松墨天牛寡糖基轉移酶亞基STT3B基因克隆及應用的製作方法

2023-08-13 02:05:11

本發明屬於分子生物學基因克隆領域，具體涉及一種松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因序列的克隆及其應用。

背景技術：

真核寡糖基轉移酶(ost)位於內質網(er)腔內，參與多肽n-糖基化的催化，其亞基stt3b(dolichyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycosyltransferasesubunit)和stt3a是哺乳動物ost的一組輔助單元，其酶動力學特性和底物都不同，但在參與n-糖基化時有部分功能重疊。stt3a緊鄰蛋白易位通道，保證nxt/s位點的共翻譯糖基化，stt3b修飾stt3a在糖基化過程中的遺漏位點，並參與內質網介導的降解途徑。

松墨天牛(monochamusalternatushope)，屬於鞘翅目(coleoptera)，天牛科(cerambycidae)，是重要檢疫性有害生物松材線蟲(bursaphelenchusxylophilus(steiner&buhrer))的主要傳播媒介。本發明首次克隆了松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因，為深入研究stt3b在昆蟲中的功能奠定基礎，為糖基化修飾研究提供理論數據，也為防治松墨天牛及松材線蟲病提供有力支持。

技術實現要素：

本發明的目的在於：(1)提供一種dna序列，其是在松墨天牛克隆得到的寡糖基轉移酶亞基stt3b的基因，命名為mastt3b；(2)提供一種胺基酸序列，其是松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因編碼的胺基酸序列。

在下文中將詳細描述本發明。

(一)本發明提供了一種松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

將採自廣州市從化區馬尾松次生林的松墨天牛進行解剖處理，獲得頭、胸、足、翅、腹等成蟲組織樣品和體壁、脂肪體、血淋巴、中腸、馬氏管等幼蟲樣品，並迅速用液氮處理，置於-70℃以備用於rna的提取。根據本實驗構建的cdna文庫，獲得了松墨天牛stt3b基因5′端序列，本發明在此基礎上進行3′race擴增，將所得的pcr產物與pmd20-t載體連接，轉化感受態大腸桿菌dh5α，篩選重組子，並進行測序。測序結果經分析可拼接成完整的cdna。

松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因全長全長2552bp，其中包含開放閱讀框(orf)2322bp和230bp的3′端非編碼區，起始密碼子為atg，終止密碼子為taa，如seqidno：1所示。

(二)本發明提供了一種松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因編碼的胺基酸序列，如seqidno：2所示。

松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b由773個胺基酸殘基組成，與赤擬谷盜(xp_972341.1)，家蠅(xp_005178365.1)，鋸蠅(xp_012256425.1)，內華達古白蟻(kdr10570.1)，法老蟻，(xp_012526859.1)，佛羅裡達弓背蟻(xp_011257568.1)，大頭阿塔切葉蟻(xp_012055162.1)，紅火蟻(xp_011173301.1)，傳粉榕小峰(xp_011500973.1)，菜蛾盤絨繭蜂(xp_008555284.1)，歐洲熊蜂(xp_003395697.1)，雲南小蜜蜂(xp_012345806.1)，黃色大蜜蜂(xp_006616543.1)，苜蓿切葉蜂(xp_003705191.1)，麗蠅蛹集金小蜂(xp_008216174.1)和豌豆長管蚜(xp_003245338.1)的胺基酸多重序列比較表明相似性都大於75％。系統進化樹分析表明，此stt3b亞基與赤擬谷盜親緣關係最近，與歐洲熊蜂等遺傳距離較遠。

(三)本發明提供了一種松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因的螢光定量表達模式。

採用rt-qpcr分析了松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b在不同蟲態、成蟲各部位和幼蟲組織的表達模式。松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b在蛹的表達量最高，蛹和幼蟲的相對表達量分別是成蟲的1.1倍和0.17倍(圖1)。成蟲各部位的表達模式為：足的表達量最高，為對照的11.55倍，翅膀的表達量最低，為對照的0.12倍，頭、胸、腹、觸角分別為對照的2.60、2.79、2.13、0.53倍(圖2)。幼蟲各組織的表達模式為：體壁的表達量最高，為對照的30.27倍，中腸的表達量最低，為對照的0.10倍，脂肪體、血淋巴、馬氏管分別為對照的3.58、1.14、0.30倍(圖3)。

本發明的有益效果在於提供了一種松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b基因的核苷酸序列及胺基酸序列，有助於研究stt3b在昆蟲中的功能和糖基化修飾，也有助於預防松材線蟲病的傳播。

附圖說明

圖1是寡糖基轉移酶亞基stt3b基因在松墨天牛各蟲態的表達圖。

圖2是寡糖基轉移酶亞基stt3b基因在松墨天牛成蟲各部位的表達圖。

圖3是寡糖基轉移酶亞基stt3b基因在松墨天牛各組織中的表達圖。

具體實施方式

實施例一：松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b的克隆

1、rna的提取

利用e.z.n.a.tmtotalrnakitii總rna提取試劑盒(omega)提取松墨天牛的總rna。

(1)松墨天牛成蟲和幼蟲採自廣州市從化馬尾松林。解剖後獲得頭、胸、足、翅、腹等成蟲組織樣品和體壁、脂肪體、血淋巴、中腸、馬氏管等幼蟲樣品，用液氮冷凍後保存在離心管中，置於-70℃冰箱內保存備用。

(2)研缽用液氮預冷後，加入液氮研磨樣品至粉末狀，後放入1.5ml離心管中。每15-25mg樣品加入0.5mlrnasolvreagent用均漿器均漿處理，樣品體積不超過rnasolvreagent的1/10。

(3)樣品加入rnasolvreagent均漿後靜置5-10min，使樣品中的核蛋白和核酸完全分離。樣品中如含有較多的蛋白質、多糖、脂肪或其它細胞外基質，可以室溫下12000r/min離心10min，移去漂浮的油脂，取上清。

(4)加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩30sec，室溫下放置3min；4℃下12000r/min離心10min。

(5)將吸附柱放入收集管中，用移液器將上清液全部加至吸附柱中，靜置2min；室溫下10000r/min離心1min，倒掉收集管中廢液。

(6)再次於室溫下10000r/min離心1min，倒掉收集管中廢液，儘量除去殘留的氯仿。

(7)將吸附柱放回收集管中，加入0.3mlrnawashbuffer1，室溫下10000r/min離心1min，倒掉收集管中廢液。

(8)將吸附柱放回收集管中，加入0.4mlrnawashbuffer1，室溫下10000r/min離心1min，倒掉收集管中廢液。

(9)清晰吸附柱用0.5mlrnawashbuffer2(提前用無水乙醇稀釋)，室溫下13000r/min離心2min，倒掉收集管中廢液。

(9)再次室溫下13000r/min離心2min，以便儘量除去殘留的試劑。

(10)洗脫rna。將吸附柱置於去酶的1.5ml的離心管中，加入0.04mldepc水，室溫下靜置2min，13000r/min離心1min。

2.cdna3′末端擴增

採用3』-fullracecoresetwithprimescripttmrtase試劑盒，具體操作步驟如下：

(1)反轉錄反應

反應體系如下：

反應條件：42℃反應60min，70℃反應15min。

(1)套式pcr擴增

①outerpcr擴增

反應體系如下：

反應條件：94℃預變性3min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，20個循環，然後72℃延伸10min。

②innerpcr擴增

反應體系如下：

反應條件：94℃預變性3min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30個循環，然後72℃延伸10min；pcr產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

cdna3′末端擴增所用引物為：

outer：5′-gagttggtgggattatggg-3′；

inner：5′-aggacattagggaaagcg-3′。

3.cdna單鏈的純化

採用通用型dna純化回收試劑盒純化cdna鏈，方法如下：

(1)柱平衡步驟：向吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液bl，室溫下，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

(2)將單一目的dna條帶從瓊脂糖凝膠切下(儘量切除多餘部分)放入乾淨的離心管中，稱取重量。

(3)向膠塊中加入等倍體積溶液pc(如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100μl，則加入100μlpc溶液)，50℃水浴放置10min左右，期間不斷溫和地上下翻轉離心管，直至溶液呈淺黃色且無膠塊。

(4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

(5)向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw(使用前請檢查是否已加入無水乙醇)，回收的dna是用於鹽敏感的實驗，如平末端連接，所以加入漂洗液pw後靜置2～5min再離心。12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2放入收集管。

(6)向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液。

(7)將吸附柱cb2放入收集管，12000r/min離心2min，儘量除去漂洗液。將吸附柱置於室溫放置數分鐘，徹底晾乾。

(8)將吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩衝液eb，室溫放置2min，12000r/min離心2min，收集dna溶液。

(9)dna產物於-20℃保存。

4.t-載體連接

pcr管中依次加入：pmd20-tvector1μl，純化過的innerpcr(即目標dna片段)產物3μl，sterilizedwater1μl，加入5μl(等量)的solutioni至終體積10μl。4℃反應過夜。

5.轉化感受態細胞

(1)感受態細胞從-70℃冰箱取出放於冰浴上融化，並分裝為每支50μl。連接產物的加入量不能超過感受態細胞體積的十分之一，也即是在5μl以內。

(2)每支加入4μl連接產物，緩慢混均。

(3)冰水上放置45min。

(4)然後置於42℃水浴鍋上，熱激45sec。

(5)在37℃下，250r/min搖菌1h，目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復甦。

(6)將離心管中的菌液混勻，吸取30～50μl加到配置好的平板培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻塗開，待平板表面乾燥後，倒置平板，37℃，225r/min培養12-16h。

6.陽性重組子的鑑定及測序

(1)取1.5ml離心管加入加入600μl含氨苄的培養液，用消毒牙籤挑選白色菌落放入培養液中，37℃下，250r/min過夜培養。

(2)取培養後的菌液作為模板進行菌落pcr鑑定。

反應體系如下：

反應條件為：94℃預變性3min；94℃30sec；55℃30sec30個循環；72℃1min；72℃10min。反應結束後取5μl反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(3)將包含正確重組子的菌液送至生工生物進行測序。

7.測序結果拼接

對生工生物反饋的結果進行分析，將測序正確的序列除去重疊部分，與構建的cdna文庫松墨天牛stt3b基因5′端序列進行拼接，獲得松墨天牛stt3b全長序列。

實施例二：松墨天牛stt3b基因的生物信息學分析

松墨天牛stt3b基因編碼一種松墨天牛寡糖基轉移酶亞基stt3b，其開放閱讀框有2322bp的核苷酸，編碼773個胺基酸殘基。

從ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)genbank資料庫中檢索17種昆蟲stt3b的胺基酸序列，分別為：赤擬谷盜(xp_972341.1)，家蠅(xp_005178365.1)，鋸蠅(xp_012256425.1)，內華達古白蟻(kdr10570.1)，法老蟻，(xp_012526859.1)，佛羅裡達弓背蟻(xp_011257568.1)，大頭阿塔切葉蟻(xp_012055162.1)，紅火蟻(xp_011173301.1)，傳粉榕小峰(xp_011500973.1)，菜蛾盤絨繭蜂(xp_008555284.1)，歐洲熊蜂(xp_003395697.1)，雲南小蜜蜂(xp_012345806.1)，黃色大蜜蜂(xp_006616543.1)，苜蓿切葉蜂(xp_003705191.1)，麗蠅蛹集金小蜂(xp_008216174.1)和豌豆長管蚜(xp_003245338.1)。用dnaman軟體進行同源性比對；用clustalx和mega4.0軟體構建昆蟲stt3b系統發育樹(nj法)，分析表明此基因與赤擬谷盜親緣關係最近，與歐洲熊蜂等遺傳距離較遠。

實施例三：松墨天牛stt3b基因的分布和表達

1、按照primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser操作手冊進行反轉錄反應，將各樣品rna反轉錄為cdna模板。

(1)基因組dna的去除

反應體系如下：

反應條件：42℃反應2min；後置於4℃保存。

(2)反轉錄反應

反應體系如下：

反應條件：37℃15min，85℃5sec；置於-20℃保存。

2.採用sybrpremixextaqtm染料法，在羅氏lightcycler480螢光定量pcr儀上進行擴增和數據分析

反應體系如下：

反應條件：stage1：preamplification(預變性)95℃5min，1cycle；stage[0085]2：amplification(pcr反應)95℃10sec，60℃20sec，40cycles；stage3：cooling(冷卻)40℃30sec，1cycle。

3.螢光定量pcr所用引物為：

forward(正向)：5′-catacggaagcgatggaact-3′

reverse(反向)：5′-cccataatcccaccaactca-3′。