用於顆粒狀澱粉水解的酶組合物中天然的穀物澱粉酶的製作方法

2023-07-21 07:28:36 2

專利名稱：：用於顆粒狀澱粉水解的酶組合物中天然的穀物澱粉酶的製作方法
技術領域：
：02本發明涉及澱粉水解方法，其用於在溫度低於澱粉膠凝溫度下，從在碾碎的植物材料中的澱粉獲得可發酵糖，並且進一步涉及糖發酵以生產最終產品，例如乙醇。
背景技術：
：03澱粉是重要的原料，廣泛用於工業目的，例如高果糖漿和乙醇的生產。在植物種子中澱粉形成主要儲存糖類成分，並且澱粉顆粒通常是抗降解的。傳統上，高溫和/或酶的組合物己經被用於水解澱粉。澱粉水解酶，例如(x-澱粉酶(E.C.3.2丄l.)——其是內切作用水解酶，水解澱粉分子內部的a-l，4鍵，在工業中是最經常使用的。a-澱粉酶由植物、動物和微生物產生。用源自微生物源的a-澱粉酶，從植物種子進行澱粉水解、特別是從穀粒進行澱粉水解，在很多工業方法中是常規的，其中澱粉降解的第一步是澱粉水解為葡萄糖或澱粉水解為麥芽糖糊精。傳統上，這些方法在高溫下進行(例如，高於包含底物的澱粉的初始膠凝溫度)(Corn:ChemistryandTechnology,WatsonS.A.等人編輯，(1991)AmericanAssociationofCerealChemists,Inc.禾卩TheAlcoholTextbook,第三版，Jacques等人編輯，(1999),NottinghamUniversityPress)。最近，工業上已經探索通過發酵使用低能量方法進行澱粉水解和生產醇(例如在低於植物材料中包含的澱粉的初始膠凝溫度的溫度下)(USP4,514,496、WO03/066826;WO04/081193;WO04/106533;04本發明涉及從磨碎的植物材料水解澱粉的方法，包括在溫度低於該磨碎的植物材料中的顆粒狀澱粉的初始膠凝溫度下，使磨碎的植物材料與外源性植物(x-澱粉酶、葡糖澱粉酶和任選的微生物a-澱粉酶的組合物接觸，以獲得可發酵糖。本發明進一步涉及在發酵微生物的存在下發酵該可發酵糖為最終產品。05在一個方面，本發明包括從磨碎的植物材料水解澱粉的方法，該磨碎的植物材料包含顆粒狀澱粉，通過在溫度低於顆粒狀澱粉的澱粉膠凝溫度下使磨碎的植物材料與外源性植物(x-澱粉酶和葡糖澱粉酶接觸而進行，以生產寡糖和生產可發酵糖。該方法也可以包括在發酵微生物存在下，在l(TC和4(TC之間的溫度下，發酵可發酵糖10小時至250小時的一段時間，以生產醇。所述磨碎的植物材料可以為具有顆粒狀澱粉的漿狀物，該漿狀物具有5。/。至60。/。之間的DS，或者可選地25%至40%之間的DS，或者可選地15n/。至45M之間的DS。a澱粉酶可以被加入0.001至30AAU/DS之間的量。06在其它方面，接觸步驟也包括使磨碎的植物材料與微生物a-澱粉酶接觸。溫度可以在50。C至7CTC之間。植物a-澱粉酶可以是來自植物的a-澱粉酶，所述植物包括大麥、小麥、白高粱、黑麥、高梁、稻米、黍、小黑麥、木薯、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。優選地，所述植物材料是玉米、高粱、大麥、小麥、稻米或其組，物。在一些重要的方面，所述植物是分級玉米(fractionatedcorn)。在一些方面，所述醇是乙醇，並且方法進一步包括回收乙醇。07在其它方面，本發明包括用於生產乙醇的方法，該方法通過如下進行在溫度低於顆粒狀澱粉的膠凝溫度下，使從植物材料獲得的、包含顆粒狀澱粉的漿狀物與能溶解顆粒狀澱粉的外源性植物a-澱粉酶接觸5分鐘至24小時的一段時間，獲得底物，以及在發酵微生物的存在下，在10'C至40'C之間的溫度下，發酵該底物10小時至250小時的一段時間，產生乙醇。在一些方面，所述方法也包括回收乙醇。所述a-澱粉酶可以是例如包括下述的a-澱粉酶大麥、小麥、白高粱、黑麥、高梁、6稻米、黍、小黑麥、木薯、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。在一些方面，所述方法包括使漿狀物與微生物a澱粉酶接觸。所述接觸步驟可以在50'C至7(TC之間的溫度下進行。所述方法也可以包括，在發酵步驟之前使底物澄清。在一些方面，所述方法可以包括在接觸步驟添加另外的酶，如葡糖澱粉酶、植酸酶、蛋白酶、纖維素酶和/或半纖維素酶。在一些優選的方面，所述另外的酶是植酸酶和/或蛋白酶。在一些方面，所述漿狀物具有5-60%DS之間的顆粒狀澱粉，或者可選地20-40"/。DS之間。在一些方面，所述方法包括使底物與水溶液接觸，該水溶液包含渦流以在發酵步驟之前稀釋。/。DS。所述顆粒狀澱粉可以從玉米、高粱、大麥、小麥、稻米或其組合物獲得。08圖1說明從大麥麵粉(32。/。DS)經發酵時間(小時)產生乙醇(％v/v)，其經各種處理，包括STARGEN001(--);大麥AA+AnGA(-■-);大麥AA+TrGA(-*-)和大麥AA+HGA(-▲-)";09圖2說明從大麥麵粉(32。/。DS)經發酵時間(小時)產生乙醇(％v/v)，其經各種處理，包括STARGENOOl(--);HGA(-□-);大麥AA+STARGEN001(-)K-);大麥AA+HGA(-隱-);和對照(未添加酶)(--)。發明詳述10除非另有定義，本發明所用的技術和科學術語，與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的具有相同意義。11儘管與本文中所述的那些類似或等價的任何方法和材料可以在本發明的實踐或測試中使用，但是描述的是優選的方法和材料。12現在，使用下面的定義和實施例，僅通過參考的方式對本發明進行詳細描述。本文中提及的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列，被明確地引入作為參考。定義13如本文中所使用，術語"澱粉(starch)"是指由植物複合多糖碳水化合物組成的任何物質，由具有式(C6H,oO丄的直鏈澱粉和支鏈澱粉組成，其中X可以是任何數。14術語"顆粒狀澱粉(granularstarch)"是指粗澱粉，即在植物材料(例如，穀粒和根莖類)中發現的、自然形態的澱粉。15術語"幹固體含量(ds)"是指基於乾重以百分比(％)計的漿體中的總固體。術語"漿體(slurry)"是指含有不溶性固體的含水混合物。16術語"可發酵糖(fermentablesugars)"是指寡糖和單糖，其能通過使用發酵微生物的發酵被轉化為最終產品。」17術語"糊精(dextrins)"是指短鏈的葡萄糖聚合物(例如，2至IO個單位)。18術語"寡糖"是指具有2至IO個以糖苷鍵連接的單糖單元的任何化合物。簡單糖的這些短鏈聚合物包括糊精。19術語"a-澱粉酶(alpha-amylase)(例如E.C.類另iJ3.2丄1)"是指催化(x-l，4-糖苷鍵水解的酶。20術i吾"糖化酶(saccharifyingenzyme)"和"澱粉水解酶(starchhydrolyzingenzymes)"是指能轉化澱粉為單糖或寡糖(例如，己糖或戊糖)的任何酶。21術語"顆粒狀澱粉水解(GSH)酶"和"具有顆粒狀澱粉水解(GSH)活性的酶"是指能水解顆粒狀形態澱粉的酶。22術語"澱粉的水解"是指糖苷鍵因加入水分子而斷裂。23術語"內源性植物a-澱粉酶"是指具有a-澱粉酶活性的、由植物材料表達和產生的酶。如在此使用的內源性植物a-澱粉酶可以是異源的或同源的。24術語"外源性植物a-澱粉酶"是指具有a-澱粉酶活性的酶，其源自植物(x-澱粉酶並且獨立於用作澱粉水解底物的植物材料而提供。25術語"微生物的a-澱粉酶"是指具有a-澱粉酶活性的、源自微生物源(例如細菌或真菌)的酶，並包括修飾的酶、活性片段和其雜種。26涉及多核苷酸或蛋白質的術語"異源的(heterologous)"是指在宿主細胞中非天然發生的多核苷酸或蛋白質。該術語意圖包括由天然發生的基因、突變基因、合成基因和/或過表達基因編碼的蛋白質。27涉及多核苷酸或蛋白質的術語"同源的(homologous)"是指在宿主細胞中天然發生的多核苷酸或蛋白質。28術語"葡糖澱粉酶(glucoamylase)"是指澱粉葡糖苷酶類的酶(例如，E.C.3.2丄3，葡糖澱粉酶、1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用酶，其從直鏈澱粉和支鏈澱粉分子的非還原端釋放葡糖基殘基。29在此使用的術語"磨碎的(milled)"是指尺寸被減小的植物材料，例如，通過碾碎、壓碎、分級或任何其它減小顆粒尺寸的方法。30術語"膠凝(gelatinization)"是指澱粉分子的增溶作用，通常通過烹煮形成粘稠懸液進行。31術語"膠凝溫度(gelatinizationtemperature)"是指包含底物的澱粉開始膠凝的最低溫度。確切的膠凝溫度取決於具體澱粉，並且可以依賴於例如植物種類和環境以及生長條件這些因素而變化。對於可以根據在此所述方法使用的許多顆粒狀澱粉，初始澱粉膠凝溫度的範圍包括大麥(52。C至59。C)、小麥(58。C至64匸)、黑麥(57。C至70。C)、玉米(62。C至72。C)、高直鏈澱粉玉米(67t:至80'C)、稻米(68i:至77。C)、高梁(68°〇至77°0、馬鈴薯(58。C至68°C)、木薯(59。C至69°C)和甘薯(58。C至72°C)(J丄M.Swinkels的STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY中32-38頁，VanBeynum等人編輯(1985)MarcelDekkerInc.NewYork禾QTheAlcoholTextbook第三版，Jacques等人編輯，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries(1999)NottinghamUniversityPress,-UK)。32術語"低於膠凝溫度"是指溫度小於膠凝溫度。33如本文中所使用，術語"幹固體含量(ds)"是指基於乾重以百分比(％)計的漿體中的總固體，包括水分。34術語"漿狀物"是指包含不溶固體(例如，顆粒狀澱粉)的含水混合物。35術語"醪液(mash)"是指液態的可發酵底物的混合物，其被用於產生發酵產物，並且該術語被用於指從初始混合可發酵底物與一種或多種澱粉水解酶和發酵有機體至發酵實驗完成的任意發酵階段。36術語"發酵(fermentation)"是指通過微生物酶分解和厭氧分解有機底物，以生產更簡單的有機化合物。雖然發酵發生在缺氧條件下，但該術語不意圖僅限於嚴格缺氧條件，因為發酵也在氧存在下發生。37短語"同步糖化和發酵(SSF)"是指產生最終產品的過程，其中發酵有機體例如產乙醇微生物和至少一種酶例如糖化酶在同一工藝步驟中結合在同一容器中。38術語"糖化(saccharification)"是指不可直接使用的多糖被酶轉化為單糖或寡糖，以便發酵轉化為最終產品。39術語"最終產品"是指從可發酵底物酶轉化的任何碳源衍生產品。在一些優選的實施方式中，所述最終產品是醇，例如乙醇。40在此使用的術語"發酵有機體"是指任意的微生物或細胞，其適合用於發酵，以便直接或間接生產最終產品。41在此使用的術語"產乙醇者"或"產乙醇微生物"是指能從單糖或寡糖生產乙醇的發酵生物。42如在此使用的術語"回收(recovered)"、"分離(isolated)"和"分開(separated)"是指蛋白質、細胞、核酸或胺基酸從至少一種與其天然相關的成分中去除。43術語"源自(derived)"包括術語"起源自(originatedfrom)"、"得自(obtained)"或"可得自(obtainablefrom)"和"分離自(isolatedfrom)",並且在一些實施方式中，如在此使用的，是指從細胞產生核苷酸序列編碼的多肽，在所述細胞中核苷酸是天然存在的或核苷酸已經被插入所述細胞中。44術語"酶促轉化(enzymaticconversion)"通常是指底物通過酶作用修飾。45術語"產量(yield)"是指使用本發明的所述方法生產的最終產品的量。在一些實施方式中，該術語是指最終產品的體積，並且在其它實施方式中，該術語是指最終產品的濃度。46在此使用的術語"酶單位(enzymeunit)"是指在特定測定條件下每分鐘生產1微摩爾產品的酶的量。例如，在一個實施方式中，術語"葡糖澱粉酶活性單位(GAU)"定義為在測定條件6(TC和pH4.2下，從可溶澱粉底物(4。/。DS)每小時生產lg葡萄糖所需要的酶的量。在另一實施方式中，對"可溶澱粉單位(SSU)"，l單位的酶活性等價於在特定培養條件下每分鐘釋放的葡萄糖中lmg的還原力，並且是基於10等份的酶樣品在pH4.5、5(TC下水解可溶馬鈴薯澱粉底物(4%DS)的程度。DS是指"幹固體(drysolids)"。47如本文中所使用，術語"包括(comprising)"和其同源詞以其包含性意義使用；也就是說，等價於術語"包含(including)"及其相應的同源詞。48"一個(a)"、"一個(an)"和"這個(the)"包括複數形式，除非上下文中另外明確指出。"49數值範圍包括限定該範圍的數。50本文所提供的標題不是對本發明的不同方面或實施方式的限制，其可以通過整體上參考說明書而被理解。實施方式51在植物細胞以及微生物的細胞中，a-澱粉酶也涉及澱粉的水解，並且在穀類種子的發芽期間，澱粉降解的起始伴隨大量的a-澱粉酶的從頭合成。因此，穀類種子有其自己的內源性澱粉水解a-澱粉酶，其涉及產生用於發芽和生長的簡單糖。52在低於初始澱粉膠凝溫度的溫度條件下(例如低於80°C)，澱粉水解酶的酶組合物，包括那些來自微生物源的和那些來自天然植物a-澱粉酶的，提供了水解顆粒狀澱粉並獲得可發酵糖以及其它最終產品的改進方法。磨碎的植物材料53包含顆粒狀澱粉的植物材料可以得自，但不僅限於，小麥、玉米、黑麥、高梁(買羅高粱)、稻米、黍、大麥、小黑麥、木薯(木薯粉)、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆類如大豆和豌豆。優選的植物材料包括玉米、大麥、小麥、稻米、高粱及其組合。植物材料可以包括雜交品種和遺傳改良品種(例如，包含異源基因的轉基因玉米、大麥或大豆)。植物任意部分可以被用作植物材料，包括但不僅限於植物的各部分，例如葉、莖、莢、外果殼、根莖、穗軸、穀粒和類似物。在一個實施方式中，整穀粒可以被用作顆粒狀澱粉源。優選的整穀粒包括玉米、小麥、黑麥、大麥、高梁和其組合。54優選情況下，所述整穀粒的尺寸通過本領域已知的方法被減小，其包括碾磨(例如錘碾磨或滾筒碾磨)；乳化技術；旋轉脈動；分級和類似方法。在一些實施方式中，所述植物材料被磨細，以至至少70%將通過具有0.5毫米濾網的篩。在一些實施方式中，磨細的植物材料的至少90%將通過具有0.5毫米濾網的篩。55在其它實施方式中，所述植物材料是分級的穀類穀粒，其包括纖維、胚乳和/或芽孢部分。在一些實施方式中，某些級分將被用於本發明的澱粉水解方法。用於分級植物材料例如玉米、大麥和小麥的方法是本領域公知的。植物a-澱粉酶56在優選的實施方式中，根據本發明，用於磨碎的植物材料的澱粉水解的酶組分是外源性植物(x-澱粉酶。57外源性植物a-澱粉酶可以從各種植物和植物部分獲得，例如玉米、大麥、小麥、稻米和高粱。至少一種植物(x-澱粉酶已經被純化，並且可以從例如Sigma-Aldrich的來源商業獲得。優選的植物澱粉酶包括那些源自大麥和高粱的。58很多植物(x-澱粉酶已經被純化，並且這些酶中的一些已經被測序。植物a-澱粉酶的實例包括那些在擬南芥(Arabidopsis)(GenBankNP564977);稻米(Karrer等人(1992)ThePlanU.2:51,7-532;和Karrer等人(簡)PlantMol.Biol.16:797-805);玉米(美國專利2005/0138688;Warner等人(1991)PlantSci.78:143—150和Subbarao等人(1998)Phytochem.49:657-666);大麥(Xavier等人(2003)Structure11:973-984;MacGregor等人(2001)Biochim.Biophys.Acta1546:1—20;和GenBankX05166)中發現的。59在本方法進行的溫度下，可以相信內源性植物a-澱粉酶未被滅活並且也可以促進顆粒狀澱粉水解。60根據本發明的外源性植物a-澱粉酶可以被單獨添加或與其它酶結合添加。葡糖澱粉酶-61在本發明的優選實施方式中，所述方法包括使磨碎的植物材料與外源性植物a-澱粉酶和葡糖澱粉酶的組合物接觸。62葡糖澱粉酶(E.C.3.2丄3.)可以源自細菌、植物和真菌源的異源或內源蛋白質表達。優選的，對本發明有用的葡糖澱粉酶通過數個絲狀真菌和酵母菌的菌株生產。特別是，從麴黴G^/7^^7/""和木黴菌(7h'c/20^"廳)的菌株分泌的葡糖澱粉酶是商業上重要的。適合的葡糖澱粉酶包括天然產生的野生型葡糖澱粉酶以及變體和基因工程突變體葡糖澱粉酶。以下的葡糖澱粉酶是可以用於本發明考慮的方法中的葡糖澱粉酶的非限制性實例。黑麴黴04^wg///^"/gw)Gl和G2葡糖澱粉酶(Boel等人(1984)EMBOJ.3:1097-1102;WO92/00381、WO00/04136和USP6,352,851);泡盛麴黴(ApeA^7/wavrawon')葡糖澱粉酶(WO84/02921);米麴黴(Aperg/〃^co^ae)葡糖澱粉酶(Hata等人(1991)Agric.Biol.Chem.55:941-949)禾口當ra應m/(見Chen等人(1996)Prot.Eng.9:499-505;Chen等人(1995)Prot.Eng.8:575-582;和Chen等人(1994)BiochemJ.302:275-281)。63葡糖澱粉酶也從踝節菌屬(ra/aram;^")的菌株獲得，例如那些源自埃默森籃狀菌(ewe"om7)、7:/e_yce"am、！T^po^/和嗜熱籃狀菌(7:AmwopM"力的(WO99/28488;USPNo.RE:32,153;USPNo.4,587，215);木黴屬(7h'c/20fifema)菌株例如裡氏木黴(7:/"ee"/)，特別是與公開在US專利發明者M·庫瑪申請人:美國丹尼斯克有限公司傑能科子公司