家蠶穀胱甘肽-S-轉移酶BmGSTe7基因及用途的製作方法
2023-07-29 21:00:46 2
專利名稱：家蠶穀胱甘肽-S-轉移酶BmGSTe7基因及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種來自於家蠶的具有抗農藥或抗氧化活性的 家蠶穀胱甘肽一S—轉移酶BmGSTe7基因。
背景技術：
農藥在害蟲防治中起著非常重要的作用，但是隨著大量農藥的使用，昆蟲抗藥性日益 加劇，迫使人們開發新的農藥產品或加大藥劑的用量，這不但制約了經濟的發展，也給環 境帶來了嚴重的負擔，影響到了經濟和人類的可持續性發展。加之，昆蟲抗農藥與昆蟲的
抗氧化往往聯繫在一起，例如昆蟲在解毒代謝有機磷農藥過程中，可能會產生一些活性 氧等物質，從而誘導昆蟲的氧化應激反應，因此昆蟲在提高農藥抗性的同時，抗氧化的能 力也在隨之增加。
穀胱甘肽一S —轉移酶(Glutathione S-transferase, GSTs, EC 2.5丄18)是一類重要的同工 酶超家族，廣泛分布在動物、植物、酵母、細菌等生物體中，具有消除內源和外源性有毒 物質的功能。在昆蟲體內它不但行使對多種有機合成農藥的代謝外，而且也具有消除昆蟲 體內多餘的自由基，保持體內的氧化與抗氧化的動態平衡。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生 物，對家蠶GST基因進行克隆，以及對其功能進行研究，為闡明GSTs與殺蟲劑抗性的關 系，以及為農林害蟲的防治有著重要的理論和實踐意義。到目前為止，尚無有關家蠶的具 有抗農藥或抗氧化活性的基因的研究報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種來自於家蠶的具有抗農藥或抗氧化活性的家蠶穀胱甘肽 一S —轉移酶BmGSTe7基因，通過對該基因更進一步的研究，可為研製防治鱗翅目害蟲藥 物提供理論基礎。
本發明申請人利用鱗翅目害蟲小菜蛾有機磷抗性基因PxGST3 (accession number U66342) (Huang HS， Hu NT, Yao YE, et al. Molecular cloning and heterologus expression of a glutathione S隱transferase involved in insecticide resistance from the diamondback moth Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1998, 28:651-658)蛋白質序列，在家 蠶基因組中進行TBLASTN檢索，獲得了多個穀胱甘肽一S —轉移酶同源基因，對比對得 最好的家蠶5wOS7fe7基因進行了克隆、表達、純化以及酶活性的測定。具體方法如下
3(1) 首先以家蠶基因組中預測的編碼區序列(coding sequence, CDS),在家蠶表達 序列標籤(expressed sequence tag, EST)資料庫中為5wOSre7基因尋找EST證據，找到 了2條EST序列，以CDS和EST序列為此基因設計特異性引物；BmOS7fe7的正向引物 5' CATATGAGTCTAATGTTGTACAAACTA 3'，反向引物5' GGATCCTACATTTTATAGATTAAGATCCA 3';正向引物和反向引物中分別加有M/el和Sa/ffM酶切位點；
(2) 以設計的特異性引物在家蠶5齡3的脂肪體cDNA為模板進行擴增，獲得了 目的條帶，PCR產物回收後與pMD18-T載體連接，轉化DH5oc感受態細胞，獲得陽性 克隆後送往上海Sangon測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致；
(3) 將含有目的片斷的T克隆與pET28a空質粒分別用Wei和進行雙酶切， 分別回收目的片斷，以T4連接酶將其連接並轉化B121(DE3)感受態細胞，篩選獲得含有 pET28a—SwGSre7的克隆，提取質粒並送往上海Sangon測序，獲得正確的克隆；將含有 pET28a—S附G5Te7重組質粒的單克隆在含有卡那的LB培養基中37'C振蕩培養，至 OD6(kt0.6左右，加入IPTG使其終濃度為lmmol/L，繼續誘導培養5小時，取50ml菌液 10000g離心5分鐘收集菌體沉澱，以His標籤純化目的蛋白質，純化方法按照pET寶典進 行；目的蛋白對模式底物CDNB (1_氯_2， 4一二硝基苯)的活性為15 nmol/min/mg protein;
(4) 序列同源性分析相似性比較在NCBI站點上用BLAST完成，BLAST分析表明， S附GS7fe7與昆蟲特異的Epsilon家族成員相似性較高；在家蠶基因組中萬mOS7fe7也是與鱗 翅目害蟲小菜蛾PxGST3基因比對得最好，其蛋白質序列的一致性為53%，而且S/nOS7fe7 與模式底物CDNB有較高的活性，說明萬附OS7fe7為抗藥性相關的重要基因。
上述方法獲得的5mGS7fe7基因完整的CDS及其推斷的胺基酸序列如下
atgagtctaatgttgtacaaactaaacgcgagccctccggcgcgcactgccatgatggtg
MSLMLYKLNASPPARTAMMV tgtgaactcttcaaggttcctgttaaaatggttgacgtaaatttatccaaaggagaacat
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VNGVAELGALLKEKLGS-
SmO re7基因在製備防治鱗翅目害蟲藥物中的應用。 本發明的優點是.-
通過小菜蛾中有機磷抗性基因PxGST3在家蠶基因組中同源性檢索，獲得了比對最好 的&nGS7fe7基因，我們並對其進行了克隆表達。其表達產物對模式底物CDNB (l —氯 一2， 4 —二硝基苯)的活性為15^imol/min/mgprotein。通過這一基因靶點，有望設計出防 治鱗翅目害蟲藥物，而對其他目的有益昆蟲無毒無害。因此在藥物開發和害蟲防治中有著 重要的價值。
具體實施例方式
實施例
以家蠶基因組中預測的編碼區序列(Coding sequence, CDS),在家蠶表達序列標籤 (Expressed sequence tag, EST)資料庫中為SwGS7fe7基因尋找EST證據，找到了2條EST 序列，以CDS和EST序列拼接後設計基因特異性引物；SwG5Te7的正向引物5'CATATG AGTCTAATGTTGTACAAACTA 3'，反向引物5， GGATCCTACATTTTATAGATTAAGATCCA 3'; 以設計的特異性引物在家蠶5齡3的脂肪體cDNA為模板進行擴增，獲得目的條帶，PCR 產物回收後與pMD18-T載體連接，轉化DH5oc感受態細胞，獲得陽性克隆後送往上海 Sangon測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致；將含有目的片斷與pET28a，以 T4連接酶連接並轉化B121(DE3)感受態細胞，篩選獲得含有pET28a—SwGSre7的克隆，將 含有pET28 a—SwOS7fe7重組質粒的單克隆在含有卡那的LB培養基中37'C振蕩培養，至 OD,-0.6左右，加入IPTG使其終濃度為lmmol/L,繼續誘導培養5小時，取50ml菌液10000g 離心5分鐘收集菌體沉澱，以His標籤純化目的蛋白質，純化方法按照pET寶典進行；目的 蛋白對模式底物CDNB (l—氯一2， 4一二硝基苯)的活性為15 pmol/min/mgprotein;在 NCBI站點上用BLAST完成序列同源性分析，表明J5wGS7fe7基因是一個新基因。
5序列表
SEQUENCE LISTING 西南大學
家蠶穀胱甘肽一S—轉移酶BmGSTe7基因
1
1 654 DNA
家蠶(Bombyxmori) 1
1 atgagtctaa tgttgtacaa actaaacgcg agccctccgg cgcgcactgc catgatggtg 61 tgtgaactct tcaaggttcc tgttaaaatg gttgacgtaa atttatccaa aggagaacat 121 ttttccccgg aatatttaaa gagaaaccct cttcacactg tacctactct agaagatggc 181 gacctgatta ttactgatag ccacgcgatt gcaatgtatc tcgccgacaa atatggaaaa 241 gacgatagtc tgtaccctaa agacttaaaa agcagagcaa tagtgaacca aaggttattc 301 tttgatagca cggtgttgtt ctctagaatg agaagtgtta cttttccagt cataattgaa 361 ggatgtaaaa ctgtcacgga gaagcaaatt aatgacatta tcgaagcata tggttatgtt 421 gaaacttatc tatcgaacac caaattcata gccaccaata acttgacgat tgctgacatt 481 tctgcctacg ccgtagtttc atctctcctt tttattgtge ctttagatgg agccaaattc 541 cccaaaacac aaacgtggtt gaatgaaatg gaaaagaaac cttttgcaca gaaatataat 601 gtgaacggcg tggccgaatt gggcgcacta ttgaaagaga aacttggatc ttaa
2 217 PRT
家蠶(Bombyxmori)
1
1 MSLMLYKLNA SPPARTAMMV CELFKVPVKM VDVNLSKGEH FSPEYLKRNP LHTVPTLEDG
61 DLIITDSHAI AMYLADKYGK DDSLYPKDLK SRAIVNQRLF FDSTVLFSRM RSVTFPVIIE
121GCKTVTEKQI NDI正AYGYV ETYLSNTKFI ATNNLTIADI SAYAWSSLL FIVPLDGAKF
181 PKTQTWLNEM EKKPFAQKYN VNGVAELG AL LKEKLGS
權利要求
1、一種家蠶穀胱甘肽-S-轉移酶BmGSTe7基因，其特徵在於其序列如下1 atgagtctaa tgttgtacaa actaaacgcg agccctccgg cgcgcactgc catgatggtg61 tgtgaactct tcaaggttcc tgttaaaatg gttgacgtaa atttatccaa aggagaacat121 ttttccccgg aatatttaaa gagaaaccct cttcacactg tacctactct agaagatggc181 gacctgatta ttactgatag ccacgcgatt gcaatgtatc tcgccgacaa atatggaaaa241 gacgatagtc tgtaccctaa agacttaaaa agcagagcaa tagtgaacca aaggttattc301 tttgatagca cggtgttgtt ctctagaatg agaagtgtta cttttccagt cataattgaa361 ggatgtaaaa ctgtcacgga gaagcaaatt aatgacatta tcgaagcata tggttatgtt421 gaaacttatc tatcgaacac caaattcata gccaccaata acttgacgat tgctgacatt481 tctgcctacg ccgtagtttc atctctcctt tttattgtgc ctttagatgg agccaaattc541 cccaaaacac aaacgtggtt gaatgaaatg gaaaagaaac cttttgcaca gaaatataat601 gtgaacggcg tggccgaatt gggcgcacta ttgaaagaga aacttggatc ttaa。
2、 一種家蠶穀胱甘肽一S —轉移酶BmGSTe7基因編碼的蛋白質，其特徵在於其序列如下1 MSLMLYKLNA SPPARTAMMV CELFKVPVKM VDVNLSKGEH FSPEYLKRNP LHTVPTLEDG 61 DLIITDSHAI AMYLADKYGK DDSLYPKDLK SRAIVNQRLF FDSTVLFSRM RSVTFPVIIE 121 GCKTVTEKQI NDIIEAYGYV ETYLSNTKFI ATNNLTIADI SAYAVVSSLL FIVPLDGAKF 181 PKTQTWLNEM EKKPFAQKYN VNGVAELGAL LKEKLGSO
3、 5mOSTe7基因在製備防治鱗翅目害蟲藥物中的應用。
全文摘要
一種家蠶穀胱甘肽-S-轉移酶BmGSTe7基因，通過利用鱗翅目害蟲小菜蛾有機磷抗性基因PxGST3蛋白質序列，在家蠶基因組中進行TBLASTN檢索，獲得了多個穀胱甘肽-S-轉移酶同源基因，對比對得最好的家蠶BmGSTe7基因進行了克隆、表達、純化以及酶活性的測定。其表達產物對模式底物CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)的活性為15μmol/min/mg protein。通過這一基因靶點，有望設計出防治鱗翅目害蟲藥物，而對其他目的有益昆蟲無毒無害。因此在藥物開發和害蟲防治中有著重要的價值。
文檔編號C12N15/54GK101492687SQ20081023330
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者代方銀, 餘泉友, 左偉東, 柴春利, 潘敏慧, 成 魯 申請人:西南大學