一種miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物及其用途
2023-07-21 00:26:01
一種miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物及其用途。miRNA-2861的反義核苷酸序列為5』-CCGCCCGCCGCCAGGCCCC-3』；藥物組合物包括感染滴度為1016 PFU過表達miRNA-2861反義核苷酸載體、病毒或輔料，所述載體為膽固醇、納米顆粒或脂質體；病毒載體為腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩衝液、生理鹽水中的一種或多種。通過口服或注射用於預防和治療心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰。本發明藥物組合物配方合理，藥理可靠，製作工藝簡單，治療效果明顯，應用範圍廣，使用環境友好。
【專利說明】-種miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物及其用途
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種內源性非編碼小RNAs的新藥及其用途，尤其是一種miRNA-2861 反義核苷酸治療心臟疾病的藥物組合物及其用途，屬於生物製藥【技術領域】。
【背景技術】：
[0002] 心血管疾病主要包括高血壓、冠心病和充血性心力衰竭等，心血管疾病是人類健 康的頭號殺手，全世界範圍內每年有一千七百萬人死於心血管疾病，其死亡率已接近所有 癌症死亡率的總和。隨著人民生活水平日益提高和飲食結構的改變，心血管疾病死亡率呈 明顯上升趨勢，已超過癌症成為第一大致死原因，預防和治療心血管疾病仍然是醫學與生 物學的重大任務。心肌肥大是指組織水平上心肌組織的增厚和細胞水平上心肌細胞體積的 增大的總稱是由於心肌細胞體積增大而導致心臟體積增大所發生的一種疾病。該病是由一 些生理和病理因素的共同刺激而發生的，是許多心血管疾病的綜合性表現；心肌肥大是心 肌病的一種，是心肌細胞針對於血液動力學增加的一種應答反應，多種情況可引起人體內 血液動力的增加，如高血壓，心臟瓣膜疾病。長期的超負荷血液動力刺激會引起以心肌細胞 體積增大為特徵的心肌細胞重塑過程，就是心肌肥大。現在一般認為存在兩種情況的心肌 肥大，一種是正常的生理性肥大，比如出生後伴隨者發育發生的心肌肥大，還有體育鍛鍊引 起的心肌肥大；另外一種是病理性心肌肥大，其早期特徵是室壁和室間隔增厚，心肌收縮功 能增強，因此被視為代償性肥大，如果病情一直未得到緩解，心肌肥大後期會發生心室壁 間質纖維化、心肌細胞收縮功能失調以及能量代謝，基因表達和電生理特徵的異常，最終導 致心臟功能衰竭。鑑於心肌肥大的發生是一個進行性不可逆過程，而且最終會引起心力衰 竭，現代醫學已經把它作為心臟發生臨床病變的一個裡程碑式的心肌形態變化，認為它是 導致心臟疾病和心臟猝死的一個危險因素。
[0003] 隨著近來miRNA研究應用的熱潮，內源性非編碼小RNAs已經作為一個基因表達調 節的中心因子顯露，參加許多重要的生理過程，對於miRNA來說，調控方式的特點決定其靶 基因不會只有一個，是一對多的方式，使得miRNA的功能究內容豐富；miRNA對於維持心臟 正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達與許多心臟疾病的發生相關。因此， 將miRNA作為心臟疾病治療的靶點，開發相關藥物具有潛在的臨床應用價值。；儘管越來越 多的miRNA作為人類疾病的生物標誌物及治療靶點被發現，但在心臟肥厚和心肌纖維化心 髒疾病中的關鍵miRNA仍沒有確定，其所發揮的功能是對該領域科研人員的挑戰。
【發明內容】
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[0004] 本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，尋求提供一種miRNA-2861反義核 苷酸用於製備診斷、預防或治療心臟疾病的藥物組合物及其用途，確定或發現調控心肌細 胞肥大的在心臟中表達的miRNA，進一步確定其在心臟疾病中的作用，並將其應用於這些心 髒疾病的診斷和防治。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明設計的miRNA-2861的反義核苷酸序列為 5' -CCGCCCGCCGCCAGGCCCC-3' ；採用常規工藝配成藥物組合物，包括感染滴度為IO16PFU過 表達miRNA-2861反義核苷酸載體、病毒或輔料，所述載體為膽固醇、納米顆粒或脂質體；病 毒載體為腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、 磷酸鹽緩衝液、生理鹽水中的一種或多種；
[0006] 藥物劑型為口服製劑、注射製劑、片劑、乾粉劑型中的一種或多種，優選的為注射 用小水針劑或注射用凍乾粉針。
[0007] 本發明的miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物，通過口服或注射用於預防和治療 心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰。
[0008] 本發明涉及的藥物組合物在肥大的心肌細胞和心臟肥厚中表達顯著上調，通過構 建miRNA-2861過表達腺病毒加強miRNA-2861的表達，發現miRNA-2861過表達在細胞水 平能誘導心肌細胞肥大的發生，肥大基因的表達與對照組相比有明顯的增加；在肥大的心 肌細胞中與對照組相比有明顯提高，對其進行肥大指標的檢測發現，心肌肥大的指標如細 胞表面積，蛋白/DNA的比值及肌小節的重組也與對照組相比都有明顯的增加，能夠誘導心 肌肥大的發生，作為早期診斷和早期預防心肌肥大、心肌纖維化等心臟疾病的生物標誌物； 對心肌肥厚和心肌纖維化具有保護作用，在細胞水平通過轉染miRNA-2861的反義核苷酸 發現，能夠抑制肥大刺激因子所誘導的心肌細胞肥大，包括肥大指標如細胞表面積，蛋白/ DNA的比值及肌小節的重組也與對刺激組相比都有明顯的降低；在動物水平通過注射外源 miRNA-2861的反義核苷酸也能夠抑制肥大模型的肥大效應包括心臟表型、心臟體重比、邊 緣區的心肌細胞橫截面積（WGA染色）和心肌纖維化（Masson染色）都有明顯的降低，同時 心功能也有明顯的改善。
[0009] 本發明與現有技術相比，其藥物組合物配方合理，藥理可靠，製作工藝簡單，治療 效果明顯，應用範圍廣，使用環境友好。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0010] 圖1為經心臟肥大刺激因子PE (苯腎上腺素）和Ang II (血管緊張素 II )誘導的 心肌細胞肥大過程中miRNA-2861表達水平的變化；
[0011] 圖2為對經miRNA-2861反義核苷酸轉染的原代細胞進行PE處理，在細胞水平上 對PE所誘導的肥大的抑制情況；
[0012] 圖3為對經miRNA-2861反義核苷酸轉染的原代細胞進行PE處理後心肌細胞的肌 小節重組的試驗結果示意圖；
[0013] 圖4為小鼠靜脈注射miRNA-2861反義核苷酸（antagomir)能抑制PE所誘導的肥 大模型的檢測結果示意圖；
[0014] 圖5為小鼠靜脈注射miRNA-2861反義核苷酸（antagomir)能抑制主動脈縮窄 (TAC)所誘導的小鼠心臟肥大模型的檢測結果示意圖。
【具體實施方式】：
[0015] 下面通過實施例並結合附圖對本發明作出進一步闡述。
[0016] 實施例1、
[0017] miRNA-2861反義核苷酸過表達腺病毒載體及陰性對照腺病毒構建，本實施例採 用人工合成miRNA-2861反義核苷酸序列，亞克隆連入Ambion公司的pSilencer Adeno I. O-CMV系統，構建miRNA-2861反義核苷酸過表達腺病毒。其miRNA-2861反義核苷酸核苷 酸序列如下列 SEQ ID N0:1 所示：5' -CCGCCCGCCGCCAGGCCCC-3'
[0018] 按照公司說明書步驟，將Pac I線性化的該載體與線性化的腺病毒骨架 (AdenovirTs LacZ Backbone)共轉染HEK-293細胞，包裝腺病毒，擴增收集病毒，測定病毒 滴度；將空載體和腺病毒骨架按照上述步驟共轉染HEK-293細胞，包裝陰性對照腺病毒。
[0019] 將上述所得的過表達miRNA-2861反義核苷酸的重組體腺病毒磷酸鹽緩衝液稀釋 為感染滴度lxl〇 16PFU/ml，按Iml量無菌分裝到安瓿瓶內，即得。
[0020] 實施例2、
[0021] 在PE和Ang II刺激下miRNA-2861表達水平的變化，本實施例對於心肌細胞肥 大模型，採用已建立的方法培養大鼠乳鼠原代心肌細胞（大鼠乳鼠購自北京醫科大學，大 鼠品係為Wistar，大鼠乳鼠原代心肌細胞的製備可參見以下文獻：W. -Q. Tan, etal，Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem. 20080ctober 31 ;283 (44) : 29730-29739)，對心肌細胞用 PE 和 Ang II 進行處理，在培 養的不同時間，提取細胞的總RNA，實時螢光定量PCR技術檢測miRNA-2861的表達水平，如 圖IAUB所示，其中，圖IA為大鼠乳鼠原代心肌細胞經PE處理後miRNA-2861隨時間的表 達水平；圖IB為大鼠乳鼠原代心肌細胞經Ang II處理後miRNA-2861隨時間的表達水平， 縱坐標表示以未處理的大鼠原代心肌細胞中miRNA-2861的表達水平為基準，在PE或Ang II處理過程中大鼠原代心肌細胞中miRNA-2861的表達水平。miRNA-2861表達水平在PE和 Ang II處理6小時之內有顯著的上升。
[0022] 實施例3、
[0023] miRNA-2861反義核苷酸能夠在細胞水平上抑制PE所誘導的肥大，本實施例對原 代心肌細胞轉染miRNA-2861反義核苷酸（anta-2861)後，能有效的抑制miRNA-2861的 表達，同時細胞用PE對心肌細胞進行處理，及同時用miRNA-2861反義核苷酸的陰性對照 (anta-NC)處理，經過24小時之後，對心肌細胞進行心肌肥大指標的檢測，如心肌細胞表面 積（圖2A)、蛋白/DNA(圖2B)檢測，實驗結果證明miRNA-2861反義核苷酸能夠有效的抑制 PE所誘導的心肌細胞肥大。
[0024] 實施例4、
[0025] miRNA-2861反義核苷酸能夠在細胞水平上抑制PE所誘導的心肌細胞肌小節的 重組，本實施例對原代心肌細胞轉染miRNA-2861反義核苷酸（anta-2861)和陰性對照 (anta-NC)後，用PE對心肌細胞進行處理，經過處理24小時之後，對心肌細胞進行肌小節的 重組檢測，如圖3所示，實驗結果證明miRNA-2861反義核苷酸能夠有效的抑制PE所誘導的 心肌細胞的肌小節的重組。
[0026] 實施例5、
[0027] 小鼠靜脈注射miRNA-2861反義核苷酸（antagomir)能抑制PE所誘導的肥大 模型，本實施例對小鼠用PE埋泵處理二周後，小鼠的心臟有明顯的肥大表型，而同時加 入miRNA-2861反義核苷酸（anta-2861)可以明顯減弱PE所誘導的肥大效應包括心肌 細胞的橫截面積大小（WGA染色）（如圖4A)及心臟體重比（如圖4B);同時向小鼠注射 miRNA-2861反義核苷酸的陰性對照（anta-NC)和PE，並不能減弱PE的肥大效應，實驗結果 證實miRNA-2861反義核苷酸能夠在整體水平抑制PE所誘導的心臟肥大的發生。
[0028] 實施例6、
[0029] 小鼠靜脈注射miRNA-2861反義核苷酸（antagomir)能抑制主動脈縮窄 (TAC)所誘導的小鼠心臟肥大模型，本實施例對小鼠用主動脈縮窄（Thorac i c aorta constriction,TAC)的方法處理三周後能夠誘導肥大表型的產生；同時加入miRNA-2861反 義核苷酸（anta-2861)可以明顯減弱TAC所誘導的肥大效應；加入miRNA-2861反義核苷 酸的負對照（anta-NC)的組別與TAC組別比沒有明顯的改變即並不能減弱TAC所誘導的 肥大效應（圖5)，包括心臟體重比（圖5A)及心肌細胞的橫截面積大小（WGA(Wheat germ agglutinin)染色）（圖5B);實驗結果證實miRNA-2861反義核苷酸能夠在整體水平抑制 TAC所誘導的心臟肥大的發生。
[0030]
【權利要求】
1. 一種miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物，其特徵在於miRNA-2861的反義核苷酸序 列為5'-CCGCCCGCCGCCAGGCCCC-3';藥物組合物包括感染滴度為1016PFU過表達miRNA-2861 反義核苷酸載體、病毒或輔料，所述載體為膽固醇、納米顆粒或脂質體；病毒載體為腺病毒 載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩衝液、生 理鹽水中的一種或多種。
2. 根據權利要求1所述的一種miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物，其特徵在於藥物劑 型為口服製劑、注射製劑、片劑、乾粉劑型中的一種或多種。
3. -種miRNA-2861反義核苷酸藥物組合物的用途，其特徵在於通過口服或注射用於 預防和治療心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰。
【文檔編號】A61K31/7088GK104491879SQ201410803184
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月19日 優先權日:2014年12月19日
【發明者】王昆, 李培峰 申請人:青島大學