一種自體脂肪幹細胞抗衰老效果的評價體系的製作方法

2024-01-30 02:49:15

專利名稱：一種自體脂肪幹細胞抗衰老效果的評價體系的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術及再生醫學領域。具體地，本發明涉及一種自體脂肪幹細胞抗衰老效果的評價體系，用本發明的體系能夠準確、客觀、及時地對脂肪幹細胞的抗衰老的效果進行評價。
背景技術：
人類從胚胎發育、生命誕生到發育成熟、衰老直至死亡的整個生命過程中，不可避免地會發生組織、器官的損傷和功能衰退。在正常生理過程中，人體每天都有大量細胞死亡，同時伴有大量細胞的新生，以維持各種組織和器官的完整性，保證功能處於正常狀態。 如果細胞的死亡與新生失去平衡，死亡細胞增多或新生細胞減少，就會導致組織器官功能的減退、疾病發生，甚至死亡。衰老是人體隨著年齡增長、環境影響而發生的組織、器官、細胞的功能退行性變化，表現為機體的功能活動能力進行性下降，對環境的適應能力逐漸降低，體內代謝平衡失調，進而導致面色蒼老、皮膚鬆弛、皺紋增多、易疲勞、腦力和體力勞動能力下降、性功能減退等一系列衰老症狀。由於衰老是全身系統性組織、器官功能退化，因此，抗衰老和整形的策略也應考慮從整體水平改善功能。再生醫學的興起激發了人們對各種幹細胞、組織工程支架和細胞生長因子的研究熱潮。幹細胞(stem cells, SC)是一類具有自我複製能力的多潛能細胞，在一定條件下， 它可以分化成多種功能性細胞。幹細胞可以對多種組織、器官、系統的老化退行性病變進行再生性修復，使其結構和功能正常化、年輕化，從整體上調控機體狀態，是一種全身性、系統性、根本性的保健。脂肪組織通常被認為是貯存能量及內分泌器官，是軟組織填充和吸脂處理的必要組織，脂肪組織在人體內儲量豐富，獲取簡便。脂肪組織含有多種祖細胞，可分化為多種譜系，主要包含脂肪細胞、脂肪幹細胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)、血管內皮細胞、 成纖維細胞、巨噬細胞及細胞外基質。脂肪幹細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) 是一種具有多向分化潛能的幹細胞，ADSCs在體外穩定增殖且衰亡率低，在體內體外具有多向分化潛能，在不同的誘導因子作用下可以向脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、成骨細胞、神經細胞、神經膠質細胞及胰島細胞分化，而且可以分泌多種促血管生成因子和抗凋亡因子。脂肪幹細胞來源廣泛、取材容易、對機體損傷小，體內儲備量大、少量組織即可獲取大量幹細胞，且適宜自體移植和大規模培養，因此脂肪幹細胞逐漸成為近年來的研究熱點之一，同時也為一系列疾病的治療提供了新的思路。研究證明，脂肪幹細胞對新陳代謝和抗衰老有重要的調節功能，脂肪幹細胞保健和治療能提高機體對各種脂蛋白的代謝功能，具有例如降低血中總膽固醇濃度，提高機體糖代謝功能，降低血糖水平，降低體重等功能。因此儘管用於抗衰老的脂肪幹細胞發展很快，但是由於生物體的內外環境的作用，阻礙了自體脂肪幹細胞抗衰老的評價體系的建立，因此本領域需要開發和建立一種快速、準確、經濟的脂肪幹細胞抗衰老的評價方法和體系。

發明內容
本發明的目的就是提供一種簡便和/或高效的一種自體脂肪幹細胞抗衰老效果的評價體系。本發明提供了一種脂肪幹細胞抗衰老的評價方法，對回輸了脂肪幹細胞的個體， 在回輸結束一段時間後進行血清學檢測，所述的血清學檢測包括檢測選自下組的一個或多個指標維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮、雌二醇。(a)當Ra彡5%時，則該指標有效，其中，Ra= (Ral-RaO) ^-RaO X 100%,式中，Ral為個體回輸後血清中的維生素D濃度，RaO為回輸結束前的維生素D濃度；(b)當1 彡5%時，則該指標有效，其中，Rb = (Rbl-RbO)+RbOX 100%，式中，Rbl為個體回輸後血清中的高密度脂蛋白濃度，RbO為回輸結束前的高密度脂蛋白濃度；(c)當Rc彡5%時，則該指標有效，其中，Rc = (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO為回輸結束前的低密度脂蛋白濃度，Rcl為個體回輸後血清中的低密度脂蛋白濃度；(d)當Rd彡5%時，則該指標有效，其中，Rd = (RdO-Rdl)+RdOX 100%，式中，RdO為回輸結束前的促甲狀腺激素的濃度，Rdl為個體回輸後血清中促甲狀腺激素的濃度；(e)當個體是男性時，且當Re彡5 %時，則該指標有效，其中，Re = (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel為個體回輸後血清中的睪酮的濃度，ReO為回輸結束前的睪酮的濃度；(e)當個體是女性時，且當Rf彡5%時，則該指標有效，其中，Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl為個體回輸後血清中的雌二醇的濃度，RfO為回輸結束前的雌二醇的濃度；並且，當所述指標中至少一個指標為有效時，則表示所述脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當所述指標中有2、3和4個指標為有效時，則所述脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，所述的回輸結束前，包括回輸開始之前、回輸過程中以及回輸結束時。在另一優選例中，所述的一段時間為> 1個月。
在另一優選例中，所述的一段時間為2-6個月，較佳地為3個月。在另一優選例中，所述回輸的脂肪幹細胞為培養0-90天的脂肪幹細胞。在另一優選例中，所述回輸的脂肪幹細胞為培養30天的脂肪幹細胞。在另一優選例中，所述脂肪幹細胞是自體脂肪幹細胞。在另一優選例中，當Ra ^ 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Ra ^ 20%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rb ^ 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rb ^ 20%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rc ^ 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rc ^ 20%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rd ^ 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rd ^ 20%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Re ^ 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述男性個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Re ^ 20%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述男性個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rf ^ 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述女性個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，當Rf ^ 20%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述女性個體中產生抗衰老效果。在另一優選例中，所述的回輸的脂肪幹細胞的具有以下一個或多個特徵(i) 95%以上的細胞具有表面抗原⑶四；(ii) 90%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ；(iii) 90%以上的細胞具有表面抗原⑶49d ；和(iv) 90%以上的細胞具有表面抗原⑶90。在另一優選例中，99%以上的細胞具有表面抗原⑶四。在另一優選例中，95%以上的細胞具有表面抗原⑶73。在另一優選例中，95%以上的細胞具有表面抗原⑶49d在另一優選例中，95%以上的細胞具有表面抗原⑶90。在另一優選例中，所述脂肪幹細胞還具有以下特徵(ν) 5%以下的細胞具有表面抗原CD34 ；和/或
(vi)O. 05%以下的細胞具有表面抗原CD45。在另一優選例中，3%以下的細胞具有表面抗原⑶34在另一優選例中，0%的細胞具有表面抗原⑶45。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再--累述。


圖1顯示了用流式細胞儀法對製備的SVF進行表面抗原標記表達的分析結果。圖2顯示了用流式細胞儀法對經培養的脂肪幹細胞群進行表面抗原標記表達的分析結果。圖3顯示了分離和培養的脂肪幹細胞具有分化為脂肪的能力，其中，圖3A顯示在成脂誘導劑作用下，脂肪幹細胞能夠生成脂質，胞漿中可見生產大量的紅色脂滴；圖3B為成脂實驗的陰性對照，在沒有成脂誘導劑的作用下，脂肪幹細胞不能夠自發生成脂質。圖4顯示了分離和培養的脂肪幹細胞具有分化為骨的能力，其中，圖4A顯示脂肪幹細胞在成骨誘導劑作用下，經茜素紅染色，可見細胞漿中有紅色的鈣化基質沉積；圖4B 顯示成骨實驗的陰性對照，在沒有成骨誘導劑的作用下，脂肪幹細胞不能夠自發成骨。圖5顯示了回輸脂肪幹細胞的受試者，其血液中維生素D的濃度顯著上升。圖6顯示了回輸脂肪幹細胞的受試者，高密度脂蛋白(HDL)的濃度顯著上升。圖7顯示了回輸脂肪幹細胞的受試者，低密度脂蛋白(LDL)的濃度均顯著下降。圖8顯示進行脂肪幹細胞回輸後的男性受試者，其血清中睪酮的濃度顯著上升。圖9顯示進行脂肪幹細胞回輸後的女性受試者，其血清中雌二醇的濃度顯著上升。圖10顯示了回輸脂肪幹細胞的受試者，其血清中促甲狀腺激素的濃度均顯著下降。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現，在可供檢測的大量的血清學指標中，維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮(男性)、雌二醇(女性)的含量變化可以作為評價自體脂肪幹細胞抗衰老效果的有效性指標，當所述指標中至少一個指標為有效時，則表示所述脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。與此相反，膽固醇， 血糖，總脂蛋白等的濃度不能作為評估脂肪幹細胞抗衰老效果的有效性指標。用本發明的評價體系能夠客觀地對脂肪幹細胞的抗衰老的效果進行評價，並且具有快速、準確、經濟的優點。在此基礎上完成了本發明。術語
如本文所用，術語「以上」和「以下」包括本數，例如「95%以上「指彡95%, "0.2% 以下」指彡0.2%。脂肪自體脂肪是整形和抗衰老治療的優良來源，脂肪組織材料可以來源於腰部、臀部、 腹部、大腿、上臂等部位。本領域技術人員可採用通用的技術方法獲得自體脂肪組織，包括 (但不限於)抽吸、手術分離等方法。間質血管碎片(SVF)SVF是幹細胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細胞混合物形成的細胞團就叫做間質血管碎片。間質血管碎片中含有豐富的間充質細胞，可分化為多種譜系的細胞，是再生醫學、組織工程等最理想的種子細胞，本領域的技術人員能夠使用通用的方法進行SVF的純化，在一個優選的實施例中，分離SVF可以包括以下步驟(但不限於)將吸脂後的脂肪用PBS反覆衝洗兩次，然後在37°C條件下用膠原酶消化30min，用含10%胎牛血清的DMEM終止消化，1200g離心IOmin後即獲得高密度的SVF碎片，其中主要包括間質細胞、血管內皮細胞和壁細胞。另外，SVF中也包括一些血管來源的細胞，如白細胞和紅細胞等，各種細胞之間具有協同效應。脂肪幹細胞如本文所用，術語「脂肪幹細胞」、「本發明脂肪幹細胞」、或「本發明的幹細胞」可以互換使用，都是指分離自脂肪組織的幹細胞。脂肪幹細胞(ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的幹細胞。ADSCs能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，它取材容易、體內儲備量大、適宜大規模培養、對機體損傷小、來源廣泛、適宜自體移植。在本發明中，脂肪組織或脂肪的原料沒有特別限制，可以是來源於動物或人的任何部位的脂肪組織，優選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。幹細胞抗原檢測脂肪幹細胞群具有多種特異性抗原和受體，主要有D29、⑶73、⑶49d、⑶90、⑶14、 CD45、CD34、CD3、CD13、CD59、CD105 等。⑶34抗原是一種高度糖基化的I型跨膜蛋白，它選擇性的表達於人類造血幹細胞 (HSC)，祖細胞(PC)和血管內皮細胞(EC)表面，是脂肪幹細胞的陰性指標，帶有CD34的脂肪幹細胞在總幹細胞的比例優選為< 5%，更佳地，<3%。⑶45存在於所有造血細胞的表面，包括造血幹細胞和破骨細胞，是脂肪幹細胞的陰性指標，帶有⑶45的脂肪幹細胞在總幹細胞的比例優選為 95%，更佳地> 97%，最佳地彡 99%。帶有⑶73的脂肪幹細胞在總幹細胞的比例優選為> 80%，更佳地> 85%，最佳地彡 88%。帶有⑶90的脂肪幹細胞在總幹細胞的比例優選為> 75%，更佳地> 78%，最佳地彡 80%。
帶有⑶49d的脂肪幹細胞在總幹細胞的比例優選為彡90%，更佳地彡95%，最佳地彡99%。本領域內技術人員可以使用通用的方法檢測脂肪幹細胞的純度和分化程度，如流式細胞儀法。檢測時，加入不同的與有針對性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈； 遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細胞表面的抗原結合一定時間，用流式細胞儀對細胞進行自動分析和分選。成脂誘導及檢測由於脂肪幹細胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪幹細胞進行分化誘導，能夠得到特定功能的已分化的細胞。本領域內技術人員可以使用通用的方法對脂肪幹細胞進行成脂誘導。一種優選的誘導方法是向培養液中加入地塞米松。含地塞米松的誘導劑主要有3種，1.地塞米松加1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)，2.地塞米松加胰島素，3.地塞米松加茚甲新 (indomethacin,消炎痛)、1_甲基_3_異丁基黃嘌呤及胰島素。低濃度的地塞米松是無血清或低血清培養間充質幹細胞的必需成分之一，能夠促進間充質幹細胞的體外快速增殖； 較高濃度的地塞米松則可以誘導間充質幹細胞向脂肪細胞分化。本領域內技術人員可以使用通用的方法和染料(如Oil Red、蘇丹紅5B和溶劑紅 27等)對脂肪幹細胞誘導成脂進行檢測。一種優選的染料是Oil Red(O)，即油紅0。油紅 0的結構為1-[2，5_ 二甲基-4-(2，5-二甲基苯偶氮)苯偶氮]-2萘酚，是一種紅色粉末，油溶性偶氮染料，易溶於苯、乙醇和丙酮。成脂肪誘導的過程中，細胞在胞漿中不斷有油滴的累積，並不斷的增加變大，最後整個細胞的胞漿中都是油滴。油紅0作為生物染色劑，易與油脂結合，但與細胞本身的結構著色力差。在顯微鏡下可以清楚地進行成脂染色觀察。成骨誘導及檢測由於脂肪幹細胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪幹細胞進行成骨分化誘導，能夠得到成骨細胞。本領域內技術人員可以使用通用的方法對脂肪幹細胞進行成骨誘導。一種優選的化學成骨誘導液配方為DMEM培養液，甘油磷酸鈉，維生素C和地塞米松。成骨誘導的過程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉澱下來，即「鈣結節」。一種優選的鑑定鈣結節的染料未「茜素紅」。茜素紅染色液一般包括以下組分 茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2- 二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2- 二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。茜素紅為橙黃色或黃棕色粉末，易溶於水，微溶於乙醇，不溶於苯和氯仿能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應。茜素紅染色的原理就是茜素紅和鈣發生顯色反應，產生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導的細胞外面沉積的鈣結節也就被染成了深紅色。維生素D (Vitamin D，VD)維生素D(Vitamin D，VD)為固醇類衍生物，脂溶性，由於具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素，VD能夠維持血清鈣磷濃度的穩定。在本發明中，當Ra彡5%時，則該指標有效，其中，
Ra= (Ral-RaO) ^-RaO X 100%,式中，Ral為個體回輸後血清中的維生素D濃度，RaO為回輸結束前的維生素D濃度。本發明人發現，維生素D水平的提高，有助於提高個體的健康水平。當個體回輸自體脂肪幹細胞後，其血液中的維生素D的含量有大幅上升，其原因可能是脂肪幹細胞可以分化為骨細胞，刺激並誘導甲狀旁腺素分泌的分泌，導致血清中的維生素D濃度上升。脂蛋白(Lipoprotein)脂蛋白是一種與脂質複合的水溶性蛋白質。通常根據其密度分為極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極高密度脂蛋白和乳糜微粒。每一種脂蛋白中均含有相應的載脂蛋白。高密度脂蛋白(HDL)可將蓄積於末梢組織的游離膽固醇與血液循環中脂蛋白或與某些大分子結合而運送到各組織細胞，主要是肝臟。實際上是膽固醇逆轉(RCR)，RCT促進組織細胞內膽固醇的清除，維持細胞內膽固醇量的相對衡定，從而限制動脈粥樣硬化的發生發展，起到抗動脈粥樣硬化作用。LCAT通過轉酯化反應完成新生盤狀HDL向HDL3、HDL2 的轉化，減少血漿HDL中游離膽固醇的濃度，構成膽固醇從細胞膜流向血漿脂蛋白的濃度梯度，降低組織膽固醇的沉積。低密度脂蛋白(LDL)是富含膽固醇的脂蛋白，主要作用是將膽固醇運送到外周血液，是動脈粥樣硬化的危險因素之一，被認為是致動脈粥樣硬化的因子。在本發明中，當Rb彡5%時，則該指標有效，其中，Rb= (Rbl-RbO) ^-RbO X 100%,式中，Rbl為個體回輸後血清中的高密度脂蛋白濃度，RbO為回輸結束前的高密度脂蛋白濃度。當Rc彡5%時，則該指標有效，其中，Rc = (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO為回輸結束前的低密度脂蛋白濃度，Rcl為個體回輸後血清中的低密度脂蛋白濃度。本發明人發現，自體回輸脂肪幹細胞，有助於提高血清中高密度脂蛋白的濃度，降低低密度脂蛋白濃度，從而提高個體的健康水平。促甲狀腺激素(Thyrotropin, thyroid stimulating hormone)促甲狀腺激素是腺垂體分泌的促進甲狀腺的生長和機能的激素。人類的TSH為一種糖蛋白，含211個胺基酸，糖類約佔整個分子的15%。整個分子由兩條肽鏈-α鏈和β 鏈組成。TSH全面促進甲狀腺的機能，稍早出現的是促進甲狀腺激素的釋放，稍晚出的為促進Τ4、Τ3的合成，包括加強碘泵活性，增強過氧化物酶活性，促進甲狀腺球蛋白合成及酪氨酸碘化等各個環節。TSH促進甲狀腺上皮細胞的代謝及胞內核酸和蛋白質合成，使細胞呈高柱狀增生，從而使腺體增大。在本發明中，當Rd彡5%時，則該指標有效，其中，Rd = (Rdl-RdO)+RdOX 100%，式中，Rdl為個體回輸後血清中促甲狀腺激素的濃度，RdO為回輸結束前促甲狀腺激素的濃度。TSH和甲狀腺的產生和功能之間是一個反比關係，高的促甲狀腺激素，標誌著低甲狀腺的生成和功能。本發明人發現，自體脂肪幹細胞回輸治療後，TSH的水平在1個月和3 個月期間內顯著下降，表明甲狀腺激素的產生和功能有顯著改善，自體脂肪幹細胞的回輸緩解了年齡相關疾病。睪酮(Testosterone)睪酮是由雄性睪丸或雌性卵巢分泌的一種類固醇激素。是人體內主要的雄激素， 包括增強性慾、力量、免疫功能等功效。睪酮作為一種激素原，還能夠在芳香化酶的作用下可轉變為17 β-雌二醇。在本發明中，當個體為男性，且Re ^ 5%時，則該指標有效，其中，Re = (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel為個體回輸後血清中的睪酮濃度，ReO為回輸結束前的睪酮濃度。本發明人發現，自體脂肪幹細胞可以有助於提高個體的睪酮濃度，原因可能是脂肪幹細胞分化為骨細胞，刺激破骨細胞和成骨細胞的分化，誘導骨骼與睪酮間關聯的形成， 導致血清中的睪酮濃度上升。雌二醇Estradiol)雌二醇是一種留體雌激素。女性雌二醇是主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進和調節女性性器官及副性徵的正常發育。其主要作用為①促使子宮內膜增生；②增強子宮平滑肌的收縮；③促使乳腺導管發育增生；；④抗雄激素作用；⑤降低血中膽固醇，增加鈣在骨中的沉著。在本發明中，當個體為女性時，且Rf > 5%時，則該指標有效，其中，Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl為個體回輸後血清中雌二醇濃度，RfO為回輸結束前雌二醇濃度。本發明人發現，自體脂肪幹細胞可以有助於提高個體的雌二醇濃度，達到抗衰老的效果。隨著年齡的衰老，雌二醇呈下降趨勢，而LH作為雌二醇的負反饋是上升的，如果雌二醇升高，可使LH下降，達到抗衰老目的.本發明的主要優點包括(1)安全抽取血清對少量指標進行檢測，無副作用；(2)便捷在一個小時內就可以作出脂肪幹細胞抗衰老的效果的評價；(3)準確維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、雌二醇、睪酮等可以作為評價脂肪幹細胞抗衰老的重要指標，血清檢測學方法成熟可靠。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例1基質血管組分(SVF)的獲得1.獲得脂肪組織
用75%的酒精擦拭裝脂肪組織的容器外壁，無菌針管從人體吸取脂肪組織，Ih內將其移至接收容器內。2.分裝脂肪組織每一個培養瓶分裝脂肪組織為50ml，用IOml移液管在脂肪採集瓶吸取下層紅色液體，棄掉，剩餘的上層脂肪混勻後進行分裝。3.洗滌脂肪組織除去血細胞向培養瓶中加入IOOml氯化鈉注射液，擰緊蓋子，劇烈晃動3分鐘以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3-5分鐘，使不同相分離，吸去下層水相；重複以上操作三次，直到下層液較為清澈。4.膠原酶I消化加入等量新配製的預熱(提前半小時於37°C的氣浴搖床預熱)的膠原酶I溶液， 封口膜封口，劇烈晃動培養瓶5-10秒，置于振動氣浴鍋中，370C，70rpm,消化60分鐘，每隔 15分鐘劇烈晃動培養瓶5-10秒，直到看起來較為平滑。5.分離基質血管組分(SVF)將消化後的組織用無菌40目濾網分裝到50ml的離心管中，室溫400g離心10分鐘，得到的沉澱即為SVF。6.淨化沉澱離心後，SVF沉積於離心管底部，用移液管自上而下小心除去上層油脂和下層的膠原酶溶液。需要在SVF沉澱上方留下少量的溶液，以免擾動沉澱細胞。用適量的生理鹽水重懸細胞，吹散，在室溫下400g離心10分鐘。IOml培養基懸浮細胞，然後將細胞匯總到50ml 離心管中，過100目篩，再次室溫300g離心10分鐘，得到經淨化的SVF沉澱。實施例2脂肪幹細胞種植和培養1.細胞種植離心後的SVF加20ml培養基，並充分混勻，根據培養瓶的面積，用基於組織塊法進行細胞種植，按照每平方釐米接種0. 16ml抽脂得到的脂肪量進行接種，每IOOml脂肪組織， 最終可以接種8個T75培養瓶。2.原代細胞培養將平置的培養瓶放置於二氧化碳恆溫恆溼培養箱進行培養，培養條件為 37士0.5°C，二氧化碳體積分數為5士0.2%。原代培養第M小時，進行全量換液。此後每隔3天全量換液，放置二氧化碳恆溫恆溼培養箱進行培養。3.原代細胞收穫7天左右，原代培養的細胞克隆團的面積百分比到達70% _80%，消化收穫。在培養瓶中加入消化酶(消化酶為0. 125% Trypsin-O. 01% EDTA溶液，使用前室溫放置 15min,每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化時間為1. 5min,加入培養基^iil，反覆吹打瓶底至細胞大部分脫落，移入50ml離心管中，原培養瓶中加入5ml氯化鈉注射液，並衝洗瓶壁， 將洗液加入離心管中定容至50ml，移液管吹打懸浮，100 μ m無菌濾網過濾，將過濾液收集到50ml離心管中，lOOOrpm，IOmin離心。4.原代細胞傳代
觀察單個離心管內餘下細胞沉澱量，適當合併數個離心管中細胞沉澱至1個離心管中，加入適量培養基，輕輕吹打重懸浮細胞，定容至30ml，吹打混勻，取樣計數。計數後 lOOOrpm，IOmin二次離心。去除上清液，在離心管中加入適量培養基，輕輕吹打重懸浮細胞， 定容後接種至新的培養容器中，傳代的細胞密度為5000-6000個/cm2，即(3. 75-4. 5) X IO5 個細胞/T75，按照4. 5 X IO5個細胞/T75進行傳代，並置於二氧化碳恆溫恆溼培養箱開始培養。培養條件37 士 0. 5 °C，二氧化碳體積分數為5 士 0. 2 %，培養至細胞融合達85% -90%。經上述方法分離的細胞得率為5X IO5-I X IO6個/ml脂肪。培養第7天，Pl代細胞擴增的倍數可以達到1-2倍，培養第14天，P2代細胞擴增的倍數可以達到4-6倍，培養第21天，P3代細胞擴增的倍數可以達到10倍。實施例3抗原標記檢測分別將SVF和培養後的脂肪幹細胞收集到離心管中，細胞懸液調整密度為 1 X KfmL-1，800rpm(120g)，離心5min，棄上清，用4°C的冷D-Hanks衝洗重懸細胞，再次將細胞懸液以800rpm，離心5min，之後棄去上清。然後用D-Hanks將細胞重懸至lmL，加入抗體 5 μ 1，避光，冰上放置30min。用D-Hanks衝洗，離心，棄上清，重複該衝洗過程2次，確保將未結合抗體除淨最後，加入約200 μ 1的D-Hanks製成懸液，用流式細胞儀檢測。加入的抗體分別為人抗CD29、CD73、CD49d、CD90、CD14、CD34、CD45、CD34、Actin 和HLA-DR。抗原檢測結果見表1。表1
原細胞CD29CD73CD49dCD90CD14CD45CD34ActinHLA-DRSVF36%68. 7%93. 8%69%4. 5%10. 5%77. 8%2. 2%41%培養後的幹細胞99. 1%98. 5%99%97. 6%1. 7%0%2. 9%2. 3%1. 3%表明通過流式細胞儀對脂肪幹細胞進行細胞表面抗原標記表達的分析，新鮮分離的SVF中混合細胞較多(見圖1)，其中含有10. 5%的⑶45 ( —種典型的造血幹細胞表面抗原)，77.8%的(一種已知位於白細胞表面的典型抗原)。而經過培養的脂肪幹細胞(見圖2)純度非常高，基本上都是脂肪間充質幹細胞，例如99. 具有CD^表面抗原(公認的脂肪幹細胞特異性抗原)，98. 5%具有CD73 (公認的脂肪幹細胞特異性抗原)，而具有CD14， ⑶4，⑶34抗原的細胞極少。實施例4脂肪幹細胞的成脂誘導1.將培養的幹細胞以1.5X IO5每孔的密度接種在六孔板中，進行成脂誘導實驗。 具體方法是向基礎培養基(DMEM+10%胎牛血清)中加入終濃度分別為lymol/L地塞米松、10 μ mol/L胰島素、200 μ mol/L吲哚美辛和0. 5mmol/L的異丁基甲基黃嘌呤，配製成脂誘導培養基，以正常培養基培養的樣本為成脂分化實驗陰性對照組。每周換2次液，直到進行成脂染色觀察為止，以上組均做平行實驗(n = 3)。2.油紅0染色先小心輕緩倒去培養液，用D-hanks輕緩漂洗，加10 %中性甲醛固定細胞膜 30min。加入0.5%油紅0(六孔板加1.5ml)，染色Ih左右。3.脫色，75%酒精/60%異丙醇漂洗，除去多餘的染料。4.復染，淡蘇木染色lmin，PBS漂洗。5.甘油明膠封片，顯微鏡觀察每組樣本隨機選取5-10個視野進行拍照觀察以考察共培養方法的成脂誘導分化效果。脂肪呈鮮紅色，細胞核呈藍色，間質無色。6.結果圖3顯示了分離和培養的脂肪幹細胞具有分化為脂肪細胞的能力。圖3A顯示在成脂誘導劑作用下，脂肪幹細胞能夠生成脂質。圖;3B為成脂實驗的陰性對照，表明在沒有成脂誘導劑的作用下，脂肪幹細胞不能夠自發生成脂質(大量密集在一起的小脂滴)。實施例5脂肪的幹細胞成骨誘導1.成骨細胞分化胰酶消化培養的脂肪細胞後，以IX 105ml密度接種傳代，基礎培養基培養Id後更換誘導培養基DMEM/10 % FBS, 0. 1 μ mo/L地塞米松，50 μ mo/L維生素C，IOmmol/β -甘油磷酸鈉，100U/ml青黴素，100U/ml鏈黴素；每3d更換培養基，誘導培養2周。2.茜素紅染色細胞以PBS洗滌2次，4%甲醛固定，1 %茜素紅染色IOmin，衝洗，乾燥，封片。3.觀察每組樣本隨機選取5-10個視野進行拍照觀察以考察成骨誘導分化效果。利用沉積的鈣於茜素紅可以發生顯色反應，誘導成骨的細胞經茜素紅染色，可見細胞漿中有大量紅色的鈣化基質沉積。4.結果圖4顯示了分離和培養的脂肪幹細胞具有分化為骨的能力.圖4A顯示脂肪幹細胞在成骨誘導劑作用下，經茜素紅染色，可見細胞漿中有大量紅色的鈣化基質沉積。圖4B顯示成骨實驗的陰性對照，在沒有成骨誘導劑的作用下，脂肪幹細胞不能夠自發成骨。實施例6脂肪幹細胞抗衰老評價1.將經培養和鑑定的脂肪幹細胞細胞注入30ml生理鹽水，製備成細胞懸液，以備回輸使用。2.三次靜脈回輸脂肪幹細胞分離當天，進行第一次回輸，幹細胞回輸總量為2X107個； 脂肪幹細胞培養至第30天，進行第二次回輸，幹細胞回輸總量為2 X IO7個；
脂肪幹細胞培養至第90天，進行第三次回輸，幹細胞回輸總量為2X107個。4.回輸前以及回輸後的第一個月，第三個月分別用常規方法或市售檢測試劑盒進行血清學檢測。其中部分數據結果見表2。表 權利要求
1.一種脂肪幹細胞抗衰老的評價體系，其特徵在於，對回輸了脂肪幹細胞的個體，在回輸結束一段時間後進行血清學檢測，所述的血清學檢測包括檢測選自下組的一個或多個指標維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮、雌二醇；(a)當Ra彡5%時，則該指標有效，其中， Ra= (Ral-RaO)+RaO X 100%，式中，Ral為個體回輸後血清中的維生素D濃度，RaO為回輸結束前的維生素D濃度；(b)當Rb彡5%時，則該指標有效，其中， Rb= (Rbl-RbO)+RbO X 100%，式中，Rbl為個體回輸後血清中的高密度脂蛋白濃度，RbO為回輸結束前的高密度脂蛋白濃度；(c)當Rc時，則該指標有效，其中， Rc= (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO為回輸結束前的低密度脂蛋白濃度，Rcl為個體回輸後血清中的低密度脂蛋白濃度；(d)噹噹Rd彡5%時，則該指標有效，其中， Rd= (Rdl-RdO)+RdOX 100%，式中，Rdl為個體回輸後血清中促甲狀腺激素的濃度，RdO為回輸結束前促甲狀腺激素的濃度；(e)當個體是男性時，且當Re> 5%時，則該指標有效，其中， Re= (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel為個體回輸後血清中的睪酮的濃度，ReO為回輸結束前的睪酮的濃度；(f)當個體是女性時，且當Rf彡5%時，則該指標有效，其中， Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl為個體回輸後血清中的雌二醇的濃度，RfO為回輸結束前的雌二醇的濃度； 並且，當所述指標中至少一個指標為有效時，則表示所述脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。
2.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，所述的回輸結束前，包括回輸開始之前、回輸過程中以及回輸結束時。
3.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，所述的一段時間為>1個月。
4.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，所述的回輸的脂肪幹細胞為培養0-90 天的脂肪幹細胞。
5.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，當Ra> 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。
6.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，當Rb> 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。
7.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，當Rc> 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。
8.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，當Rd> 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述個體中產生抗衰老效果。
9.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，當Re> 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述男性個體中產生抗衰老效果。
10.如權利要求1所述的評價體系，其特徵在於，當Rf> 10%時，提示回輸的脂肪幹細胞在所述女性個體中產生抗衰老效果。
全文摘要
本發明提供了一種自體脂肪幹細胞抗衰老效果的評價體系，包括對回輸了脂肪幹細胞的個體，在回輸結束一段時間後進行血清學檢測，其中血清學檢測包括選自下組的一個或多個指標維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮、雌二醇。用本發明的評價體系能夠客觀地對脂肪幹細胞的抗衰老的效果進行評價，並且具有準確、快速、經濟的優點。
文檔編號G01N33/96GK102486475SQ20111030161
公開日2012年6月6日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者呂偉麟, 張麗, 張炳強, 張露億, 曹衛 申請人:臻景生物技術(上海)有限公司, 臻景生物技術(無錫)有限公司