鈍頂螺旋藻cpd光修復酶及其應用的製作方法

2023-12-03 06:43:31 4

鈍頂螺旋藻cpd光修復酶及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鈍頂螺旋藻CPD光修復酶及其應用。該CPD光修復酶具有SEQIDNO:2所示的多肽序列，或在SEQIDNO:2所示胺基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加1～10個胺基酸殘基所形成的具有CPD光修復酶活性的多肽序列。而用以編碼所述鈍頂螺旋藻CPD光修復酶的多聚核苷酸可具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，或者與SEQIDNO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能夠編碼光修復酶活性蛋白的核苷酸序列。本發明優化並首次人工合成了適於原核表達的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶基因，並成功將其克隆到表達載體中，獲得大量鈍頂螺旋藻CPD光修復酶，當將該CPD光修復酶應用到化妝品、生物醫藥等相關領域時，能夠主動修復由紫外線引起的皮膚病症，產生巨大社會效益和經濟價值，意義重大。
【專利說明】鈍頂螺旋藻CPD光修復酶及其應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明具體涉及鈍頂螺旋藻platens is")中CPD光修復酶、其優化後的編碼基因，以及鈍頂螺旋藻CPD光修復酶的DNA損傷修復活性，涉及生物學領域。
[0003]
【背景技術】
[0004]對每一種生物而言，基因組的準確和完整都是保證其自身存活及機體功能正常執行的重要基礎。源於生物體內部及外界環境的基因毒性物質侵害、DNA複製過程中發生的各類錯誤以及DNA自身固有生化性質導致的不穩定，每個細胞每天大約需要承受50，000到500，000次的DNA分子損傷。
[0005]紫外線是最主要的環境DNA損傷劑，儘管臭氧層吸收了太陽紫外線中最危險的部分(紫外線C)，但強烈陽光中剩餘的紫外線A和紫外線B仍能在一小時內對被照射細胞產生約十萬次的DNA損傷。生物體中DNA的四種鹼基在近紫外波段(紫外線B)有強吸收，進而誘發DNA同一條鏈內相鄰的胸腺嘧啶鹼基產生嘧啶二聚體光化學產物，其中最主要(約90%)的光產物是環丁燒嘧唳二聚體(Cyclobutane Pyrimidine Dimer, CPD)，還包括(6-4)光產物(6-4 PhotoProduct, 6-4 PP)等其他光產物破壞DNA結構，引發基因突變和基因組畸變，最終導致細胞死亡或者癌變。對人體的皮膚細胞而言，受紫外線損傷的DNA如果不能夠被及時和正確的修復，將造成皮膚炎症及黑色素沉積，甚至引發皮膚癌和黑瘤病。
[0006]在病毒、細菌、真菌、昆蟲、植物、無脊椎動物及部分脊椎動物細胞內存在一類DNA光修復酶，可在30(T600nm波長的光照射下將原本受紫外線照射而在DNA中形成的嘧啶二聚體分解成原來的非聚合狀態，使DNA恢復正常。由於人體內缺乏該類DNA光修復酶,皮膚細胞中只能採用效率較低的核苷酸切除修復(nucleotide excision repair, NER)方式消除6-4 PP，而環丁烷嘧啶二聚體(PD則會被積累下來並導致一系列的負面效應的發生，如皮膚炎症、免疫抑制、皮膚腫瘤，甚至皮膚癌。現有研究結果表明(PD光修復酶可以主動修復皮膚細胞因紫外線照射而產生的基因損傷，抑制由此引起的紅斑、皮膚炎症等發生；抑制DNA損傷引起的代謝免疫功能異常，有效抵制細菌、寄生蟲的侵蝕，延緩衰老，增強皮膚新陳代謝而使細胞保持活力；並且還能預防紫外線損傷引起的皮膚癌。
[0007]鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis),是絲狀不形成異型胞的藍藻,原產於非洲查德Aranguadi湖，國內主要分布在海南、廣東、雲南等地。鈍頂螺旋藻是世界上廣泛推行的優良螺旋藻品種，由於其具有營養成分高且易於吸收的特點，已被人類廣泛採集食用了幾百年。作為安全的食用藻類，每個鈍頂螺旋藻中僅含有10-20個(PD光修復酶分子，這使得直接進行天然鈍頂螺旋藻(PD光修復酶的分離純化和體外應用極為困難。因此有必要對長期生存於強紫外線輻射條 件下的鈍頂螺旋藻進行深入研究，利用基因工程手段克隆重組其CPD光修復酶，實現過量表達和純化。[0008]

【發明內容】

[0009]鑑於現有技術的不足，本發明的目的之一在於提供一種鈍頂螺旋藻CPD光修復酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的多肽序列，或在SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加所形成的具有CPD光修復酶活性的多肽序列。
[0010]作為可行的實施方案之一，所述鈍頂螺旋藻CPD光修復酶具有在SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列中取代和/或缺失和/或添加I~10個胺基酸殘基所形成的多肽序列。
[0011]本發明的目的之二在於提供一種編碼所述鈍頂螺旋藻CPD光修復酶的多聚核苷酸。
[0012]進一步的,所述多聚核苷酸具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者與SEQ IDNO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能夠編碼光修復酶活性蛋白的核苷酸序列。
[0013]本發明的目的之三在於提供一種導入了前述多聚核苷酸的原核或真核表達載體。
[0014]進一步的，所述表達載體中還導入了選擇性標記基因，其可包括但不限於:可在表達菌株中產生顏色變化的酶的基因、或發光化合物的基因、或具有抗生素標記物的基因、或具有營養缺陷抗性的基因。
[0015]本發明的目的之四在於提供包含前述多核苷酸或前述表達載體的宿主細胞。
[0016]本發明的目的之 五在於提供鈍頂螺旋藻CPD光修復酶在製備防曬產品中的應用。
[0017]與現有技術相比，本發明至少具有如下有益效果:優化並首次人工合成了適於原核表達的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶基因，並成功將其克隆到表達載體中，獲得大量鈍頂螺旋藻CPD光修復酶，當將該CPD光修復酶應用到化妝品等相關領域時，能夠主動修復由紫外線引起的皮膚細胞DNA損傷，產生巨大社會效益和經濟價值，意義重大。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是鈍頂螺旋藻CPD光修復酶重組表達鑑定及純化結果鑑定SDS-PAGE電泳圖； 圖2是鈍頂螺旋藻CPD光修復酶紫外及可見光吸收光譜掃描結果；
圖3是鈍頂螺旋藻CPD光修復酶酶催化動力學參數擬合曲線。
【具體實施方式】
[0020]本發明旨在通過優化得到適於原核表達的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶編碼基因，然後將其優化後的編碼基因克隆到表達載體中，得到其編碼產物，驗證其CPD光修復酶活性，並將編碼產物合理應用到化妝品、生物醫藥等相關領域，從而消除上述現有技術的缺陷。
[0021]而相應的，本發明的技術方案包括:
1.提供了一種鈍頂螺旋藻(PD光修復酶，如(a)或(b)所述的蛋白質:
(a)其如SEQID NO:2所示的胺基酸序列；
(b)將(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一至十個胺基酸殘基且具有(PD光修復酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
[0022](b)所述的蛋白質，例如在SEQ ID NO:2所示胺基酸序列的N端添加His His HisHis His His六個胺基酸、或在SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的N端添加His His His HisHis His His His八個胺基酸等，以上修飾均不改變蛋白活性，且由(a)衍生，均屬於本發明的保護範圍。
[0023]2.提供了鈍頂螺旋藻CPD光修復酶經過密碼子優化後的編碼基因。
[0024]鈍頂螺旋藻CPD光修復酶優化後的編碼基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。或者，與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且編碼光修復酶活性蛋白的核苷酸序列，能夠編碼(b)所述蛋白質的核苷酸序列。例如，將鈍頂螺旋藻CPD光修復酶胺基酸序列中天冬醯胺(Asn)的對應編碼基因由最優密碼子AAC替換為AAT;將鈍頂螺旋藻(PD光修復酶胺基酸序列中脯氨酸(Ρro)的對應編碼基因由最優密碼子CCG替換為CCT、CCC或者CCA ;或針對將SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列中的胺基酸N端添加六個胺基酸，SEQ ID NO:1所示的核苷酸3』端添加18個核苷酸。
[0025]3.提供了鈍頂螺旋藻CPD光修復酶的表達載體
該表達載體包括:導入了鈍頂螺旋藻(PD光修復酶優化後的編碼基因而能夠編碼如(a)或(b)所述蛋白質的原核表達載體或真核表達載體。
[0026]本發明提供的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶的表達載體中，還可以加入選擇性標記基因，包括但不限於:可在表達菌株中產生顏色變化的酶的基因、或發光化合物的基因、或具有抗生素標記物的基因、或具有營養缺陷抗性的基因。
[0027]更具體的講，本發明首先從GeneBank資料庫中查詢得到鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原始cDNA序列，經原核表達系統密碼子優化後得到優化後的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶編碼基因。通過化學合成得到該全長編碼基因，同時，根據該基因片段序列設計引物，進行PCR，擴增優化後的全長鈍頂螺旋藻(PD光修復酶基因並將該基因克隆到原核克隆載體pET28上(由pET28a(+)改造的載體，去除了 pET28a(+)中His_tag前的凝血酶酶切位點及一些限制性酶切位點)，進行測序驗證。將構建好的重組載體轉化進入大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中表達。最終經過Ni親和層析、凝膠排阻及離子交換層析得到純化蛋白。為了方便過量表達菌株的鑑定和篩選，可對表達載體進行加工，如加入可產生顏色變化的酶或發光化合物基因(如GFP基因、突光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素標記物及營養缺陷標記物。
[0028]( I)鈍頂螺旋藻CPD光修復酶基因編碼序列的原核表達系統密碼子優化
從GeneBank資料庫中查詢得到鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原始cDNA序列(Gene ID:15162397)，按照大腸桿菌細胞內tRNA豐度數據，將鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原始編碼基因中的稀有三聯體密碼子替換為大腸桿菌細胞中tRNA豐度最高的相應密碼子核苷酸，最終獲得適於大腸桿菌原核表達的鈍頂螺旋藻(PD光修復酶優化基因編碼序列。該優化過程中鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原始cDNA序列中有367個核苷酸被替換調整，佔編碼序列的25%。
[0029](2)鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原核表達編碼基因的獲得
按照優化後的基因序列全基因化學合成全長雙鏈鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原核表達編碼基因。
[0030](3)鈍頂螺旋藻CPD光修復酶表達載體構建
根據優化後的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶基因完整序列設計引物:
CPDF: CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG
CPDR: GACA CTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGCPCR反應條件為:98 °C預變性10min，98°C變性50s，55°C退火50s，72。。延伸2min,反應進行30個循環；將光修復酶基因的PCR擴增產物連接至原核表達載體pET28，得到重組質粒；將連接好的重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta (DE3),測序鑑定得到重組菌株Rosetta(DE3)/ pET28/phr。
[0031](4)鈍頂螺旋藻CPD光修復酶的純化和蛋白檢測
將重組菌Rosetta (DE3) / pET28/phr接種於含卡那黴素的LB液體培養基培養後，加入IPTG，收集菌體；經過Ni親和層析、凝膠排阻及陰離子交換層析，得到目的蛋白。
[0032]取上述誘導表達的Rosetta (DE3)/ pET28/phr菌體和純化的目的蛋白，進行SDS-PAGE恆壓電泳，電泳結束後將凝膠用聚丙烯醯胺凝膠染色液染色。
[0033]本發明通過密碼子優化及重組表達、純化技術，獲得了鈍頂螺旋藻CPD光修復酶，其能夠主動修復由紫外線引起的皮膚細胞DNA損傷，適用於化妝品等相關領域。例如，現有防曬產品主要通過將皮膚與紫外線隔離開來的方式起作用，對已經產生的紫外傷害無法起到修復治癒作用；而將本發明的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶蛋白作為高級護膚品的功能成分時，其主動修復由紫外線 引起的紅斑、皮膚炎症以及基因損傷，顯著提高防曬產品的防護效果，而若作為皮膚細胞DNA修復保健品，其還可以清除皮膚細胞中日常累積的DNA損傷，起到延緩皮膚衰老的作用。
[0034]為了使本發明實現的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0035]下述實施例中所使用的方法均為本領域常規操作，詳見《分子克隆實驗指南(第四版)》，科學出版社，2013年I月I日出版，ISBN:9787030386069。
[0036]實施例1鈍頂螺旋藻Spirulina platensis CPD光修復酶原核表達優化編碼基因的獲得
從GeneBank資料庫中查詢得到鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原始cDNA序列(Gene ID:15162397)，按照大腸桿菌細胞內tRNA豐度數據，將鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原始編碼基因中的稀有三聯體密碼子替換為大腸桿菌細胞中tRNA豐度最高的相應密碼子核苷酸，最終獲得適於大腸桿菌原核表達的鈍頂螺旋藻(PD光修復酶優化基因編碼序列。該優化過程中鈍頂螺旋藻CPD光修復酶原始cDNA序列中有367個核苷酸被替換調整，佔編碼序列的25%，其具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
[0037]實施例2鈍頂螺旋藻Spirulina platensis CPD光修復酶表達載體構建
1、根據優化後的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶基因完整序列設計引物:
正向引物:CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG
反向引物:GACACTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGC
PCR反應條件為:98°C預變性10min，98°C變性50s，55°C退火50s，72°C延伸2min，反應進行30個循環。PCR反應體系如下:
【權利要求】
1.一種鈍頂螺旋藻CPD光修復酶，其特徵在於，它具有SEQ ID N0:2所示的多肽序列，或在SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加所形成的具有CPD光修復酶活性的多肽序列。
2.如權利要求1所述的鈍頂螺旋藻CPD光修復酶，其特徵在於，它具有在SEQID NO: 2所示胺基酸序列中取代和/或缺失和/或添加I~10個胺基酸殘基所形成的多肽序列。
3.編碼權利要求1-2中任一項所述鈍頂螺旋藻CPD光修復酶的多聚核苷酸。
4.如權利要求3所述的多聚核苷酸，其特徵在於，具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能夠編碼光修復酶活性蛋白的核苷酸序列。
5.導入了權利要求3-4中任一項所述多聚核苷酸的原核或真核表達載體。
6.權利要求5所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體中還導入了選擇性標記基因。
7.權利要求6所述的表達載體，其特徵在於，所述選擇性標記基因包括:可在表達菌株中產生顏色變化的酶的基因、或發光化合物的基因、或具有抗生素標記物的基因、或具有營養缺陷抗性的基因。
8.包含權利要求3-4中任一項所述多核苷酸或權利要求5-7中任一項所述表達載體的宿主細胞。
9.權利要求1-2中任一項所述鈍頂螺旋藻CPD光修復酶在製備防曬產品中的應用。
【文檔編號】A61K8/66GK103966193SQ201310731604
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】李旭, 沈輝, 王虹 申請人:安徽邦業生物工程有限公司