一種雙組分基因載體及其應用的製作方法

2023-07-22 07:45:36

專利名稱：一種雙組分基因載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因載體領域，涉及一種具有磁響應性、抗蛋白吸附性、低毒性、可轉染的雙組分基因載體。
背景技術：
現有技術中，經常需要利用分子生物學方法將目的基因導入靶細胞，使之表達目的基因產物。這個過程的關鍵是選擇合適的基因載體及基因導入方法，使目的基因能夠在靶細胞中獲得安全、可控、高效、穩定的表達。因此，首先需要一種具有穩定性、安全性和靶向性的基因載體，目前用於基因定向輸送的基因載體有病毒類，有機陽離子複合物，重組蛋白，無機納米顆粒。重組蛋白理論上具有良好的生物相容性，但是製備成本較高，而且尚未成熟；無機納米顆粒製備方便，尺寸可控，毒性較低，可預先功能化，但是普遍裝載效率低，轉染和輸送效率低，降解嚴重，有效作用期短，無法控制其釋放速度，容易被巨噬細胞吞噬。有機陽離子複合物可大規模商業化生產，製備方便，不存在引入病毒基因的危險性，但是陽離子載體與DNA之間靜電作用限制了基因進入細胞核之後從複合物中釋放，且過多的正電荷會增加載體的毒性，同時還有免疫反應。針對陽離子聚合物的缺陷，研究人員在陽離子載體外層設計一段親水性嵌段聚合物，用於屏蔽正電荷，具有高密度側鏈基團的刷型聚合物能改變聚陽離子主鏈周圍的微環境，特別是基於聚乙二醇(PEG)的刷型聚合物，可以降低主鏈周圍的介電常數，增強聚陽離子主鏈與基因之間離子和氫鍵的相互作用，並能屏蔽電荷，降低複合物的自聚集，減少與組織細胞的作用，降低載體毒性，改善載體在體內的分布，延長載體在體內的循環時間，且具有抗非特異吸附性能。本發明人的研究小組通過氧陰離子引發的聚合反應，分別合成了膽固醇封端的聚甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯陽離子型聚合物、聚乙二醇(PEG)與聚丙烯酸(PAA) 二嵌段共聚物，通過PAA的大分子反應，使部分羧基轉變為含巰基(-SH)的基團，作為可交聯的陰離子型聚合物PEG-力-PMAAsh。通過陽離子型聚合物、DNA和陰離子型聚合物的靜電相互作用，層層組裝，構建了一種複合型基因載體模型(參見顧子旭，倪沛紅，袁媛，何金林，「一種新型非病毒陽離子型基因載體及其製備方法」，專利號為200810018650.3 的中國發明專利；Zixu Gu, Yuan Yuan, Jinlin He, Mingzu Zhang, Peihong Ni*, Langmuir, 2009， 25, 5199-5208)。上述專利的缺陷是設計的基因載體沒有靶向性及抗蛋白特異性吸附性，且轉染效果不夠好。另外，現有技術中，基於聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)刷型嵌段共聚物的研究主要有
(1) Schubert等通過ATRP及開環聚合法(ROP)法合成了核殼結構的生物可降解性的 star-PCL-pPEGMA，可作為水溶性單分子載體(參見Schramm, 0. G.; Pavlov, G. Μ.；van Erp, H. P. ； Meier, M. A. R. ； Hoogenboom, R. ； Schubert, U. S. Macromolecules 2009， 42， 1808-1816)。(2) Neoh等通過開環聚合法(ROP)及ATRP法合成了包封磁並具有葉酸靶向基團 的嵌段聚合物FA-PLLA-み-PPEGMA，研究這種聚合物在靶向藥物載體中的潛在應用(參見 Hu, F. X. ； Neoh, K. G. ； Kang, N. T. Macromol. Rapid Commun. 2009，30，609—614)。(3) Rannard等通過ATRP法合成了 pPEGMA4(1-み-/ -BuMA6tl聚合物刷，研究其在水溶 液中的自組裝。(參見He, T. ； Adams, D. J. ； Butler, M. F. ； Yeoh, C. T. ； Cooper, A. I. ； Rannard, S. P. Angew. Chem. Int. Ed. 2007，46，9243 - 9247)。(4) Advincula等利用可逆加成-斷裂鏈轉移(RAFT)聚合法在金(Au)表面修 飾PPEGMA分子刷，發現具有抗非特異吸附性(參見Tri￡i，M. C. R.; Grande, C. D. T.； Ponnapati, R. R. ； Advincula, R. C. Biomacromolecules 2010, 11, 3422 - 3431)。上述四篇文獻的技術方案不涉及到聚陽離子聚合物或鏈段用於裝載DNA。據我們 調研所知，至今還沒有文獻或專利報導含巰基(-SH)的基於聚乙ニ醇甲基丙烯酸酯的刷型 陰離子嵌段共聚物的合成、ニ硫鍵的交聯，並將其應用到構建具有磁響應性和抗蛋白吸附 的複合基因載體。

發明內容
本發明的發明目的是提供ー種具有磁響應性、抗蛋白吸附性、低毒性、可轉染的雙 組分基因載體。為達到上述發明目的，本發明採用的技術方案是一種雙組分基因載體，所述雙組 分基因載體由聚陽離子磁性納米粒子和含巰基的刷型陰離子嵌段共聚物組成，其中，所述 聚陽離子磁性納米粒子的製備方法包括以下步驟(1) 製備陽離子聚合物
權利要求
1. 一種雙組分基因載體，其特徵在於，所述雙組分基因載體由聚陽離子磁性納米粒子和含巰基的刷型陰離子嵌段共聚物組成，其中，所述聚陽離子磁性納米粒子的製備方法包括以下步驟
2.根據權利要求1所述雙組分基因載體，其特徵在於，步驟(1)所述製備陽離子聚合物的方法具體為(a)以氫化鉀與膽固醇反應物，使氫化鉀與膽固醇末端的羥基充分反應，生成氧陰離子；(b)以步驟(a)所得氧陰離子為引發劑，引發單體進行氧陰離子聚合反應，製備得到陽離子聚合物；其中，步驟(a)中，所述氧陰離子的化學結構式如下所示所述單體為聚甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯類單體，其通式如下所示
3.根據權利要求2所述雙組分基因載體，其特徵在於，步驟(1)所述製備陽離子聚合物的方法具體為(a)無水無氧惰性氣體保護條件下，將氫化鉀與膽固醇溶解在四氫呋喃溶劑中，於40~45 ℃的溫度中，引發反應約4~6小時，使氫化鉀與膽固醇末端的羥基充分反應，生成氧陰離子；(b)在無水無氧惰性氣體氛圍下，0~5 °C的溫度中，以步驟(a)所得氧陰離子為引發劑，引發單體進行氧陰離子聚合反應，反應約2~3小時，最後用乾燥的甲醇終止反應，純化乾燥後得陽離子聚合物；其中，步驟(a)中，氫化鉀與膽固醇的摩爾比為 1.8 2. 2 1;步驟(2)中，單體和引發劑的摩爾比為25 35 1。
4.根據權利要求1所述雙組分基因載體，其特徵在於，所述含巰基的刷型陰離子嵌段共聚物的製備方法包括以下步驟(1)製備ATRP大分子引發劑將ATRP引發劑，在ATRP催化劑和催化劑配體的存在下， 與單體聚乙二醇甲基丙烯酸酯在乙醇和水的混合溶劑中進行ATRP反應，獲得聚(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)大分子引發劑，其化學結構式如下所示
5.根據權利要求4所述雙組分基因載體，其特徵在於，步驟(1)或步驟O)中，單體與ATRP引發劑的摩爾比為10 廣200 1;ATRP引發劑與催化劑的摩爾比為 0.5 Γ1 1 ；催化劑與催化劑配體的摩爾比為1 Γ1 5。
6.根據權利要求4所述雙組分基因載體，其特徵在於，步驟(1)中，所述ATRP引發劑選自α-溴代丙酸甲酯或2-溴代異丁酸乙酯的一種；步驟⑴或步驟⑵中，所述ATRP催化劑選自氯化亞銅或溴化亞銅中的一種；ATRP反應的催化劑配體選自聯吡啶、五甲基三亞乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亞乙基四胺中的一種。
7.權利要求1所述的雙組分基因載體裝載DNA的應用。
8.應用權利要求1所述的雙組分基因載體裝載DNA的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將聚陽離子磁性納米粒子、DNA及含巰基的刷型陰離子嵌段共聚物分別溶解在緩衝溶液中，攪拌使完全溶解，分別配成DNA溶液、聚陽離子電解質溶液和聚陰離子電解質溶液，所述DNA溶液、聚陽離子電解質溶液和聚陰離子電解質溶液的濃度分別為0.壙1 mg ml/1 ；(2)在聚陽離子磁性納米粒子溶液中加入DNA溶液，混合均勻後靜置，聚陽離子磁性納米粒子與DNA通過靜電作用充分縮合DNA，形成裝載DNA的聚陽離子磁性納米粒子；(3)再加入刷型陰離子聚合物溶液，混合均勻後靜置，刷型陰離子聚合物與裝載DNA 的聚陽離子磁性納米粒子通過靜電作用，使得刷型陰離子嵌段共聚物包覆在聚陽離子磁性納米粒子的外表面；(4)最後，攪拌溶液，刷型陰離子嵌段共聚物中的巰基在雙氧水或空氣中氧氣的作用下，交聯形成二硫鍵，獲得穩定的基因載體複合物。
9.根據權利要求8所述應用權利要求1所述的雙組分基因載體裝載DNA的方法，其特徵在於，步驟O)中，聚陽離子磁性納米粒子與DNA摩爾比為疒10 1，靜置約1(Γ30分鐘； 步驟(3)中，靜置約1(Γ30分鐘，刷型陰離子聚合物與聚陽離子磁性納米粒子的摩爾比為 0. 05 1. 5 1。
10.根據權利要求8所述應用權利要求1所述的雙組分基因載體裝載DNA的方法，其特徵在於，所述緩衝溶液選自PH 7. 4的緩衝溶液。
全文摘要
本發明公開了一種雙組分基因載體，本發明首先合成具有磁響應的陽離子聚合物修飾的Fe3O4磁性納米粒子，用於縮合DNA；同時設計一種親水性的含巰基的刷型陰離子嵌段共聚物，作為上述磁性陽離子載體的外層，該親水性含巰基的刷型陰離子嵌段共聚物，包覆在陽離子聚合物修飾的Fe3O4磁性納米粒子外表面，形成一層具有抗非特異吸附性的陰離子層，並且，在雙氧水或空氣中O2作用下，巰基交聯成二硫鍵，提高了粒子在血液循環過程中的穩定性，當載體到達細胞內部時，在細胞還原環境下二硫鍵斷裂，使DNA在活細胞中原位釋放。本發明所述雙組分基因載體可以和DNA通過靜電作用複合形成一種具有磁響應性、抗蛋白吸附性、低毒性、可轉染的基因載體。
文檔編號C12N15/87GK102277386SQ20111010534
公開日2011年12月14日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者倪沛紅, 張明祖, 朱秀林, 郝瑩 申請人:蘇州大學