一種產腈水合酶優良菌種的選育方法

2023-08-12 21:35:01 1

專利名稱：一種產腈水合酶優良菌種的選育方法
技術領域：
本發明涉及一種產腈水合酶優良菌種的選育方法。
背景技術：
腈水合酶(nitrile hydratase, NHase)是生物催化法生產丙烯醯胺(acrylamide, AM)的催化劑，能催化丙烯腈(acrylonitrile, AN)水合生成丙烯醯胺。該酶的活性大小是微生物法生產丙烯醯胺的關鍵技術。在工業生產中，當丙烯醯胺達到一定濃度後，腈水合酶的催化速率顯著降低，丙烯醯胺濃度很難有進一步提高，終濃度通常為300 400 g/L。要得到丙烯醯胺晶體，還要通過蒸氣濃縮及結晶才能得到98%的含量，生產中得到的結果表明，提高丙烯醯胺溶液百分比濃度可減少蒸氣用量，所以提高腈水合酶 菌的丙烯醯胺耐受性有重要的意義。

發明內容
本發明的目的在於克服上述現有技術的不足，提供一種產腈水合酶優良菌種的選
育方法。為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為
(1)接種發酵液的製備在無菌室內，將諾卡氏菌斜面菌種接種於裝有發酵培養基的錐形瓶內，將錐形瓶放入搖床進行發酵培養，搖床轉速設定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養IOOh後得到具有腈水合酶活性的發酵液；
(2)耐受性培養按照步驟(I)製備菌體發酵液，當發酵培養IOOh時，每隔l-2h向搖瓶發酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml繼續搖瓶培養，同時，每隔l_2h取樣進行平板菌落計數和酶活測定，篩選出一株最耐丙烯醯胺的二次出發菌種；
(3)低溫馴化培養步驟(2)中得到二次出發菌種，取其發酵液5ml稀釋100倍後，平皿塗布，分別置於10-20°C的培養箱裡低溫培養100h，觀察菌體生長情況；
(4)擴大培養將長出少數菌落的菌種進行搖瓶發酵，搖床轉速設定為150-200r/min,溫度為28±2°C，培養IOOh後分別檢測不同低溫處理的腈水合酶酶活，從而得到酶活性最高的菌株。優選地，所述的斜面和平板培養基的配方為葡萄糖15-20 g/1, K2HPO4 O. 5-0. 6g/I，酵母浸膏 4.5-5. Og/1 ,MgSO4 · 7H20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9_1· 0，磷酸氫二鉀 O. 5-0. 6,尿素 7-7. 5g/l，消泡劑 IOOppm,瓊脂 20. O -25. Og/Ι ；
優選地，所述的發酵培養基配方為葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏
7.0-9. Og/1, MgSO4 ·7Η20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4_1· 5 g/1，脲 7· 0-8.0 g/1，消泡劑 150ppm。本發明的優點在於對諾卡氏菌進行丙烯醯胺耐受性培養和低溫馴化培養，優選得到腈水合酶酶活性高達1643萬μ /mg的菌株，比原諾卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854萬u/mg提聞了 92%。同時該菌株對丙稀酸胺的耐受:性也提聞了 20%。
具體實施例方式以下實施例僅為了進一步說明本發明，並不限制本發明的內容。實施例I
I、斜面和平板培養基的配製
葡萄糖 15-20 g/1 ,K2HPO4 0.5-0. 6g/l，酵母浸膏 4. 5-5. Og/1 ,MgSO4 ·7Η20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9-1. 0，磷酸氫二鉀 O. 5-0. 6，尿素 7-7. 5g/l，消泡劑 IOOppmJl^g 20. O -25. Og/L·2、發酵培養基配製 葡萄糖 20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏 7. 0-9. Og/1, MgSO4 · 7H20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4-1. 5 g/U7.0-8.0 g/1，消泡劑 150ppm。3、耐受性實驗
在無菌室內，將諾卡氏菌斜面菌種接種於裝有發酵培養基的錐形瓶內，將錐形瓶放入搖床進行發酵培養，搖床轉速設定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養IOOh後得到具有腈水合酶活性的發酵液，每隔I. 5h向搖瓶發酵液中加入含量99%的丙烯腈2ml繼續搖瓶培養，通過平板菌落計數觀察菌種生長情況，發現113. 5h時，菌體的存活率最低，只有
O.0013%，腈水合酶活性為510萬μ /mg。2、低溫馴化實驗
將上述113. 5h時得到的二次出發菌種，取其發酵液5ml稀釋100倍後，平皿塗布，分別置於10°C、12°C、14°C、16°C、18°C >20 V的培養箱裡低溫培養100h，觀察菌體生長情況，獲得30個殘存菌落，將30個菌落的菌種進行搖瓶發酵，搖床轉速設定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養IOOh後分別檢測不同低溫處理的腈水合酶酶活，發現18°C下培養一菌株的酶活性最高，其腈水合酶活性達到1643萬μ/mg，比原諾卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854萬μ/mg提高了 92%，同時該菌株對丙烯醯胺的耐受性也提高了 20%。
權利要求
1.一種產腈水合酶優良菌種的選育方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)接種發酵液的製備在無菌室內，將諾卡氏菌斜面菌種接種於裝有發酵培養基的錐形瓶內，將錐形瓶放入搖床進行發酵培養，搖床轉速設定為150-200r/min，溫度為28±2°C，培養IOOh後得到具有腈水合酶活性的發酵液； (2)耐受性培養按照步驟(I)製備菌體發酵液，當發酵培養IOOh時，每隔l-2h向搖瓶發酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml繼續搖瓶培養，同時，每隔l_2h取樣進行平板菌落計數和酶活測定，篩選出一株最耐丙烯醯胺的二次出發菌種； (3)低溫馴化培養步驟(2)中得到二次出發菌種，取其發酵液5ml稀釋100倍後，平皿塗布，分別置於10-20°C的培養箱裡低溫培養100h，觀察菌體生長情況； (4)擴大培養將長出少數菌落的菌種進行搖瓶發酵，搖床轉速設定為150-200r/min,溫度為28±2°C，培養IOOh後分別檢測不同低溫處理的腈水合酶酶活，從而得到酶活性最高的菌株。
2.根據權利要求I所述的一種產腈水合酶菌種的選育方法，其特徵在於所述的斜面和平板培養基的配方為葡萄糖15-20 g/1，K2HPO4 O. 5-0. 6g/l，酵母浸膏4. 5-5. Og/1,MgSO4 ·7Η20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9-1.0，磷酸氫二鉀 O. 5-0. 6，尿素 7-7. 5g/l，消泡劑IOOppm,瓊脂 20. O -25. Og/Ι。
3.根據根據權利要求I所述的一種產腈水合酶菌種的選育方法，其特徵在於所述的發酵培養基配方為葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏7. 0-9. Og/1,MgSO4 ·7Η20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4_1· 5 g/1，脲 7.0-8.0 g/1，消泡劑 150ppm。
全文摘要
本發明公開了一種產腈水合酶優良菌種的選育方法，對諾卡氏菌進行丙烯醯胺耐受性培養得到單菌落，經過搖瓶發酵得到二次出發菌種，再通過低溫馴化培養，優選性能優良的腈水合酶酶菌種，其酶活性高達1643萬μ/mg，比原諾卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854萬μ/mg提高了92%，同時該菌株對丙烯醯胺的耐受性也提高了20%。為後續的丙烯醯胺生產提供高效的催化劑。
文檔編號C12N1/20GK102776142SQ20121025164
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者張小琴, 曹豔, 楊濤, 水瑞芬, 沈瑞華, 熊光輝, 顧稀平 申請人:江蘇南天農科化工有限公司