胺基酸殘基被苯異硫氰酸酯修飾，然後從多肽鏈上切下修飾的殘基，再經層 析鑑定，餘下的多肽鏈(少了一個殘基)被回收再進行下一輪降解循環。Edman降解測序主要涉及耦聯、水解、萃取和轉換等4個過程。首先使用苯異硫氰 酸酯(PITC)在PH9.0的鹼性條件下對蛋白質或多肽進行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基 酸殘基反應，形成苯氨基硫甲醯(PTC)衍生物，即PTC-肽。然後PTC-肽用三氟乙酸處理， N-端胺基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該胺基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下 來將該衍生物用氯丁烷從反應液中萃取出來，而去掉了一個N-端胺基酸殘基的肽仍留在 溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩定，經酸作用，再進一步環化，形成一個穩定 的苯乙內醯硫脲(PTH)衍生物，即PTH-胺基酸。留在溶液中的減少了一個胺基酸殘基的肽 再重複進行上述反應過程。整個測序過程現在都是通過測序儀自動進行。每一循環都獲得一個PTH-胺基酸， 經HPLC可以鑑定出是那一種胺基酸。本發明所提供的多肽經Edman降解法測序，序列為Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Se r—Arg-IIe-Gln-Glu-Glyο3.蜈蚣毒素抗腫瘤多肽對腫瘤細胞的抑制作用a.細胞培養人臍靜脈內皮細胞用含10%小牛血清(FCS)、100U/ml青黴素及100U/ml鏈黴素的 DMEM培養基，在37°C、5% CO2、飽和溼度的CO2培養箱中培養，2 3天傳代1次，取對數生 長期細胞用於實驗。b. MTT比色法測定蜈蚣毒素抗腫瘤多肽對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響
4
取對數生長期細胞，以每空1 X IO4個細胞接種於96孔培養板中，每孔加入細胞懸 液180 μ 1，在細胞培養箱中培養4h，待細胞貼壁後加入20 μ 1不同濃度的肽，使其終濃度 分別為 2. 25 X IO"8,1. 52 X IO"8,1. 12 X IO"8, 5. 60 X IO"9, 2. 80 X 1(Γ9Μ，負對照組加入相同體 積PBS，每組設3個副孔，分別處理48h。培養結束前4h於96孔培養板中每孔吸出培養基 120 μ 1，並加入5g/L的MTT液20 μ 1，置培養箱中繼續培養4h後輕輕吸去培養基，然後每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩IOmin使紫藍色沉澱充分溶解；用酶標儀570nm和630nm雙波長測 定吸光度(A值)。對該多肽進行抗腫瘤活性測試，經MTT檢測，蜈蚣毒素抗腫瘤多肽能抑制人臍靜 脈內皮細胞的生長，且呈量效關係，其結果如下蜈蚣毒素抗腫瘤多肽對人臍靜脈內皮細胞的抑制作用 從以上結果可以看出，蜈蚣毒素抗腫瘤多肽對於人臍靜脈內皮細胞有抑制作用， 且有量效關係。
權利要求
一種蜈蚣毒素抗腫瘤多肽，其特徵在於以蜈蚣毒素為原材料提取，由Phe Thr Gly Gly Asp Glu Ser Arg Ile Gln Glu Gly組成的十二肽，分子量為1296.05Da。
2.根據權利要求1所述抗蜈蚣毒素腫瘤多肽的應用，其特徵在於該多肽具有抗腫瘤作 用，對人臍靜脈內皮細胞的增殖和生長具抑制作用，可作為在製備抗腫瘤藥中的應用。
全文摘要
本發明公布從蜈蚣毒素中分離出的多肽，並對其抗腫瘤活性進行測定。應用超濾及反相色譜等分離方法從蜈蚣毒素中分離純化出一個由十二個胺基酸組成的多肽，應用Edman降解法測得其序列為Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Ser-Arg-Ile-Gln-Glu-Gly，質譜法測得分子量為1296.05Da。並用MTT法測定該多肽的抗癌細胞活性。本發明中的多肽具有抗腫瘤活性，對人臍靜脈內皮細胞的增殖和生長都具有抑制作用，且呈現量效關係，可用於各種癌症的治療及輔助治療。
文檔編號A61P35/00GK101899095SQ20101010480
公開日2010年12月1日 申請日期2010年2月3日 優先權日2010年2月3日
發明者孔毅, 惠晶, 曹豔華, 楊天雨, 賴伊麗, 邵妤 申請人:中國藥科大學