用於鑑別β-摺疊聚集的蛋白質配體的方法

2023-08-11 15:24:36

用於鑑別β-摺疊聚集的蛋白質配體的方法
【專利摘要】本發明提供了使用噻嗪紅R，鑑別β-摺疊聚集的蛋白質配體的測定。
【專利說明】用於鑑別β-摺疊聚集的蛋白質配體的方法
[0001]本發明涉及用於鑑別配體的方法，所述配體結合形成β摺疊的聚集的蛋白質。
[0002]在阿茲海默病患者的大腦中，Tau蛋白質聚集體與神經變性疾病的發展密切相關，可用作神經變性過程的早期成像標誌物。還有其他的神經變性疾病表現出tau聚集。與澱粉樣_β成像組合，可以區分tau病和阿茲海默病。這是用於診斷和患者分層的有價值的工具。Tau成像是針對tau病理學和神經變性的項目的有效生物標誌物。
[0003]因此，需要用於鑑別PET (正電子成像術)成像配體的方法，所述配體用於阿茲海默病患者或其他tau病中的tau聚集體的特異性成像。
[0004]本發明的方法基於這樣的發現，S卩，相比與形成β_摺疊聚集體的單體結合的噻嗪紅R(Thiazine Red R)，與β -摺疊聚集體結合的噻嗪紅R (CAS Nr.2150-33-6)表現出強烈增加的螢光。
[0005]術語「 β -摺疊聚集的蛋白質」在本文中使用時指形成具有β -摺疊結構的聚集體的蛋白質。Tau蛋白、α-突觸核蛋白和A β肽形成具有β_摺疊結構的聚集體。
[0006]術語「蛋白質」在本文使用時指胺基酸的聚合物，不涉及特定的長度。因此，肽、寡肽和蛋白質片段都包括在多肽的定義中。術語「蛋白質」與術語「多肽」可互換的使用。
[0007]術語「 tau蛋白」在本文中使用時指來自任何動物(例如哺乳動物，物種，包括人)的天然序列tau蛋白和tau變體(下文進一步定義)。可以從多種來源(包括人組織類型)分離Tau多肽，或通過重組和/或合成方法製備Tau多肽。
[0008]該測定可以使用天然或重組生產的tau蛋白。「重組蛋白」是通過在異源細胞中表達而分離、純化或鑑別的蛋白質，所述細胞被瞬時或穩定的轉導或轉染經改造驅動蛋白質在宿主細胞中表達的重組表達載體。可以在原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))、酵母(例如慄酒裂殖酵母(S.pombe))或真核細胞(例如HEK293、Sf9昆蟲細胞)中生產重組tau。優選的，Sf9昆蟲細胞用於重組tau的高表達。用於測定的tau蛋白可以是純化的。術語「純化的」在本文中使用時是指從其天然環境或從重組生產來源中移出的、分離或分開的多肽，所述多肽中至少60%，更優選至少80%沒有它們天然相關的其他組分，例如膜和微粒體。
[0009]「天然序列tau」指不論其製備方式，具有與天然存在的tau多肽相同的胺基酸序列的多肽。天然序列tau可以是從天然分離的，或通過重組和/或合成方法製備的。術語「天然序列tau」具體涵蓋了 tau的天然存在的截短的或分泌的形式，天然存在的變體形式(例如可變剪接的形式)和天然存在的等位變體。NCBI資料庫中人tau多肽的標識符是NP_005901 (Seq.1d.N0.1)。
[0010]術語「tau變體」指天然序列tau的胺基酸序列變體，在天然序列中含有一個或多個胺基酸取代和/或缺失和/或插入。胺基酸序列變體一般與天然序列tau的胺基酸序列具有至少約75%，優選至少約80%，更優選至少約85%，甚至更優選至少約90%，最優選至少約95%序列同一性。
[0011 ] 術語「Α β肽」在本文中使用時是指來自任何動物(例如哺乳動物，物種，包括人)的天然序列Αβ肽和Αβ肽變體(下文進一步定義)。可以從多種來源(包括人組織類型)分離Αβ肽，或通過重組和/或合成方法製備Aβ肽。[0012]該測定可以使用天然或重組生產的Αβ肽。「重組蛋白」是通過在異源細胞中表達而分離、純化或鑑別的蛋白質，所述細胞被瞬時或穩定的轉導或轉染經改造以驅動蛋白質在宿主細胞中表達的重組表達載體。可以在原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))、酵母(例如慄酒裂殖酵母(S.pombe))或真核細胞(例如HEK293、Sf9昆蟲細胞)中生產重組Αβ肽。用於測定的Αβ肽可以是純化的。術語「純化的」在本文中使用時是指從其天然環境或從重組生產來源中移出的、分離或分開的多肽，所述多肽中至少60%，更優選至少80%沒有它們天然相關的其他組分，例如膜和微粒體。
[0013]「天然序列Αβ肽」指不論其製備方式，具有與天然存在的A β肽相同的胺基酸序列的多肽。應注意，「Αβ肽」具有若干天然存在的形式，因而，人的形式指Αβ39、Αβ40、A β 41、A β 42和A β 43。最主要的形式A β 42具有胺基酸序列(從N末端開始):
[0014]DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (Seq.1d.N0.3)0 在 Αβ41、A β 40、A β 39中，分別缺失C末端胺基酸A、IA和VIA。在A β 43形式中，在上述序列(Seq.1d.N0.3)的C末端包括額外的蘇氨酸殘基。用於本測定的優選的Αβ肽是具有Seq.1d.N0.4中給出的胺基酸序列A β 40。
[0015]天然序列Αβ肽可以是從天然分離的，或通過重組和/或合成方法製備的。術語「天然序列Αβ肽」具體涵蓋了 Αβ肽的天然存在的截短的或分泌的形式，天然存在的變體形式和天然存在的等位變體。術語「Αβ肽變體」指天然序列A β肽的胺基酸序列變體，其在天然序列中含有一個或多個胺基酸取代和/或缺失和/或插入。胺基酸序列變體一般與天然序列Αβ肽的胺基酸序列具有至少約75%,優選至少約80%,更優選至少約85%,甚至更優選至少約90%,最優選至少約95%序列同一'丨生。
[0016]術語「 α -突觸核蛋白」在本文中使用時是指來自任何動物(例如哺乳動物，物種，包括人)的天然序列α-突觸核蛋白和α-突觸核蛋白變體(下文進一步定義)。可以從多種來源(包括人組織類型)分離α-突觸核蛋白多肽，或通過重組和/或合成方法製備α-突觸核蛋白多肽。
[0017]該測定可以使用天然或重組生產的α-突觸核蛋白蛋白質。「重組蛋白」是通過在異源細胞中表達而分離、純化或鑑別的蛋白質，所述細胞被瞬時或穩定的轉導或轉染經改造驅動蛋白質在宿主細胞中表達的重組表達載體。可以在原核細胞(例如大腸桿菌(Ε.coli))、酵母(例如慄酒裂殖酵母(S.pombe))或真核細胞(例如HEK293、Sf9昆蟲細胞)中生產重組α-突觸核蛋白。優選的，Sf9昆蟲細胞用於重組α-突觸核蛋白的高表達。用於測定的α-突觸核蛋白可以是純化的。術語「純化的」在本文中使用時是指從其天然環境或從重組生產來源中移出的、分離或分開的多肽，所述多肽中至少60%，更優選至少80%沒有它們天然相關的其他組分，例如膜和微粒體。
[0018]「天然序列α-突觸核蛋白」指不論其製備方式，具有與天然存在的α-突觸核蛋白多肽相同的胺基酸序列的多肽。天然序列α-突觸核蛋白可以是從天然分離的，或通過重組和/或合成方法製備的。術語「天然序列α-突觸核蛋白」具體涵蓋了 α-突觸核蛋白的天然存在的截短的或分泌的形式，天然存在的變體形式(例如可變剪接的形式)和天然存在的等位變體。人α-突觸核蛋白多肽的胺基酸序列在Seq.1d.N0.2中給出。
[0019]術語「 α -突觸核蛋白變體」指天然序列α -突觸核蛋白的胺基酸序列變體，在天然序列中含有一個或多個胺基酸取代和/或缺失和/或插入。胺基酸序列變體一般與天然序列α -突觸核蛋白的胺基酸序列具有至少約75%，優選至少約80%，更優選至少約85%，甚至更優選至少約90%,最優選至少約95%序列同一'丨生。
[0020]術語「化合物」在本文中用於與本發明的測定相關時描述的「測試化合物」或「示蹤候選化合物」的背景中。由此，這些化合物包括有機或無機化合物，其來自合成或天然來源。化合物包括無機或有機化合物，例如但不限於特徵是相對低分子量的多核苷酸、脂類或激素類似物。
附圖簡介
[0021]圖1顯示了用於聚集的和單體蛋白質的噻嗪紅R的飽和分析。每個聚集的蛋白質上有2個不同的針對噻嗪紅(Thiazin-red)的結合位點。確定了兩個結合位點的Kd (Kdl、Kd2) A:Tau Β:Αβ，C:A-突觸核蛋白。
[0022]實驗部分
[0023]在TrislOmM pH8，24h，37°C的條件下，從大腸桿菌純化的重組人微管相關蛋白Tau在5 μ M濃度下用花生四烯酸(100 μ Μ)聚集。用花生四烯酸(100 μ Μ)聚集合成的A β 40，在TrislOmM ρΗ8中，37°C進行3天，在150rpm振蕩下。
[0024]用花生四烯酸(100 μ M)聚集從大腸桿菌純化的人重組-A-突觸核蛋白，在TrislOmM ρΗ8 中，37°C進行 5 天，在 150rpm 振蕩下。
[0025]進行針對聚集的蛋白質的噻嗪紅飽和分析，確定噻嗪紅與聚集的蛋白質的親和力(Kd)。表I顯示了噻嗪紅與聚集的tau、A β和α-突觸核蛋白的親和力常數。結果顯示，每個聚集的蛋白質上有2個針對噻嗪紅的具有不同親和力的結合位點。
[0026]所添加的噻嗪紅的濃度對應於各個聚集的蛋白質結合位點的Kd，以誘導可以被添加替換劑化合物抑制的螢光信號。
[0027]為了確定替換劑化合物與聚集的蛋白質的噻嗪紅結合位點的親和力，測定中添加不同濃度的化合物，範圍從0.3nM至ΙΟΟΟΟηΜ。
[0028]與之平行的，在不含噻嗪紅的條件下，同時測量化合物與聚集的蛋白質的自發螢光。使用配體和聚集的蛋白質作為陰性對照，使用噻嗪紅、具有已知活性的參照化合物和聚集的蛋白質作為陽性對照。
[0029]在Perkin Elmer 0ptiPlate384中實施測定,黑暗中，45ul測定體積,測定緩衝液是不含CaCl2和MgCl2的DPBS (GIBC0 N.14020)。在DMSO中稀釋測試化合物，加入2 μ I至測定中(5%DMS0終濃度)。通過添加聚集的蛋白質(競爭條件)開始測定。短暫的搖動平板(用 Sterico variomag teleshake 搖動 lmin),在室溫孵育 30min。在 Excitation531nm/Emission595nm 下,用 En:Vision (Perkin Elmer)進行測量
[0030]表I顯示了不同化合物與聚集的tau、A0和α -突觸核蛋白針對高親和力結合位點的親和力常數。
[0031]雖然出於清楚理解的目的，通過示例和實施例詳細的描述了上述發明，但說明書和實施例不應被視為限制了本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的公開內容都通過引用全文明確整合到本文中。
【權利要求】
1.用於鑑別β-摺疊聚集的蛋白質配體的方法，包括: a)使β-摺疊聚集的蛋白質與噻嗪紅R和化合物接觸， b)測量步驟a)的混合物中的噻嗪紅R螢光，其中步驟a)的混合物中的噻嗪紅R螢光相比空白減少，指示了 β_摺疊聚集的蛋白質配體。
2.權利要求1的方法，其中摺疊聚集的蛋白質選自tau蛋白、Aβ肽和α-突觸核蛋白。
3.權利要求1或2的方法，其中β_摺疊聚集的蛋白質是tau蛋白或Αβ40肽，優選人tau蛋白或人A β 40肽。
4.權利要求1至3的方法，其中噻嗪紅R突光是在Excitation531nm/Emission595nm測量的。
5.權利要求1至4的方法，其中β-摺疊聚集的蛋白質是重組生產的β -摺疊聚集的蛋白質。
6.權利要求1至5的方法，其中空白包括β-摺疊聚集的蛋白質和噻嗪紅R。
7.權利要求1至6的方法，其中化合物是以增加的濃度添加到步驟a)的混合物中的，從而確定測試化合物的IC50。
8.噻嗪紅R用於鑑別摺疊聚集的蛋白質配體的用途。
【文檔編號】G01N33/68GK103649757SQ201280030461
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年6月19日 優先權日:2011年6月22日
【發明者】E·博羅尼, C·採奇, A·多恩, L·戈比, V·格斯奇-邁爾, F·格呂寧格爾, D·羅特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司