豬肺炎支原體強毒株及其應用的製作方法
2023-08-11 17:05:31 1
豬肺炎支原體強毒株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供豬肺炎支原體強毒株及其應用，涉及微生物【技術領域】。本發明豬肺炎支原體強毒株，分類命名為豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae）AV747株，保藏號為CCTCCNO:V201317。本發明還提供所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用。本發明豬肺炎支原體強毒株，具有較高毒力，對豬的肺部具有很強的黏附力。本發明豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用，只需要採用該強毒株的純培養物就可以進行攻毒，攻毒後的豬肺臟病變典型。
【專利說明】豬肺炎支原體強毒株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物【技術領域】，具體涉及豬肺炎支原體強毒株及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae of swine, MPS)，又稱豬氣喘病或豬 地方性肺炎（Enzootic pneumonia of swine, EPS)，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)引起的一種豬慢性呼吸道傳染病。該病主要以氣喘為臨床特徵，在世 界範圍內廣泛流行，我國地方豬種和雜交豬種尤為易感，幾乎普遍存在，給養豬業造成了 重大損失。由於豬肺炎支原體對營養要求苛刻，使得其體外分離培養的難度很大，從而阻礙 了後續病原學、血清學、免疫學、致病機制等研究的順利推進。
[0003] Mhp的分離工作程序複雜，進展緩慢。豬肺炎支原體營養要求高且生長緩慢，分離 方法有待改進，因此很難獲得大量的菌株。Goodwin採用正常肺血漿塊組織培養法和煮沸組 織培養後再接種於無細胞培養基的方法分離到Mhp ;Pijoan將病豬肺組織的病變部分浸於 培養液中過夜後製成懸浮液分離到Mhp ;至今國內外分離Mhp大多採用病肺塊浸泡法。目 前國內外報導的Mhp強毒菌株較少，豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中毒株純培養物攻毒後豬 發病困難，病變程度不高。因此，在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中，仍以組織毒為攻毒材料， 但組織毒成分複雜，不僅含有動物組織，還摻雜其他病原或不明物，會影響疫苗效力檢驗的 準確性和合理性。
[0004]
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一株豬肺炎支原體強毒株，具有較高毒力，對豬的肺部具有 很強的黏附力。
[0006] 本發明的另一目的是提供所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢 驗中的應用，只需要採用該強毒株的純培養物就可以進行攻毒，攻毒後的豬肺臟病變典型。
[0007] 本發明的目的採用如下技術方案實現。
[0008] 豬肺炎支原體強毒株，分類命名為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae) AV747 株，保藏號為 CCTCCN0: V201317。
[0009] 在本發明中，所述毒株的P97基因如SEQ ID NO :1所示。
[0010] 本發明還提供所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用。
[0011] 在所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用中，採用所述 豬肺炎支原體強毒株培養物進行攻毒。
[0012] 在本發明中，所述豬肺炎支原體強毒株培養物的濃度為108-109CCU/mL。
[0013] 在本發明中，所述豬肺炎支原體強毒株培養物製備過程中採用的培養基如下： PPL0肉湯4-6g/L，腦心浸液l-3g/L，乳蛋白水解物l-3g/L，示蛋白腖2-4g/L，lOXHank's液 4-6ml/L，酵母抽出液9-llml/L，健康豬血清180-220ml/L，青黴素100-200萬IU/L，質量百 分濃度為(λ 4%的酚紅水溶液l-3ml，pH值至7-7. 5。
[0014] 在本發明中，豬肺炎支原體強毒株培養物的培養條件為：在36-38°C培養3-5日。
[0015] 本發明豬肺炎支原體AV747株分離自豬支原體肺炎特徵典型的病料。由於Mhp引 起豬支原體肺炎的先決條件是感染時能識別呼吸道黏膜纖毛細胞的特異性受體與其結合， 因此本發明嘗試用肺泡灌洗液的分離方法分離豬肺炎支原體，利用衝刷原理將Mhp從支氣 管纖毛上衝洗下來，灌洗液過濾後直接接種於培養基中。相對於傳統的分離方法，該方法操 作簡便，且避免雜菌汙染。通過在NA培養基上培養獲得了一株豬肺炎支原體毒株，對該毒 株進行了一系列鑑定，經生長特性，血清學和分子生物學鑑定結果表明：該毒株為豬肺炎支 原體，並將其定名為豬肺炎支原體AV747株。
[0016] P97蛋白是豬肺炎支原體的主要黏附因子之一。研究人員用單克隆抗體（MAb) F2G5做免疫印跡和親和吸附試驗，發現P97蛋白在豬肺炎支原體對宿主細胞的黏附中起重 要作用，該單抗的F (ab'）2片段能夠阻止Mhp對豬氣管纖毛的黏附。對P97基因進行結構 解析，發現P97蛋白的主要黏附區域在C端，包括R1區和R2區兩個重複序列。R1區由連續 的5個胺基酸（AAKPV/E)重複單元構成，R2區由連續的10個胺基酸（GTPNQGKKAE)重複單 元構成。研究發現Mhp不同菌株間的P97蛋白的重複單元重複次數差異較大，這可用於不 同菌株的區分。同時，已有試驗證明，重複單元越多黏附能力越強。本發明毒株AV747株的 P97蛋白的R1重複序列為17個，顯著高於現有豬肺炎支原體菌株，提示該毒株對豬肺部有 較好的黏附性，有較高毒力。
[0017] 通過攻毒試驗，發現用豬肺炎支原體AV747株組織毒進行攻毒，豬的臨床症狀有 典型的咳嗽，剖檢後豬肺臟病變典型；而豬肺炎支原體AV747株培養物進行攻毒，剖檢後豬 肺臟病變依然明顯，說明豬肺炎支原體AV747株純培養物就可以作為豬肺炎支原體疫苗效 力檢驗中攻毒材料，不需要採用含有動物組織、摻雜其他病原或不明物的組織毒進行攻毒， 將有利於疫苗效力檢驗的準確性和合理性。
【專利附圖】
【附圖說明】 圖1 P97基因的同源性分析。 圖2不同豬肺炎支原體毒株攻毒後，豬支原體肺炎肺部病變指數。
[0018] 具體實施方案
[0019] PPL0肉湯、腦心浸液、乳蛋白水解物、示蛋白腖均購自美國BD公司。
[0020] 10 XHank's 液的成分及含量為：含有 CaCl2 (w/v) 0· 14%、KC1 (w/v) 0· 4%、KH2P04 (w/ v) 0· 06%、MgCl2 · 6H20 (w/v) 0· 1%、MgS04 · 7H20 (w/v) 0· 1%、NaCl (w/v) 8%、Na2HP04 · 7H20 (w/ v)0. 09%、葡萄糖（w/v) 1%，溶劑為水。
[0021] Hank' s液是將10 X Hank's液稀釋10倍後得到。
[0022] NA液體培養基：取PPLO肉湯5g、腦心浸液2g、乳蛋白水解物2g、示蛋白腖3g、 10XHank's液5ml、新鮮酵母抽出液10ml、健康豬血清200ml、青黴素水溶液（20萬IU/ml) 5 ml和質量百分濃度為0. 4%的酚紅水溶液2ml混合，用IN NaOH溶液調節pH值至7. 3,用水 定容至1000ml。其中，酵母抽出液製備方法：150g酵母膏溶解於1000ml去離子水中，121°C 高壓蒸汽滅菌10 min，靜置過夜，9000rpm離心50 min，吸取上清121°C高壓10 min，得到酵 母抽出液，分裝保存2-8°C。酵母抽出液和健康豬血清要求新鮮。NA培養基以Φ 0. Ιμπι 的濾膜過濾除菌，4°C冷藏備用。
[0023] NA固體培養基：在NA液體培養基中添加終濃度為1% (質量百分濃度）的瓊脂。
[0024] 豬肺炎支原體232株(為標準強毒株）購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。
[0025] 豬肺炎支原體抗血清的製備：用NA液體培養基培養豬肺炎支原體168株（Mhp 168株，強毒，江蘇省農科院家畜重大疫病防控研究室）獲得培養物，肌肉注射接種健康兔， 每頭2ml，以後每兩個星期加強免疫至效價(採用IDEXX檢測試劑盒檢測效價)達陽性，採血 分離獲得的血清即為豬肺炎支原體抗血清。
[0026] 實施例1 :豬肺炎支原體AV747株的獲得及培養鑑定 1.菌株分離及克隆純化 從安徽某豬場有疑似氣喘病特徵的豬中進行篩選，選取豬支原體肺炎特徵典型的病 豬，無菌採集其肺臟。在該肺臟的病變組織和健康組織交界處，剪取適當的組織暴露支氣 管，用無菌注射器抽取5mL NA液體培養基直接打入支氣管，並從支氣管中倒吸NA液體培 養基，獲得支氣管灌洗液。灌洗液可直接用孔徑為〇. 45 μ m的濾器進行過濾後，收集濾液 接種於NA液體培養基，37°C培養。5天後培養物顏色由橘紅色變成黃色，培養物pH下降至 6. 7-6. 9,盲傳5代，生長穩定。傳代至第8代時，接種至NA固體培養基上進行克隆純化3 次，克隆第3次收穫的培養物即為第1代菌種，命名為AV747株。
[0027] 2. AV747 株的特性 (1)形態和生化特性 AV747株為環狀、球狀、絲狀、和點狀多形態微生物，無細胞壁，革蘭氏染色陰性。
[0028] 生化特性：（1)需要膽固醇試驗：AV747株僅在有血清的培養物中生長，在無血清 培養基中不生長，表明AV747株生長需要膽固醇。（2)發酵葡萄糖和水解精氨酸試驗:AV747 株在含0. 5%葡萄糖的培養基中培養，顏色由紅色變成黃色，表明其發酵葡萄糖培養基產 酸；在含0. 2%精氨酸的培養基中培養，培養基未變色，表明其不能水解精氨酸產鹼。生化特 性說明AV747株符合細菌分類學中支原體的特徵。
[0029] (2)培養特性 AV747株在NA液體培養基上生長良好，37°C培養3-5天，培養物pH下降至6. 6-6. 8,呈 現輕度渾濁。培養物中活菌濃度可以達到1〇8?109(XU/mL((XU為顏色變化單位)。AV747 株接種至NA固體培養基，37°C培養7?10日後，可見粗糙不規則菌落(初次分離的菌株在 固體培養基上尚未完全適應，未呈現油煎蛋菌落)。
[0030] 2.鑑定 (1)血清學鑑定 代謝抑制試驗鑑定：AV747株在加有豬肺炎支原體抗血清的NA液體培養基中，經37°C 恆溫培養15日，pH值不下降，培養基顏色未改變，呈現特異的葡萄糖代謝抑制。
[0031] 生長抑制試驗鑑定：將AV747株接種至加有豬肺炎支原體抗血清的NA固體培養 基，經37°C恆溫培養10-15日，固體培養基表面無菌落出現，呈現特異的豬肺炎支原體生長 抑制。
[0032] 代謝抑制試驗和生長抑制試驗結果說明AV747株為豬肺炎支原體。
[0033] (2)分子生物學鑑定（P97基因序列的測定） 根據GenBank登載的豬肺炎支原體232株P97基因設計一對引物，上遊引物序列 (SEQ ID N0:2)為：5 '-AAAAATTAGATATCTAAATTAT-3'，下遊引物序列（SEQ ID N0:3)為： 5 '-CCTCCGGGTTTTATTTAGATTC-3'。採用上述引物對，以AV747株的總DNA為模板，PCR擴 增該菌株的P97基因並進行測序，結果如SEQ ID NO: 1所示。
[0034] AV747 株與豬肺炎支原體 168 株（Mhp 168，GenBank 登錄號：CP002274. 1)P97 基 因的同源性為92. 2%，與國際菌株Mhp 232株、J株、7448株的同源性為91. 3-97. 9%，（圖1)， 說明AV747株是豬肺炎支原體。
[0035] 分析AV747株和已經公開的豬肺炎支原體毒株的P97蛋白（表1)，發現AV747株 P97蛋白胺基酸序列（SEQ ID N0:4)中R1(AAKPV/E)重複序列個數為17,顯著多於現有豬 肺炎支原體豬肺炎支原體P97基因，由於多項研究表明重複單元越多，黏附能力越強，所以 提示AV747株對豬肺部有較好的黏附性，毒力強。
[0036] 表1、各毒株P97蛋白的R1 (AAKPV/E)重複序列比較
【權利要求】
1. 豬肺炎支原體強毒株，分類命名為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae) AV747 株，保藏號為 CCTCCNO: V201317。
2. 根據權利要求1所述豬肺炎支原體強毒株，其特徵在於所述毒株的P97基因如SEQ ID NO :1 所示。
3. 權利要求1或2所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用。
4. 根據權利要求3所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用， 其特徵在於：採用權利要求1或2所述豬肺炎支原體強毒株培養物進行攻毒。
5. 根據權利要求4所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用， 其特徵在於：所述豬肺炎支原體強毒株培養物的濃度為10 8-109CCU/mL。
6. 根據權利要求5所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用， 其特徵在於：所述豬肺炎支原體強毒株培養物製備過程中採用的培養基如下：PPL0肉湯 4-6g/L，腦心浸液l-3g/L，乳蛋白水解物l-3g/L，示蛋白腖2-4g/L，lOXHank's液4-6ml/L, 酵母抽出液9-1 lml/L，健康豬血清180-220ml/L，青黴素 100-200萬IU/L，質量百分濃度為 〇· 4%的酚紅水溶液l-3ml，pH值至7-7. 5。
7. 根據權利要求6所述豬肺炎支原體強毒株在豬肺炎支原體疫苗效力檢驗中的應用， 其特徵在於豬肺炎支原體強毒株培養物的培養條件為：在36-38°C培養3-5日。
【文檔編號】A61K49/00GK104099269SQ201410287236
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月25日 優先權日:2014年6月25日
【發明者】韋豔娜, 熊祺琰, 馮志新, 劉茂軍, 邵國青 申請人:江蘇省農業科學院