通過超量表達yerP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法
2023-07-22 08:18:01 2
專利名稱：通過超量表達yerP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法
技術領域：
本發明涉及通過超量表達J^rP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法，屬於生物技術領域。背景技術：
枯草芽孢桿菌OfeCiBm ·5油^Vi1S)是目前公認的安全微生物之一，其抗菌代謝產物豐富多樣，尤其是脂肽類抗菌物質，不僅抗菌譜廣而且還具有生物表面活性劑的功能，因此不僅可以在農業上用於進行生物防治，而且在工業和環境保護上也有著廣泛的應用。枯草芽孢桿菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一種可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物質的枯草芽孢桿菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作為一種生物表面活性劑，與化學表面活性劑相比，其具有擁有生物降解能力，低毒，結構豐富的優點，隨著對工業原料的環境適應性要求的提高， 其應用於環境保護，石油開採方面潛力將會越來越大。但實際中，其並未在工業以及環境保護中廣泛應用，究其原因，是因為它生產成本巨大，所以提高其產量便成為降低其生產成本的核心問題。目前，世界範圍內，提高其產量的方法主要是篩選優良菌株，以及優化發酵條件， 而很少採用分子生物學技術對菌種進行改良的方法來提高其產抗菌物質的產量。但隨著對抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已經逐漸開始採用分子生物學技術，通過改造其合成分泌中信號通路等方法來對原始菌種進行基因改良，從而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。J^r/7基因(Gene ID: 154684518)，其表達產物YerP蛋白是枯草桿菌中surfactin 抗菌肽的免疫蛋白，可以免疫surfactin對細胞自身的傷害，相關研究表明，YerP蛋白可以免除枯草桿菌分泌的surfactin對自身的傷害。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC 9943為出發菌株，以枯草桿菌表達載體 PHCMC04為骨架構建一個J^rP基因超量表達載體pHCMC-YerP，通過電轉化將其轉入到枯草桿菌ATCC9943中使J^rP基因超量表達，構建了一個高產抗菌肽菌株FMB 45。三、發明內容技術問題
本發明的目的是利用分子生物學技術，構建J^rP基因超量表達載體，通過電轉化將其轉入到枯草桿菌ATCC 9943中，從而構建一種高產抗菌肽的枯草芽孢桿菌菌株FMB 45。技術方案
1、通過超量表達J^rP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法，其特徵在於 (DyerP基因超量表達載體pHCMC_YerP的構建
根據枯草芽孢桿菌P43啟動子基因設計引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢桿菌 {Bacillus subtilis)klCC 9943基因組DNA為模板PCR擴增P43啟動子基因，獲得300 bp基因片段；設計引物YerP-F和YerP-R，以枯草芽孢桿菌(feci/A/s subtil is) ATCC 9943 基因組DNA為模板PCR擴增YerP基因，獲得3195 bp基因片段；擴增得到的兩個基因分別克隆至PMD19-T載體，轉化大腸桿菌(fecAericAia cWi) DH5a，經驗證、測序正確後，分別命名為p/￥J_T、pFerP- ,於_20°C條件下保存備用；
權利要求
1.通過超量表達J^rP基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法，其特徵在於 (DyerP基因超量表達載體pHCMC_YerP的構建設計引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢桿菌(feci/A/s subtil is) ATCC 9943基因組 DNA為模板PCR擴增P43啟動子基因，獲得300 bp基因片段；設計引物YerP-F和YerP-R， 以枯草芽孢桿菌(Mcillus subtiHs)kTCC 9943基因組DNA為模板PCR擴增YerP基因表達框，獲得3195 bp基因片段；擴增得到的兩個基因分別克隆至PMD19-T載體，轉化大腸杆 ^Escherichia co7i)DH5a,經驗證、測序正確後，分別命名為 p/￥J_T、pVerP- ,於-20°C 條件下保存備用；
2.權利要求1所述方法獲得的超量表達J^rP基因菌株FMB45。
3.權利要求2所述超量表達J^rP基因菌株FMB45在生產枯草芽孢桿菌抗菌肽中的應用。
4.權利要求2所述超量表達J^rP基因菌株FMB45生產的枯草芽孢桿菌抗菌肽產品。
全文摘要
本發明涉及通過超量達yerP基因提高枯草桿菌抗菌肽產量的方法，屬於生物技術領域。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC9943為出發菌株，以大腸桿菌克隆載體pHCMC04為骨架構建一個基因超量表達載體pHCMC-YerP，通過電轉化將其轉入到枯草桿菌ATCC9943中使yerP基因超量表達，構建了一個高產抗菌肽菌株FMB45。經過高效液相色譜分析，確定改良菌株產surfactin和fengycin的能力大大提高。
文檔編號C12P21/02GK102220367SQ20111010539
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者別小妹, 呂鳳霞, 張充, 曹國強, 鍾蕾, 陸兆新 申請人:南京農業大學