水不溶性喜樹鹼衍生物的亞微粒納米顆粒及其製備方法

2023-05-01 10:56:31

專利名稱：：水不溶性喜樹鹼衍生物的亞微粒納米顆粒及其製備方法水不溶性喜樹鹼衍生物的亞微粒納米顆粒及其製備方法[
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]本發明涉及一種包括喜樹鹼衍生物、固體聚乙二醇和抗締合劑的納米顆粒組合物，及其製備方法。特別地，本發明提供一種包括喜樹鹼衍生物的納米顆粒的組合物，其是通過將水溶性差的喜樹鹼衍生物固體-分散在固體聚乙二醇中，並將該固體分散體溶於包含抗締合劑的水溶液中製備的。本發明的組合物將具有生理活性的喜樹鹼衍生物內酯形式穩定在pH4至7的水溶液中，因此可用作抗癌劑或用於治療細胞分裂相關疾病。7-乙基-10-羥基喜樹鹼，被稱為SN-38，是一種市售可獲得的抗癌劑依立替康(CPT-11)的活性代謝物。據報導，SN-38通過結合拓樸異構酶I來抑制細胞分裂期間的DM合成而誘導細胞死亡，拓樸異構酶I是一種參與細胞分裂過程的酶。然而，SN-38的水溶性差，即水溶性為10jiig/ml或更低，因此，很難開發SN-38作為臨床產物。為此，將SN-38轉化成在水中具有較高溶解度的前藥，即CPT-ll，其已經商業化。當將CPT-ll給藥至人體時，在肝細胞或癌細胞中的酶羧基酯酶將其代謝成生理活性的SN-38,其顯示出抗癌作用。然而，據報導，在人體中CPT-ll轉化成活性SN-38的轉化速率僅僅為約10%或更低。與CPT-11相比，SN-38抑制拓樸異構酶I的活性為約l，OOO倍或更高，體外細胞毒性為約2,000倍或更高。進一步地，已知SN-38在酸性條件下呈活性內酯形式存在，在鹼性條件下呈非活性羧基陰離子形式存在，取決於水溶液的pH。SN-38的羧基陰離子形式可以以4mg/ml或更高的量溶於水中，但其活性內酯形式具有的水溶性為10jag/ml或更低。因此，如果SN-38可以以臨床顯著的濃度或更高濃度增溶，其可以被開發為優良的抗癌劑。為此，進行了有關包括SN-38的組合物給藥至人體的研究。US5,447,936、US5,859,023、US5,674,874、US5,958,937、US5，900，419等公開了通過將SN-38溶於極性有機溶劑中得到的組合物，所述極性有機溶劑比如二曱基乙醯胺、N-曱基-2-吡咯烷酮、二甲基異山梨糖醇酯(dimethylisosorbide)等。然而，人體可耐受的這種極性有機溶劑的量受到限制，並且因為當與水混合時，藥物可沉澱，因而所述藥物的靜脈注射受到限制。而且，當將溶解在有機溶劑中的組合物暴露於pH7.4的體內條件時，SN-38的活性所必需的內酯形式立即分解成其羧基陰離子形式。US-A-2003/0215492描述了一種通過形成SN-38和脂質的複合物得到的脂質體製劑。在該發明中，羧基陰離子形式的SN-38是在pH8-10的水溶液中形成的，由此得到脂質體製劑，內酯形式的SN-38是在酸性條件下製備的。WO2002/58622描述了一種包括SN-38的脂質體組合物和製備該組合物的方法，US-A-2004/0009229描述了一種由喜樹鹼與穩定劑比如聚合物、脂質等的複合物製備的納米顆粒組合物。在該文獻中，為了提供其中具有粒徑為二十或幾百納米的納米顆粒穩定地懸浮在水溶液中的組合物，不是將SN-38加熱或粉碎，而是將其與聚合物或脂質混合形成SN-38/聚合物或SN-38/脂質複合物的納米顆粒。然而，上述文獻沒有提及內酯形式的喜樹鹼是否穩定地保持著。所述組合物的另一個不利的方面是由於與聚合物、脂質等形成複合物的步驟，而使製備過程非常麻煩。進一步地，喜樹鹼衍生物，特別是SN-38在水中的溶解性非常差，因此其不容易製劑。當根據常規增溶技術將它們溶解時，它們很容易在體液(pH7.4)中轉化成其非活性形式，即羧基陰離子形式。[技術問題]本發明人證實可以通過如下方法獲得在體液中穩定地保持著的喜樹鹼衍生物的內酯形式，所述方法包括在高溫下，將喜樹鹼衍生物熔化在固體聚乙二醇中，快速冷卻，然後將其溶於水中，得到SN-38的納米顆粒，從而完成了本發明。特別地，本發明的特點在於將喜樹鹼衍生物固體-分散在水溶性的聚合物聚乙二醇中，然後將其溶於水中，以有效地得到喜樹鹼衍生物的納米顆粒，而不是粉碎所述喜樹鹼衍生物或者形成喜樹鹼衍生物與聚合物的複合物等。本發明的目的是將喜樹鹼衍生物配製成可以臨床施用於人體的製劑。本發明人證實當經由靜脈注射給藥至身體時，轉化成亞微粒納米顆粒的形式的喜樹鹼衍生物在血液中顯示出比由極性有機溶劑、膠束等增溶的現存組合物更優良的內酯穩定性。圖1為在製備例1中製備的一甲氧基聚乙二醇-聚交酯嵌段共聚物(mPEG-PLA)的卞-NMR光傳。圖2為在製備例2中製備的mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯的^-NMR光譜。圖3是顯示使用小鼠的人大腸癌細胞系HT-29觀察的平均相對腫瘤體積(RTV)隨時間變化的圖表，所述小鼠注射了含SN-38的納米顆粒組合物、比較製劑或對照品。圖4是顯示使用小鼠的人胰腺癌細胞系MIA-PaCa-2觀察的平均相對腫瘤體積(RTV)隨時間變化的圖表，所述小鼠注射了含SN-38的納米顆粒組合物、比較製劑或對照品。本發明涉及一種喜樹鹼衍生物的納米顆粒組合物，其包括所述喜樹鹼衍生物、固體聚乙二醇和抗締合劑，所述抗締合劑選自兩親性嵌段共聚物和固體表面活性劑。6本發明進一步涉及用於製備所述納米顆粒組合物的方法，其包括如下步驟(a)將喜樹鹼衍生物熔化在固體聚乙二醇中；(b)通過冷卻在步驟(a)中得到的熔化物，形成固體分散體；和(c)將在步驟(b)中得到的固體分散體溶於兩親性嵌段共聚物或固體表面活性劑的水溶液中。下面詳細闡述本發明的含喜樹鹼衍生物的納米顆粒組合物及其製備方法。本發明的納米顆粒組合物包括(1)作為活性組分的水溶性差的喜樹鹼衍生物，(2)作為分散介質的固體聚乙二醇，和(3)作為抗締合劑的固體兩親性嵌段共聚物或固體表面活性劑。在本發明中，"納米顆粒"指包含分散藥物的納米尺寸的微小顆粒。其微小尺寸不會引起毛細管或注射針頭阻塞，因此，可以經由靜脈注射給藥。根據本發明的含喜樹鹼衍生物的納米顆粒為混懸劑形式的組合物，其中包含喜樹鹼衍生物的納米顆粒懸浮在水溶液中。納米顆淨立的尺寸優選地為100至1000nm。本發明的活性組分水溶性差的喜樹鹼衍生物具有的水溶性為10Hig/ml或更低。因此，臨床使用喜樹鹼衍生物而不採用特定的增溶技術是不可能的。所述喜樹鹼衍生物是基本上具有內酯形式的喜樹鹼的化合物。在本發明中的喜樹鹼衍生物優選地是喜樹鹼或7-乙基-IO-羥基喜樹鹼(SN-38)。本發明的固體聚乙二醇用作用於分散所述喜樹鹼衍生物的介質。其在室溫下呈固體存在，並可以具有40-60匸的熔點。聚乙二醇的重均分子量優選地為1，500至20，000道爾頓，但更優選地為2，000至IO，OOO道爾頓，最優選地為2，000至6，000道爾頓。當聚乙二醇的重均分子量為1,500道爾頓或更高時，其在室溫下可以呈固體存在。當其重均分子量超過20,OOO道爾頓時，產生高粘性的問題。聚乙二醇可以以直鏈或支鏈結構存在，其中直鏈結構是優選的。聚乙二醇的兩端優選地被下述基團保護羥基，烷基，優選(CH)烷基，或醯基，優選烷基羰基或芳基羰基(芳基包括苯基、萘基等)，例如(Ch》醜基，但更優選羥基。特別地，在實施本發明中，優選的聚乙二醇在水溶液中具有的pH值為4至8。具有超過8.0的pH值的聚乙二醇可能在將內酯形式的SN-38轉化成羧基形式中起作用，因此，是不期望的。當藥物喜樹鹼衍生物的含量相對於聚乙二醇增加時，納米顆粒的尺寸增加。因此，為了保持納米顆粒的尺寸為100至1000nm，優選地使用相對於喜樹鹼衍生物的重量為50至1000倍量的聚乙二醇。本發明的納米顆粒包括作為必要成分的抗締合劑。如果將其中喜樹鹼衍生物分散在固體聚乙二醇中的固體分散體懸浮在水溶液中並如此靜置，可能會出現納米顆粒之間的締合，導致粒徑增加。為了防止納米顆粒之間的這種締合，本發明中必須使用抗締合劑。作為抗締合劑，固體兩親性嵌段共聚物或固體表面活性劑是優選的。因為為了使該組合物在長期儲存期間保持穩定，所述納米顆粒組合物優選地在最後步驟冷凍乾燥，所以所述抗締合劑必須在室溫下呈固體存在。因此，所述固體兩親性嵌段共聚物或固體表面活性劑應當在室溫下是固體。所述抗締合劑優選地具有的熔點為3ox:或更高，水溶性為1mg/ml或更高，應當在水溶液中形成膠束，並且當施用於人體時，不應當顯示出任何毒性，比如引起過敏反應等。符合上述要求的兩親性嵌段共聚物優選地為A-B型二嵌段共聚物，其中所述親水性嵌段(A)具有的重均分子量為l，OOO至10，000道爾頓，所述疏水性嵌段(B)具有的重均分子量為500至10，000道爾頓。每個嵌段的重均分子量的下限為嵌段共聚物可以形成膠束的最小分子量。如果每個嵌段的重均分子量超過10，000道爾頓，由於高粘性不能保持溶液態，並且當給藥人體後共聚物在血液中可能需要長時間分解，會引起不期望的毒性。特別優選的是所述嵌段共聚物以A-B型存在，其中親水性嵌段(A)與疏水性嵌段(B)經由酯鍵結合。所述親水性嵌段(A)與疏水性嵌段(B)的重量比可以是10-90%:90-10°/。。優選地，所述親水性嵌段(A)為聚乙二醇或單曱氧基聚乙二醇，所述疏水性嵌段(B))選自聚乳酸、聚己8酸內酯、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚二噁烷-2-酮及乳酸和1，4-二噁烷-2-酮的共聚物。特別地，為了增加所述兩親性嵌段共聚物A-B的疏水性，並最終提高所述喜樹鹼衍生物的親和力，將選自月桂酸、棕櫚酸(palmitoicacid)、硬脂酸、油酸、生育酚琥珀酸酯和膽固醇琥珀酸酯中的一種可以經由酯鍵加至疏水性嵌段(B)的末端。優選地，引入生育酚琥珀酸酯。兩親性嵌段共聚物的含量優選地為喜樹鹼衍生物重量的1至400倍，但更優選地為10至200倍。作為優選的抗締合劑的固體表面活性劑為在室溫下是固體的非離子表面活性劑，優選聚乙二醇生育酚琥珀酸酯(TPGS)。合適的是所述聚乙二醇的重均分子量為1，000至5，000道爾頓。只有當聚乙二醇的重均分子量為1，000道爾頓或更高時，表面活性劑可以在室溫下呈固體存在。如果重均分子量超過5，000道爾頓，可能產生不期望的高粘性問題。因此，這樣的生理學可接受的和典型使用的表面活性劑如聚山梨酯、chremophore等作為用於本發明中的納米顆粒的抗締合劑是不合適的，因為它們在室溫下都呈液體存在。固體表面活性劑的含量優選地為喜樹鹼衍生物重量的l至400倍，但更優選地為IO至200倍。本發明的納米顆粒可以配製成用於給藥目的的多種藥物形式。為了製備抗癌組合物，將本發明的納米顆粒與可藥用載體充分混合。這些藥物組合物優選地配製成可以口服、腸胃外、皮下、直腸或局部給藥以獲得全身或局部作用的劑型。任何常見的藥物栽體比如水、二醇、油、醇等都可以是口服液體製劑可接受的，這樣的賦形劑如澱粉、糖、高冷土、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等都可以是口服固體製劑可接受的。對於可注射的製劑，所述載體可以包括其它組分比如作為溶出助劑的半極性溶劑，但應當包括相當量的無菌水。作為在可注射的溶液中的載體，可以使用生理鹽水、葡萄糖溶液或生理鹽水和葡萄糖的混合物。可以使用合適的液體栽體、混懸劑等製備可注射的懸浮液。用於製備根據本發明的納米顆粒組合物的方法包括下述步驟(a)將喜樹鹼衍生物熔化在固體聚乙二醇中；(b)通過冷卻在步驟(a)中得到的熔化物，形成固體分散體；和(c)將在步驟(b)中得到的固體分散體溶於兩親性嵌段共聚物或固體表面活性劑的水溶液中。在步驟(a)中，將水溶性差的喜樹鹼衍生物與固體聚乙二醇混合，並優選地加熱至60-180X:的溫度。當加熱時，應當持續攪拌該混合物至喜樹鹼衍生物熔化在固體聚乙二醇中。為了熔化固體聚乙二醇，溶化溫度必須為60r或更高，持續攪拌有助於水溶性差的喜樹鹼衍生物溶於聚乙二醇中。為了避免喜樹鹼衍生物和聚乙二醇分解以及穩定地熔化它們，熔化溫度必須為180X:或更低。考慮到喜樹鹼衍生物在聚乙二醇中的溶解性，所述喜樹鹼衍生物應當與固體聚乙二醇以可以充分熔化的比例混合。優選地，所述固體聚乙二醇以所述喜樹鹼衍生物重量的50至IOOO倍的重量比與所述喜樹鹼衍生物混合。另一方面，可以任選地將具有低沸點的有機溶劑用於上述熔化步驟中，以有效地將所述水溶性差的喜樹鹼衍生物熔化在固體聚乙二醇中，所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、二氯曱烷、丙酮和乙腈。喜樹鹼衍生物和固體聚乙二醇的熔化溶液是通過加入合適的有機溶劑，然後在減壓下將有機溶劑除去製備的。如果在除去有機溶劑後，將該溶液連續地加熱至60-180匸的溫度，並均勻地攪拌，則可以滿意地保持其中喜樹鹼衍生物熔化在聚乙二醇中的狀態。在步驟(b)中，將從步驟(a)得到的其中喜樹鹼衍生物熔化在聚乙二醇中的熔化溶液快速冷卻，優選地冷卻至ox:或更低的溫度，形成固體分散體。優選地使用例如液氮儘可能快速地冷卻該熔化的溶液。如果緩慢地冷卻該熔化的溶液，聚乙二醇可以結晶出，引起水溶性差的喜樹鹼衍生物的粒徑增加。在步驟(c)中，將從步驟(b)得到的固體分散體溶於包含抗締合劑的水溶液中，得到包含喜樹鹼衍生物的納米顆粒的水性混懸液，所述抗締合劑選自兩親性嵌段共聚物和固體表面活性劑。聚乙二醇可以溶於水溶液中，但是分散在聚乙二醇中的喜樹鹼衍生物不溶於水中。因此，聚乙二醇溶解，分散在納米顆粒尺寸中的喜樹鹼衍生物懸浮在水溶液中。如果水溶液顯示出pH7.5或更高的鹼性，所述水溶性差的喜樹鹼衍生物會轉化成其羧基陰離子形式，因此，優選地保持納米顆粒的水溶液為pH4-7,以防止這種轉化。可以使用的pH調節劑優選地為檸檬酸、乙酸、酒石酸、碳酸、乳酸、硫酸、磷酸或其鹼金屬鹽，比如鈉鹽或鉀鹽、或銨鹽，最優選乳酸。有可能地是，包含在上述製備的納米顆粒懸浮液中的喜樹鹼衍生物的濃度範圍為0.1-4mg/ml，但優選0.2-2mg/ml。將其中所述喜樹鹼衍生物分散在固體聚乙二醇中的固體分散體溶於包含抗締合劑的水溶液中，以製備其中懸浮包含喜樹鹼衍生物的納米顆粒的水溶液。在本文中，優選地所述抗締合劑溶於所述水溶液中的濃度為1-200mg/ml，溶液的pH範圍為4.0-7.0。為了增加固體聚乙二醇在水中的溶出速率，提高溫度至0至60X:是可能的。優選地，溶出在30。C或更低的溫度下進行。可以使用超聲處理來增加聚乙二醇在水中的溶出速率，並且誘導包含水溶性差的喜樹鹼衍生物納米顆粒的均勻分散。用於製備根據本發明的納米顆粒的方法可以包括用於冷凍乾燥從步驟(C)得到的水溶液的另一個步驟(d)。在步驟(d)中，冷凍乾燥從步驟(c)得到的懸浮在水溶液中的包含喜樹鹼衍生物的納米顆粒，在這期間，優選地將選自乳糖、甘露醇和山梨醇的冷凍乾燥助劑加入所述水溶液中。如上製備的冷凍千燥形式的本發明的納米顆粒可以通過在注射用水或生理鹽水中稀釋或重構來使用。如果用注射用水、生理鹽水、5%的葡萄糖溶液等將本發明的納米顆粒重構成喜樹鹼衍生物的濃度為0.1-1.Omg/ml，則該溶液中活性內酯形式的喜樹鹼衍生物的含量基本上為100%。該溶液可以口服或腸胃外給藥。下述實施例將更清楚地解釋實施本發明的方式。然而，應當理解這些實施例是用來闡述本發明，決不限制本發明的範圍。本發明的其它方面對本發明所屬領域的普通技術人員是顯而易見的。製備例1單甲氧基聚乙二醇-聚交酯(mPEG-PLA)嵌段共聚物(AB型)的聚合將500g的單甲氧基聚乙二醇(重均分子量；Mw:2，000)引入到100ml的2-頸圓底燒瓶中，並在減壓下加熱至IOOX:2-3小時以除去水。用無水氮氣充滿該反應燒瓶。使用注射器以相對於D，L-丙交酯0.1。/。重量(lg,2.5mol)的量加入反應催化劑辛酸亞錫[Sn(Oct)2]。在攪拌30分鐘後，將該混合物放置在130TC和減壓(lmiiiHg)條件下1小時，以除去催化劑溶於其中的溶劑(甲苯)。加入1375g純化的丙交酯，並在130C加熱18小時。將得到的聚合物溶於二氯甲烷中，通過加入乙醚沉澱出。在真空烘箱中乾燥如此得到的聚合物48小時。得到的mPEG-PLA具有的重均分子量為1,765-2，000道爾頓，通過1H-NMR確認其為A-B型(圖1)。製備例2mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯的合成在室溫下，使在製備例1中得到的mPEG-PLAaOg)和生育酚琥珀酸酯(SigmaCo.，1.55g;聚合物的摩爾量的1.2倍)與二環己基碳二亞胺(DCC;0.76g)和催化劑二甲基氨基吡啶(DMAP;0.045g)在溶劑乙腈(50ml)中反應24小時。在反應完成後，通過玻璃濾器過濾除去副產物二環己基碳脲(DCU)。通過用鹽酸水溶液萃取除去殘留的催化劑。向純化的產物溶液中，加入硫酸鎂以除去殘留水分。產物在正己烷/乙醚(v/v-7/3)的助溶劑系統沉澱出，重結晶，得到mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯。過濾沉澱的聚合物產物，並在真空中乾燥，得到白色顆粒(10g;產率88.6%)，通過^-NMR確認其特性(圖2)。製備例3mPEG-PLA-棕櫚酸酯的合成12將在製備例1中得到的mPEG-PLA(lOg)和棕櫚醯氯溶於乙腈(50ml)中，並回流6小時。在反應完成後，將反應產物加入到正己烷/乙醚(v/v=7/3)的助溶劑系統中，沉澱出mPEG-PLA-棕櫚酸酯。過濾得到的聚合物沉澱物，並在真空下乾燥，得到白色固體(12g;產率95%)。[實施例]實施例1SN-38/PEG4000/mPEG-PLA生育酚琥珀酸酯嵌段共聚物納米顆粒的製備將SN-38(5mg)和聚乙二醇(分子量4000道爾頓，1000mg)引入250ml的圓底燒瓶中，該圓底燒瓶置於160'C的油浴中。當用磁力攪拌器攪拌時，使該混合物在室溫下靜置2小時以將SN-38熔化在聚乙二醇中。接著，將該反應容器冷卻至室溫，然後，通過將該容器放置在液氮中快速冷卻以產生SN-38分散在其中的固體聚乙二醇。將10ml在製備例2中得到的兩親性二嵌段共聚物mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯以50mg/ml的濃度溶於其中的水溶液加入其中。在超聲處理下溶解該固體聚乙二醇，得到其中懸浮SN-38納米顆粒的水溶液。加入500mg的乳糖一水合物並溶解。調節該水溶液的pH至4.0-7.0。通過具有孔徑為800nm的過濾器過濾得到的包含SN-38納米顆粒的水性懸浮液，並冷凍乾燥。用注射用水重構該冷凍乾燥的組合物，然後分析SN-38的產率、在重構後納米顆粒水溶液中SN-38的濃度、SN-38內酯的含量和納米顆粒的尺寸。從最終回收的SN-38水溶液中的SN-38的含量相對於通過在合適的含水溶劑中透析或離心(30，000xg，lh)的SN-38的最初含量來確定樣品的產率。將樣品溶於甲醇中，通過HPLC來測量SN-38在樣品水溶液中的濃度。根據在使用C18Vydac柱的HPLC分析中，在大約4分鐘的羧基陰離子峰和在大約12分鐘分鐘的內酯峰值來測定SN-38內酯含量，計算相對於pH10的鹼性水溶液中總羧基離子含量或pH2的酸性水溶液中總內酯含量而言SN-38水溶液中的內酯含量。通過DLS(動態光散射)方法來測量樣品的粒徑。-PEG4000/mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯嵌段共聚物的重量比2/1-SN-38的產率98%-在重構後，納米顆粒水溶液中SN-38的濃度0.5mg/ml-SN-38內酯的含量100%-納米顆粒的尺寸400nm實施例2SN-38/PEG4000/mPEG-PLA-生育酚(tocophenrol)琥珀酸酯嵌段共聚物納米顆粒的製備將SN-38(10mg)和聚乙二醇(分子量4000道爾頓，3000mg)引入500ml的圓底燒瓶中。加入100ml的曱醇和250ml的二氯甲烷以充分溶解SN-38和聚乙二醇。在減壓下除去有機溶劑。然後，將得到的混合物加熱至160匸，並使其靜置2h，同時使用磁力攪拌器連續攪拌以將SN-38熔化在聚乙二醇中。將該反應容器冷卻至室溫，然後，通過將該容器放置在液氮中快速冷卻以產生SN-38分散在其中的固體聚乙二醇。將10ml在製備例2中得到的兩親性二嵌段共聚物mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯以50mg/ml的濃度溶於其中的水溶液加入其中。在超聲處理下溶解該固體聚乙二醇，得到其中懸浮SN-38納米顆粒的水溶液。加入600mg的乳糖一水合物並溶解。調節該水溶液的pH至4.0-7.0。通過具有孔徑為800nm的過濾器過濾得到的包含SN-38納米顆粒的水性懸浮液，並冷凍乾燥。用注射用水重構該冷凍乾燥的組合物，然後分析SN-38的產率、在重構後納米顆粒水溶液中SN-38的濃度、SN-38內酯的含量和納米顆粒的尺寸。-PEG4000/mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯嵌段共聚物的重量比6/1-SN-38的產率99%-在重構後，納米顆粒水溶液中SN-38的濃度0.5mg/ml-SN-38內酯的含量100%-納米顆粒的尺寸500nm實施例3基於SN-38/PEG4000/mPEG-PLA嵌段共聚物的納米顆粒組合物的製備根據如實施例l相同的方法製備SN-38納米顆粒組合物，不同在於使用lg在製備例1中得到的mPEG-PLA嵌段共聚物(Mw;1，800-2，000)、8g的PEG4000和40mg的SN-38。用注射用水重構該製備的組合物，然後分析SN-38的產率、在重構後納米顆粒水溶液中SN-38的濃度和SN-38內酯的含量。-PEG4000/mPEG-PLA嵌段共聚物的重量比:8/1-SN-38的產率90%-在重構後，納米顆粒水溶液中SN-38的濃度0.4mg/ml-SN-38內酯的含量100%實施例4基於SN-38/PEG4000/mPEG-PLA-棕櫚酸酯的納米顆粒組合物的製備根據如實施例l相同的方法製備SN-38納米顆粒水溶液，不同在於使用lOOmg在製備例3中得到的mPEG-PLA-棕櫚酸酯、400mg的PEG4000和1.Omg的SN-38。用注射用水重構該製備的組合物，然後分析SN-38的產率、在重構後納米顆粒水溶液中SN-38的濃度和SN-38內酯的含量。-PEG4000/mPEG-PLA-棕櫚酸酯的重量比4/1-SN-38的產率95%-在重構後，納米顆粒水溶液中SN-38的濃度0.5mg/mi-SN-38內酯的含量100%實施例5基於SN-38/PEG4000/生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)的納米顆粒組合物的製備根據如實施例l相同的方法製備SN-38納米顆粒水溶液，不同在於使用70mg的生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，維生素-E聚乙二醇一1000—號多白酸酉旨，EastmanChemicalCo.,KingsportTerm.，Mn;1，000)、21g的PEG4000和70mg的SN-38。用注射用水重構該製備的組合物，然後分析SN-38的產率、在重構後納米顆粒水溶液中SN-38的濃度和SN-38內酯的含量。-PEG4000/生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，Mn;l，OOO)的重量比300/1-SN-38的產率93%-在重構後，納米顆粒水溶液中SN-38的濃度0.7mg/ml，-SN-38內酯的含量100%實施例6基於包含SN-38固體聚乙二醇的納米顆粒組合物的製備根據固體聚乙二醇的分子量，製備僅使用在下表中顯示的重量比的藥物和分散介質固體聚乙二醇的組合物。根據如實施例l相同的方法製備每種組合物。然而，在最後的步驟中，加入不含有抗締合劑的pH5-6的水溶液(lml)，得到最終組合物。在室溫下，在製備後(Oh)立即、4小時和24小時後，測量所得組合物的納米顆粒尺寸。用具有孔徑為800nm的過濾器過濾組合物，並測量濾液中藥物的濃度，以測定如在表l中顯示的藥物含量。[表l〗組合物l-9的組分比例、粒徑和藥物含量藥物分散介質[固體聚乙二醇]粒徑(nm)含量(mg/ml)SN-38(mg)PEG2000(mg)PEG4000(mg)PEG10，000(mg)0h4h24h組合物11200—-950130020000.15組合物21300—-930100017000,20組合物31400一-75090015000.45組合物41一200-600100015000.30組合物51—300-50090011000.50組合物61—400-權85010000.65組合物71——20040080011000.40組合物81一—30035075010000.65組合物91——楊憎70010000.75使用固體聚乙二醇而不含抗締合劑製備的SN-38納米顆粒水性懸浮液顯示出隨時間不穩定的粒徑，在室溫下將其靜置24小時後，得到lOOOnm或更高的粒徑。因此，需要使用這樣的抗締合劑作為表面活性劑來確保所述組合物的穩定性。實施例7包含SN-38的納米顆粒組合物為了補充實施例6的結果，使用充當表面活性劑的抗締合劑來製備包含SN-38的納米顆粒組合物。根據如實施例1相同的方法製備在下表2中顯示的重量比的SN-38納米顆粒組合物。向這些組合物中加入相對於總組合物重量比為15%的用作冷凍乾燥時結塊物質的D，L-甘露醇。在室溫下，攪拌該混合物15分鐘。用具有孔徑為800nm的過濾器過濾得到的納米顆粒水溶液，將等量的該物質分布在玻璃小瓶中以便包括相同含量的藥物，並冷凍乾燥。用生理鹽水重構該冷凍乾燥的組合物至濃度為0.5mg/ml。在室溫下，在0小時(重構後立即)、4小時和24小時測量SN-38的粒徑和pH，顯示在表2中。17[表2〗組合物10-20的組分比例、粒徑和藥物含量tableseeoriginaldocumentpage18*a)mPEG-PLA-OH的分子量(道爾頓)[2K-1800]b)mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯的分子量(道爾頓)[2K-860-530]c)TPGS[d-oc-生育酚聚乙二醇IOOO琥珀酸酯]表2的組合物保持在水溶液中100%的內酯形式24小時。由於加入抗締合劑的結果，藥物的粒徑隨時間是穩定的。試驗例1包含SN-38的納米顆粒組合物的穩定性將在實施例2、3和5中製備的每種注射用冷凍乾燥的組合物貯藏在25'C下6個月。通過測量形態、保持比例(含量)、％內酯、再溶時間、pH變化和平均納米顆粒尺寸來檢驗組合物的穩定性。將結果顯示在表3中。[表3]注射用冷凍乾燥的組合物的形態、保持比例(含量)、％內酯、再溶時間、pH變化和平均納米顆粒尺寸(在25匸下貯存6個月後)tableseeoriginaldocumentpage19根據本發明製備的冷凍乾燥的組合物甚至在長期儲存後仍然穩定，據評價適於臨床應用。試驗例2包含SN-38的納米顆粒組合物的藥代動力學性質為了鑑定在實施例2、3和5中製備的每種冷凍乾燥的組合物的藥代動力學性質，將插管引入稱重為200~250g的雄性Sprague-Dawley大鼠的頸靜脈和頸動脈。經IO秒的時間間隔，經由尾部靜脈以2mg/kg的劑量將每種組合物注入。在注射後5分鐘、15分鐘、30分鐘、l小時、2小時、4小時和8小時，從頸動脈採集0.4ml的血液樣品，離心得到澄清的上層血漿。向其中加入用10°/。的ZnS04和200mM的乳酸鹽緩衝液(pH3.5)調節為pH5.5的甲醇，以分析血漿中藥物的濃度。強力混合該混合物30秒，然後離心。收集上清液，轉移到透明的管中。通過在下述條件的HPLC來測量濃度注射體積0.085ml流速1ml/分鐘檢測器FLD波長Ex355nm，Em515nm流動相乙腈/3%的三乙胺水溶液=80/20體積比的溶劑混合物，使用乙酸調節至pH5.5柱4.6x250mm(C18，Vydac，USA)分析從給藥納米顆粒中釋放的SN-38內酯的血漿濃度，顯示在表4中。作為比較製備例，使用在用生理鹽水稀釋後SN-38的水溶性前藥，Campt(^注射劑(20mg/ml，CJPharma/Pfizer，USA)。[表4]從給藥的納米顆粒中釋放的SN-38內酯的血漿濃度劑型SN-38內酯的血漿濃度Ug/ml)(mg/kg)5憤15憤30嫂1小時2小時4小時8小時實施例221.82620.43170.18730.05970.00730.00350.0027實施例324.08100.45820.15590.03680,00830.00290.0013實施例521.51900.18510.07450.02930.01700.00600.0066比較制鈔J60.21390.13030.05340.07050.04190.01790.003試驗例3包含SN-38的納米顆粒組合物的體內抗癌的活性使用在實施例2中製備的納米顆粒組合物的功效來評價抗癌活性。作為比較製備例，使用在用生理鹽水稀釋至CPT-ll含量為1.5mg/ml的注射用Campto(20mg/ml，CJPharma/Pfizer,USA)。收集保存在液氮中的細胞，並進行體外細胞培養。收集細胞，用無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌，並計算活細胞。將細胞以約7xl07細胞/ml的數目再懸浮在無菌PBS中。將0.lml的包含7乂106人癌細胞(HT-29,MIA-Paca-2)的細胞懸液皮下注射至健康無胸腺棵鼠的右側(nu/nu;20-25g，8周)。在癌生長至某一尺寸後，進行異種移植三次，以形成3-4mm的異種移植物。使用12標準規格的套管針(trocaneedle)，將該異種移植物皮下注射至健康無胸腺棵鼠(nu/nu;20-25g,8周)的右側。在腫瘤體積達到100-300mm3後，給藥藥物。記錄給藥藥物的當天，作為0天。在0天，將小鼠分成五(5)個組，在第0、1、2、3、4和5天，經由尾部靜脈分別給藥在實施例2中和在比較製備20例中製備的包含SN-38的納米顆粒，並以不同的時間間隔測量腫瘤的體積。根據下述等式計算肺瘤體積。腫瘤體積(TV)-0,5xLxW2(L:主軸，W:短軸)相對腫瘤體積(RTVH(Vt/V。)xioo%(Vt:在t天的TV，V。在0天的TV)通過考慮平均腫瘤增殖曲線、最佳生長抑制(T/C。/。)和特定生長延遲(SGD)的所有方面來確定治療效果。在最後注射後四周內的某天，通過治療組比對照組的RTV中間值乘以100%(T/C。/。)來計算最佳生長抑制。經1至2個倍增時間如下計算SGD:特定生長延遲(SGD)=(TD處理組-T。對照組)/T。對照組TD:肺瘤倍增時間活性水平定義如下。tableseeoriginaldocumentpage21為了證實試驗的正確性，每個處理組使用至少7隻小鼠，每組使用至少7種肺瘤。在處理開始時，初始腫瘤的直徑為4mm，或體積為30mm3。將在最終給藥所述藥物後2周內死亡的動物歸類為中毒性死亡，從評價中排除。具有超過三分之一動物死亡歸於中毒性死亡的組，或者具有平均體重降低超過15%且沒有顯示出完全恢復跡象的動物的組被認為沒有抗腫瘤活性。如從表5、圖3和4可看到的，與對照組相比，用實施例2中製備的包含SN-38的納米顆粒組合物處理的組顯示出抗癌症生長相當大的抑制活性，其特別地高於比較製劑的抗癌活性。[表5]tableseeoriginaldocumentpage22*HT-29(CPT-ll20mg/kg，SN-3810mg/kg)**MIA-PaCa-2(CPT-ll10mg/kg，SN-3810mg/kg)[工業實用性〗根據本發明的納米顆粒組合物為包含水溶性差的喜樹鹼衍生物的納米顆粒混懸劑，其特徵在於延遲了當用水溶液比如生理鹽水稀釋或重構時活性內酯形式向非活性形式的轉化。而且，本發明的顯著之處在於其提供水溶性差的喜樹鹼衍生物的增溶、納米顆粒的製備及用於治療癌症的新藥的開發。權利要求1.一種喜樹鹼衍生物的納米顆粒組合物，其包括喜樹鹼衍生物、固體聚乙二醇和抗締合劑，所述抗締合劑選自固體兩親性嵌段共聚物和固體表面活性劑。2.權利要求1的組合物，其中所述喜樹鹼衍生物是具有水溶性為10jug/ffll或更低的化合物。3.權利要求1或2的組合物，其中所述喜樹鹼衍生物是喜樹鹼或7-乙基-10-羥基喜樹鹼。4.權利要求1的組合物，其中聚乙二醇具有的重均分子量為l'500至20，000道爾頓。5.權利要求1或4的組合物，其中聚乙二醇的兩端被羥基、烷基或醯基基團保護。6.權利要求1的組合物，其中所包含的聚乙二醇的量為所述喜樹鹼衍生物重量的50至1000倍。7.權利要求1的組合物，其中所述兩親性嵌段共聚物為A-B型二嵌段共聚物，其中所述親水性嵌段(A)具有的重均分子量為1,000至10，OOO道爾頓，所述疏水性嵌段(B)具有的重均分子量為500至10，000道爾頓。8.權利要求7的組合物，其中所述親水性嵌段(A)為聚乙二醇或單甲氧基聚乙二醇，所述疏水性嵌段(B)選自聚乳酸、聚己酸內酯、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚二噁烷-2-酮及乳酸和1,4-二噁烷-2-酮的共聚物。9.權利要求7或8的組合物，其中所述親水性嵌段(A)為單甲氧基聚乙二醇，並且將選自月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、生育酚琥珀酸酯和膽固醇琥珀酸酯中的一種經由酯鍵加至所述疏水性嵌段(B)的末端。10.權利要求l的組合物，其中所述固體表面活性劑為聚乙二醇生育酚琥珀酸酯，其中的聚乙二醇具有的重均分子量為1，000至5，000道爾頓。11.權利要求l的組合物，其中所包含的每種抗締合劑的量為所述喜樹鹼衍生物重量的1至400倍。12.權利要求1的組合物，其中納米顆粒的尺寸為IOO至1000nm。13.權利要求l的組合物，其中所述納米顆粒組合物以冷凍乾燥的形式存在。14.權利要求l的組合物，其進一步包括可藥用載體，並且用於治療癌症。15.—種用於製備根據權利要求1的納米顆粒組合物的方法，其包括步驟(a)將喜樹鹼衍生物熔化在固體聚乙二醇中；(b)通過冷卻在步驟(a)中得到的熔化物，形成固體分散體；和(c)將在步驟(b)中得到的固體分散體溶於固體兩親性嵌段共聚物或固體表面活性劑的水溶液中。16.權利要求15的方法，其包括冷凍乾燥在步驟(c)中得到的水溶液的另一個步驟。17.權利要求15的方法，其中在步驟(a)中的熔化溫度為60-180r。18.權利要求15的方法，其中在步驟(a)中使用的有機溶劑選自甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮和乙腈，並且在減壓下除去所述有機溶劑。全文摘要本發明涉及一種包含喜樹鹼衍生物、固體聚乙二醇和抗締合劑的納米顆粒組合物，及其製備方法。特別地，本發明提供一種包含喜樹鹼衍生物的納米顆粒的組合物，其是通過將水溶性差的喜樹鹼衍生物固體分散在聚乙二醇中，並將該固體分散體溶於包含抗締合劑的水溶液中製備的。本發明的組合物穩定了在體液中的具有有效的抗癌活性的喜樹鹼衍生物內酯形式。文檔編號A61K9/16GK101516346SQ200780035833公開日2009年8月26日申請日期2007年9月20日優先權日2006年9月26日發明者任垠映,姜惠媛,徐敏孝申請人:株式會社三養社