負載阿黴素並具有葉酸受體靶向功能的白蛋白納米粒子製劑及其製備方法

2023-07-29 16:34:26 1

專利名稱：負載阿黴素並具有葉酸受體靶向功能的白蛋白納米粒子製劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種具有靶向功能的白蛋白納米粒子製劑及其製備方法和應用。
背景技術：
在癌症化療中面臨的一個主要問題是化療藥物缺乏對腫瘤細胞或組織的選擇性或靶向性，這樣藥物容易對正常的細胞和組織造成損害。阿黴素(doxorubicin，D0X)屬蒽環類抗腫瘤藥物，具有抗瘤譜廣、抗瘤活性強的特點，在臨床上廣泛用於治療多種惡性腫瘤。但是阿黴素的半衰期短，對正常細胞和組織，特別是心臟、神經、骨髓產生嚴重毒副作用，從而限制了其在臨床上的使用[Minotti, G. , et al. , Pharmacological Reviews,2004. 56: p. 185-229.]，因此，腫瘤靶向輸送阿黴素在治療中是必要的。葉酸由於分子量小，免疫原性低，易於修飾，穩定性好，與葉酸受體的結合能力強等優點[Leamon，C. P.，et al. , Advanced Drug Delivery Reviews, 2004. 56: p. 1127 - 1141.],因而被廣泛地修飾在負載抗腫瘤藥物納米粒子的表面，使其具有腫瘤主動靶向的功能。通過腫瘤表面過度表達的葉酸受體與葉酸的識別、結合和所調節的內吞作用，可以降低抗腫瘤藥物對正常組織的傷害，提高藥物的抗腫瘤效果[Lu, Y.，et al. , Journal of Controlled Release,2003. 91: p. 17 - 29. ; Lu, Y.，et al.，Advanced Drug Delivery Reviews, 2004. 56:p. 1161-1176.]。由白蛋白製備的納米粒子，因具有良好的生物相容性、生物降解性和理想的藥代動力學而被廣泛地研究作為抗癌藥物的載體。目前已經有一些關於白蛋白和阿黴素納米粒子的專利公開和文章發表。在有關的專利中，有的是通過超聲霧化方法製備的白蛋白納米粒子，具有被巨噬細胞吞噬而到達肝和脾的特點[中國專利申請號200910066561];有的是通過水包油或者油包水的方法製備白蛋白_阿黴素納米粒子[中國專利申請號02114356.0];有的是通過共價鍵連接阿黴素到白蛋白上[中國專利申請號200680034375.3];也有的是通過超聲波、微流化以及高壓均質技術將白蛋白結合到阿黴素脂質囊泡上[中國專利申請號200810147342. 0]，或者將白蛋白水溶液和阿黴素有機溶液進行乳化製備的[200810147344. X];另外，還有利用白蛋白和小分子糖一半乳糖複合物製備的阿黴素納米粒子[中國專利申請號200410046650. 6,200410046676. 0，200680034375. 3]。到目前為止，我們還沒有發現表面接有葉酸同時負載阿黴素的白蛋白納米粒子的報導。在載阿黴素的納米粒子表面接有葡聚糖可以使納米粒子避免被巨噬細胞吞噬而成功地輸送到革巴向病灶[Liu, Z. G. , et al. , Journal of Biomedical MaterialsResearch Part A，2007. 83A: p. 806-812. ; Couvreur, P.，et al.，European Journalof Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004. 58: p. 327-341. ; Labarre， D., etal.，Pharmaceutical Research, 1998. 15: p. 1046-1050.]。除此而外，在載藥納米粒子的表面修飾葡聚糖還可以增加納米粒子在水溶液中的穩定性。到目前為止，我們還沒有發現表面接有葡聚糖和葡聚糖-葉酸同時負載阿黴素的白蛋白納米粒子的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種分散性好，穩定性好，具有腫瘤靶向釋放藥物功能的負載阿黴素的白蛋白納米粒子製劑及其製備方法和應用。本發明提供的負載阿黴素並具有葉酸受體靶向功能的白蛋白納米粒子製劑，是一種以葡聚糖和葡聚糖-葉酸為殼，白蛋白和阿黴素為核的納米粒子溶液。所得到的納米粒子溶液在腫瘤靶向輸送藥物的應用。本發明提供的負載阿黴素的白蛋白納米粒子製劑的製備方法，具體步驟如下
(1)在無水二甲基亞碸(DMSO)溶液中以4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑和N，N』 二環己基碳二亞胺(DCC)為偶合劑，通過酯化反應將葉酸(FA)接枝到葡聚糖(DEX)分子上，得到葡聚糖-葉酸共價複合物；
(2)通過MaiIIard反應,將葡聚糖-葉酸和葡聚糖同時接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-葉酸複合物；(具體可按照專利號為2007100400288提出的方法，通過Maillard反應製備白蛋白-葡聚糖-葉酸共價複合物；Maillard反應過程為將葡聚糖-葉酸共價複合物和自由葡聚糖加入到白蛋白溶液中，將溶液混合均勻以後調節PH值，然後將溶液冷凍乾燥。將凍幹後的固體粉末稱重後放入燒杯中置於裝有KBr飽和溶液的密閉容器中進行Maillard反應後得到BSA-葡聚糖-葉酸共價複合物)；
(3)負載阿黴素在酸性條件下混合阿黴素和白蛋白-葡聚糖-葉酸共價複合物的水溶液，調節混合溶液的pH在6. 8 8. 8之間，然後將混合溶液加熱，使白蛋白變性並發生分子間交聯，從而將阿黴素固定在納米粒子的內部，共價連接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-葉酸複合物組成納米粒子的外殼。本發明利用阿黴素在PH改變條件下自身的疏水性發生變化以及阿黴素與白蛋白之間的靜電和疏水作用，形成以白蛋白和阿黴素為核的納米複合物；最後將混合溶液加熱，使白蛋白變性並發生分子間交聯，從而將阿黴素固定在納米粒子的內部。加熱溫度和/或者加熱時間的增加將使白蛋白的交聯程度增加因而導致阿黴 素的釋放速率降低。一般加熱溫度在60°C以上(優選為60°C--100°C)，加熱時間至少30分鐘(優選為30—1000分鐘)。共價連接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-葉酸複合物組成了納米粒子的外殼，使得納米粒子在水溶液中保持穩定。本發明的製備條件是
(1)葡聚糖的分子質量從2000到100000；
(2)白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是動物白蛋白，如牛血清白蛋白；
(3)在葡聚糖-葉酸複合物中，葉酸的摩爾接枝度為1% 10%之間；
(4)在製備白蛋白-葡聚糖-葉酸複合物的Maillard反應中，葡聚糖-葉酸複合物與葡聚糖的摩爾比在0.005:1 2:1之間，白蛋白與總葡聚糖(包括葡聚糖-葉酸複合物和單獨的葡聚糖)的摩爾比在5:1 1:20之間；
(5)在負載阿黴素的過程中，白蛋白-葡聚糖-葉酸複合物中的白蛋白濃度在0.5 50 mg/mL，阿黴素與白蛋白的質量比在10:1 1:10之間。本發明可以得到高效負載阿黴素的白蛋白-葡聚糖-葉酸納米粒子，阿黴素的包埋量和包埋效率分別可以達到14%和90%以上。動態光散射結果表明納米粒子的水合半徑在14 100 nm之間並保持長期穩定(附圖I)。透射電鏡結果表明納米粒子具有類似球形的外貌並且具有很好的分散性(附圖2)。在藥物釋放方面，與自由阿黴素相比，載阿黴素納米粒子具有明顯的緩釋性質(附圖3和附圖4)，納米粒子在pH 7. 4條件下釋放阿黴素的速率很小，而降低pH值可以顯著增加阿黴素的釋放速率。由於腫瘤細胞的PH值低於正常細胞，納米粒子的這個性質有利於其進入腫瘤細胞以後釋放阿黴素。荷瘤小鼠的實驗表明，接有葉酸的阿黴素納米粒子在腫瘤抑制和延長荷瘤小鼠生命方面具有明顯的優勢腫瘤抑制率達到88. 9%，生命延長率達73. 8%。


圖I.新鮮製備和存放35天的阿黴素/白蛋白-葡聚糖-葉酸納米粒子溶液的水合半徑分布。圖2.阿黴素/白蛋白-葡聚糖-葉酸納米粒子經磷鎢酸溶液負染以後的電子顯微鏡照片。圖3.自由阿黴素(free D0X)、加熱30分鐘(min)和60分鐘製備的阿黴素/白蛋白-葡聚糖(D0X/BSA-DEX)納米粒子及加熱30分鐘和60分鐘製備的阿黴素/白蛋白-葡聚糖-葉酸(0( /854-0￡乂- 4)納米粒子在？85(0.01 mol/L 7. 4磷酸緩衝液+ 0. 15 mol/L NaCl)中累計釋放阿黴素曲線。圖4.自由阿黴素(free D0X)、加熱30分鐘(min)和60分鐘製備的阿黴素/白蛋白-葡聚糖(D0X/BSA-DEX)納米粒子及加熱30分鐘和60分鐘製備的阿黴素/白蛋白-葡聚糖-葉酸(D0X/BSA-DEX-FA)納米粒子在0. I mol/L pH 5. 0醋酸緩衝液中累計釋放阿黴
素曲線。圖5.葉酸(A)、葡聚糖(B)和葡聚糖-葉酸複合物(C)的FTIR光譜圖。圖6.葉酸(A)、葡聚糖(B)和葡聚糖-葉酸複合物(C)在DMS0-d6溶劑中的1H NMR圖。
具體實施例方式實施例I.稱取葉酸斤八)0.45868、隊^二環己基碳二亞胺(00)0.21448和4-二甲氨基吡啶(DMAP)O. 1271g置於燒瓶中，加入25mL無水二甲基亞碸(DMSO)溶液，在30°C和氮氣的氣氛下避光活化葉酸的羧基30分鐘，然後加入分子量為10 kDa的葡聚糖(DEX)
I.0012g，反應20小時。反應結束後先抽濾除去沉澱，然後用截留分子量為3500的透析袋對10 mmol/L pH 7. 4磷酸緩衝液透析,除去沒有反應的葉酸。然後再對去離子水透析,透析期間離心(12000rpm，30min)除去沉澱。最後將純化後的葡聚糖_葉酸(DEX-FA)複合物凍幹備用。所合成的DEX-FA共價複合物用傅立葉轉換紅外光譜(FTIR，附圖5)及核磁共振(1H NMR，附圖6)對其結構進行了表徵。通過對葉酸分子中苯環上7. 63ppm位置的兩個H與葡聚糖異頭碳上4. 9ppm位置的一個H進行峰面積比較，得到葉酸的摩爾取代度為5. 0%，即每100個葡萄糖單元中有5個連接了葉酸。實施例2.將牛血清白蛋白(BSA)用去離子水溶解，配製成10 mg/mL的白蛋白溶液。然後將實施例I製備的10 kDa葡聚糖-葉酸複合物和10 kDa自由葡聚糖加入到白蛋白溶液中，白蛋白與總的葡聚糖的摩爾比為1:4。葡聚糖-葉酸和自由葡聚糖的摩爾比在0:1 2:1區間，將溶液混合均勻以後調節pH值到8.0，然後將溶液冷凍乾燥。將凍幹後的固體粉末稱重後放入燒杯中置於裝有KBr飽和溶液的密閉容器中(容器內相對溼度為79%)，在60 °C下進行48小時Maillard反應後得到BSA-葡聚糖-葉酸共價複合物。將BSA-葡聚糖-葉酸共價複合物用去離子水溶解，然後加入鹽酸阿黴素水溶液，阿黴素與白蛋白的質量比為1:4，白蛋白的最終濃度是5 mg/mL，溶液的pH值約為5 6之間。待溶液混合均勻後，用NaOH溶液調節混合溶液的pH到7.4形成阿黴素/白蛋白-葡聚糖-葉酸納米複合物，然後將此納米複合物溶液置於80°C水浴中加熱60分鐘，就可以得到阿黴素/白蛋白-葡聚糖-葉酸納米粒子水溶液。納米粒子的水合半徑(Rh)和多分散係數(PDI)通過動態光散射分析得到，測量時溶液被稀釋到白蛋白濃度為0. I mg/mL。在納米粒子溶液中的自由阿黴素通過超濾與納米粒子分離(超濾截留分子量50 kDa)，超濾液中的阿黴素濃度利用紫外-可見光譜在480 nm的吸收測定。阿黴素在納米粒子中的包埋效率和包埋量通過以下公式計算
權利要求
1.一種負載阿黴素並具有葉酸受體靶向功能的白蛋白納米粒子製劑的製備方法，其特徵在於具體步驟為(1)在無水二甲基亞碸溶液中以4-二甲氨基吡啶為催化劑，以N，N』二環己基碳二亞胺為偶合劑，通過酯化反應將葉酸接枝到葡聚糖分子上，得到葡聚糖-葉酸共價複合物；(2)通過MaiIIard反應,將葡聚糖-葉酸和葡聚糖同時接到白蛋白上，得到白蛋白_葡聚糖-葉酸複合物；(3)負載阿黴素在酸性條件下混合阿黴素和白蛋白-葡聚糖-葉酸共價複合物的水溶液，調節混合溶液的pH在6. 8 8. 8之間，然後將混合溶液加熱，使白蛋白變性並發生分子間交聯，從而將阿黴素固定在納米粒子的內部，共價連接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-葉酸複合物組成納米粒子的外殼。
2.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其他動物血清白蛋白。
3.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於所述的葡聚糖的分子量在2000 100000 之間。
4.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於(I)在葡聚糖-葉酸共價複合物中，葉酸的摩爾接枝度為1% 10% ；(2 )在Mai I Iard反應中，葡聚糖-葉酸共價複合物與葡聚糖的摩爾比在O. 005:1 2:1 之間，白蛋白與總葡聚糖的摩爾比在5:1 1:20之間；(3)在負載阿黴素的過程中，白蛋白-葡聚糖-葉酸複合物中的白蛋白濃度為O. 5 50 mg/mL，阿黴素與白蛋白的質量比為10:1 1:10，加熱溫度在60 °C 100 °C，加熱時間是 30 1000分鐘。
5.由權利要求1-4所述方法製備得到的負載阿黴素並具有葉酸受體靶向功能的白蛋白納米粒子製劑，是一種以葡聚糖和葡聚糖-葉酸為殼，白蛋白和阿黴素為核的納米粒子的溶液。
6.根據權利要求5所述的負載阿黴素的白蛋白納米粒子製劑在靶向輸送藥物方面的應用。
全文摘要
本發明屬於醫藥技術領域，具體為負載阿黴素並具有葉酸受體靶向功能的白蛋白納米粒子製劑及其製備方法。本發明通過Maillard反應，將葡聚糖-葉酸和葡聚糖同時接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-葉酸複合物；然後在酸性條件下混合阿黴素和白蛋白-葡聚糖-葉酸共價複合物的水溶液，調整溶液pH值以後加熱製備得穩定的具有葉酸受體靶向功能的阿黴素/白蛋白-葡聚糖-葉酸納米粒子。本發明得到的負載阿黴素的白蛋白-葡聚糖-葉酸納米粒子，阿黴素的包埋量和包埋效率分別可以達到14%和90%以上；動態光散射結果表明納米粒子的水合半徑在14～100nm之間並保持長期穩定；透射電鏡結果表明納米粒子具有類似球形的外貌並且具有很好的分散性。該納米粒子可在靶向輸送藥物方面廣泛應用。
文檔編號A61P35/00GK102973512SQ20121050379
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月2日 優先權日2012年12月2日
發明者姚萍, 郝和群 申請人:復旦大學