一種殺蟲晶體蛋白BT-Cry1C膠體金免疫層析速測卡的製作方法

2023-11-02 03:41:37

專利名稱：一種殺蟲晶體蛋白BT-Cry1C膠體金免疫層析速測卡的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於生物工程領域，具體涉及一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡。
技術背景蘇雲金桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一種廣泛存在於土壤中的革蘭氏陽性菌，在芽孢形成時產生的具有高度特異性殺蟲活性的晶體蛋白，稱為殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal protein, ICPs)。ICP常以原毒素形式存在，當昆蟲取食ICP後,在昆蟲消化道內，在中腸消化酶的作用下，原毒素被活化即降解成具有毒性的多肽，活化的毒素分子與昆蟲中腸上皮細胞上的特異受體結合，致使細胞膜產生一些穿孔，破壞細胞的滲透平衡，引起細胞腫脹裂解，使昆蟲幼蟲停止取食，最終導致死亡。目前，Bt殺蟲蛋白基因已成為植物基因工程及轉基因育種應用中最廣泛、最具有潛力和應用前景的抗蟲基因。其中，Cry殺蟲蛋白對鱗翅目等多種害蟲具有毒殺作用，因此被廣泛用於轉基因植物。例如，CrylC基因被應用於抗蟲水稻等轉基因作物。轉基因作物的飛速發展在帶來巨大經濟利益的同時，人們也越來越關注轉基因作物可能帶來的不可預期的食用安全及環境安全性問題，越來越多的國家要求對轉基因產品進行檢測以實行標識制度。免疫膠體金技術(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標誌物應用於抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、檸檬酸鈉等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，並由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱鹼環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由於這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金標記技術是免疫層析快速診斷的核心技術，它以膠體金作為示蹤標記物應用於抗原抗體反應，其實質是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用於免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。目前，將現有的免疫膠體金技術應用到檢測轉基因產品的外源蛋白中，仍然存在許多問題，例如，特異性差，靈敏度不高，成本高，因此，本領域技術人員亟需對現有免疫膠體金技術進行改進，研製特異性強，靈敏度高、穩定性好、重複性好的檢測轉基因產品中外源蛋白的新方法。
發明內容本實用新型的目的是設計一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，該速測卡特異性強，靈敏度高，並且，操作簡便、快速、準確，適用於轉基因產品中BT-CrylC蛋白的現場快速檢測以及安全性評價。為達到上述目的，本實用新型的技術方案如下一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其包括卡殼和卡殼內的試紙條，其中，所述試紙條包括底板、粘著在底板上依次相連的樣品墊、金標墊、反應膜和吸水墊。進一步，所述卡殼上設有加樣孔和觀察窗。所述加樣孔設於對應所述樣品墊上方殼體，所述觀察窗設於對應所述反應膜上方殼體。所述樣品墊、金標墊、反應膜和吸水墊之間設有l_2mm的重疊區。又,所述金標墊包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體-膠體金結合物。所述反應膜上設有包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體的檢測線和包被羊抗兔IgG的質控線；所述檢測線和所述質控線間隔0. 5-1. Ocm0所述底板為PVC(聚氯乙烯)板，所述反應膜為硝酸纖維素膜。所述樣品墊由玻璃纖維膜或濾紙製成，所述吸水墊由濾紙製成。本實用新型膠體金免疫層析速測卡的使用(I)待測樣品前處理若待測樣品為水和植物組織提取液等液體物質時，可直接取50iU樣品檢測。若待檢樣品為植物葉片、莖幹、種子等樣品時，則需要將樣品進行預處理，即將樣品磨碎，加入樣品處理液(5mM PBS pH 7.4)搖勻，靜置後取上清50 檢測。(2)檢測將所取樣品滴入加樣孔內，室溫下作用5-10min，然後觀察結果。(3)檢測結果分析陽性質控線、檢測線均呈現紅色條帶，說明樣本中有CrylC蛋白存在。陰性檢測線不出現紅色條帶，質控線呈現紅色條帶，說明樣本中沒有CrylC蛋白存在。失效如果檢測線、質控線均不出現紅色條帶或僅有檢測線出現紅色條帶，說明試紙條失效。本實用新型的有益效果I.本實用新型特異性強，靈敏度高。2.操作方法簡便快速，檢測時間短。本實用新型不需要使用其他特殊儀器、設備，只要將待測樣品滴入加樣孔內，加樣後10分鐘內即可從觀察窗觀察到結果，檢測方法簡便，適合現場快速檢測。3.本實用新型使用抗CrylC的多克隆抗體，成本低，並且穩定性和重複性好，可以用於檢測不同樣品，應用範圍廣。

圖I為本實用新型一實施例試紙條的結構示意圖；圖2為本實用新型一實施例試紙條的側面結構示意圖；圖3為本實用新型一實施例卡殼的結構示意圖；圖4為本實用新型一實施例的檢測結果呈陽性示意圖；圖5為本實用新型一實施例的檢測結果呈陰性示意圖；圖6為本實用新型一實施例的檢測結果失效示意圖之一；圖7為本實用新型一實施例的檢測結果失效示意圖之二。
具體實施方式
[0032]以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。參見圖I-圖7，本實用新型的一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其包括卡殼I和卡殼內的試紙條2，其中，所述試紙條2包括底板3、粘著在底板3上依次相連的樣品墊4、金標墊5、反應膜6和吸水墊7。進一步，所述卡殼I上設有加樣孔8和觀察窗9，所述加樣孔8設於對應所述樣品墊4上方殼體,所述觀察窗9設於對應所述反應膜6上方殼體。所述依次相連的樣品墊4、金標墊5、反應膜6和吸水墊7之間設有l_2mm的重疊區。又,所述金標墊5包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體_膠體金結合物。所述反應膜6上設有包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體的檢測線61和包被羊抗兔IgG的質控線62,所述檢測線61和所述質控線62間隔0. 5cm。所述底板3為PVC板，所述反應膜6為硝酸纖維素膜。所述樣品墊4由玻璃纖維膜或濾紙製成，所述吸水墊7由濾紙製成。本實施例膠體金免疫層析速測卡的使用(I)待測樣品前處理若待測樣品為水和植物組織提取液等液體物質時，可直接取50iU樣品檢測。若待檢樣品為植物葉片、莖幹、種子等樣品時，則需要將樣品進行預處理，即將樣品磨碎，加入樣品處理液(5mM PBS pH 7. 4)搖勻，靜置後取上清50 檢測。(2)檢測將所取樣品滴入加樣孔8內，室溫下作用5-10min，然後從觀察窗9觀察結果。(3)檢測結果分析陽性檢測線61、質控線62均呈現紅色條帶，說明樣本中有CrylC蛋白存在，如圖4所示。陰性檢測線61不出現紅色條帶，質控線62呈現紅色條帶，說明樣本中沒有CrylC蛋白存在，如圖5所示。失效如果僅有檢測線61出現紅色條帶或檢測線61、質控線62均不出現紅色條帶，說明試紙條失效，如圖6、圖7所示。
權利要求1.一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，包括卡殼和卡殼內的試紙條，其特徵在於，所述試紙條包括底板、粘著在底板上依次相連的樣品墊、金標墊、反應膜和吸水墊。
2.根據權利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其特徵在於，所述卡殼上設有加樣孔和觀察窗；所述加樣孔設於對應所述樣品墊上方殼體，所述觀察窗設於對應所述反應膜上方殼體。
3.根據權利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其特徵在於，所述樣品墊、金標墊、反應膜和吸水墊之間設有l_2mm的重疊區。
4.根據權利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其特徵在於，所述金標墊包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體-膠體金結合物。
5.根據權利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其特徵在於，所述反應膜上設有包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體的檢測線和包被羊抗兔IgG的質控線。
6.根據權利要求5所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其特徵在於，所述檢測線和所述質控線間隔O. 5-1. Ocm0
7.根據權利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其特徵在於，所述底板為PVC板，所述反應膜為硝酸纖維素膜。
8.根據權利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測卡，其特徵在於，所述樣品墊由玻璃纖維膜或濾紙製成，所述吸水墊由濾紙製成。
專利摘要一種殺蟲晶體蛋白BT-Cry1C膠體金免疫層析速測卡，包括卡殼和卡殼內的試紙條，所述試紙條包括底板、粘著在底板上依次相連的樣品墊、金標墊、反應膜和吸水墊；所述卡殼上開有加樣孔和觀察窗；所述加樣孔設於對應所述樣品墊上方殼體，所述觀察窗設於對應所述反應膜上方殼體，本實用新型的膠體金免疫層析速測卡特異性強，靈敏度高，並且操作簡便、快速、準確，適用於轉基因產品中BT-Cry1C蛋白的現場快速檢測以及安全性評價。
文檔編號G01N33/558GK202583212SQ201220149539
公開日2012年12月5日 申請日期2012年4月11日 優先權日2012年4月11日
發明者唐雪明, 趙凱, 楊奇, 吳瀟, 王金斌, 何建華, 蔣瑋, 陳建中, 陳大超 申請人:上海市農業科學院