一種花葯發育控制基因及其在擬南芥雄性不育中的應用的製作方法

2023-12-03 13:47:01 1

專利名稱：一種花葯發育控制基因及其在擬南芥雄性不育中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬植物生物技術領域，特別是涉及一種調控植物花葯發育從而調節育性的 基因、編碼蛋白及其應用。
背景技術：
植物的有性生殖不僅是植物繁殖的主要途徑，也是植物進化及對環境適應的基礎 之一。花葯是植物的雄性生殖器官，是花粉發育的場所。花葯及花粉的發育是植物基因功 能研究的一個重要研究方向。花葯及花粉發育異常會引起花葯不能產生正常功能的雄配子 從而導致雄性不育，雄性不育是生產上雜交制種的基礎。因此對花葯及花粉發育的深入研 究既有理論研究意義，又有實際應用的價值。在大多數植物中，成熟的花粉粒有兩層細胞壁花粉內壁和花粉外壁；花粉外壁 在保護花粉抵抗環境壓迫，細菌侵染以及細胞間識別中有重要作用。外壁的主要成分是孢 粉素類物質(sporopollenin)，有較強的抗腐蝕及抗酸鹼性能。花粉外壁比其他植物細胞壁 都要複雜，分為兩層有蜂窩狀的外壁外層(sexine)以及平坦的外壁內層(nexine)，分別 有不同的組成模式。花粉外壁的成分主要由絨氈層細胞合成並分泌在藥室中，沉著在小孢 子表面後形成高度複雜的網狀結構。花粉外壁的形成可以追述到減數分裂期間，此時小孢子母細胞會在細胞膜外分泌 由β-1，3-葡聚糖組成的胼胝質層以取代原有的細胞壁。胼胝質具有將小孢子與花葯孢 子體細胞隔離、防止細胞融合以及防止小孢子過早發育等作用。此外，胼胝質層作為初生 外壁形成的模板在隨後的花粉壁發育中有極其關鍵的作用。初生外壁(primexine)由單 倍體小孢子在細胞膜表面形成由多糖類物質組成。其結構決定了隨後花粉外壁的結構圖 案，相當於花粉外壁建設的藍圖。當胼胝質或者初生外壁的合成出現缺陷時，隨後的花粉壁 形成就會受到影響，從而導致花粉發育缺陷乃至降解。擬南芥胼胝質合成酶基因Callose Synthase 5(CalS5)在小孢子母細胞中高效表達，對四分體胼胝質層的合成起主要作用。 在該基因的敲除突變體中，小孢子周圍的胼胝質合成量急劇降低，導致初生外壁合成缺陷， 隨後的花粉外壁沉積也受到嚴重影響，這些研究表明了胼胝質層對小孢子外壁發育非常重 要。生長素在植物的花葯發育過程中有著重要的作用。在生長素合成缺陷的yuc2 yuc6雙突變中，雄蕊可以正常形成，但其發育終止，花葯中只形成極少花粉並且花絲不能伸 長。另外，最近的研究表明花葯自身合成的生長素可以調節花葯開裂和花粉成熟的過程，而 生長素的運輸則可以調控了花絲的伸長。生長素響應元件DR5-GUS的染色結果顯示，生長 素在這一時期的花葯中有特異的積累，提示其在絨氈層發育和花粉形成早期起重要作用。 絨氈層中的內源生長素在花粉單核期累積，在菸草絨氈層中特異表達iaaL基因後，內源生 長素水平降低，引起花粉育性的降低，說明絨氈層中內源生長素對花粉發育有重要作用。因 此，生長素在花葯發育過程中花葯開裂、花絲伸長、絨氈層發育和花粉形成等方面都起重要 的作用。
生長素響應因子(ARFs)、生長素/吲哚乙酸蛋白(Aux/IAAs)和SCF複合體(泛素 介導的蛋白降解途徑組分)是三類主要的早期生長素響應蛋白，這些蛋白在生長素的信號 轉導中起著關鍵性的作用。當細胞中沒有生長素信號進入時，ARF蛋白與Aux/IAA蛋白結合 形成異源二聚體，ARF蛋白不具有轉錄活性。當細胞中有生長素信號轉入時，Aux/IAA蛋白 被泛素介導的蛋白降解途徑降解，ARF蛋白形成同源二聚體，結合在生長素調控基因啟動子 的生長素響應元件(AuxREs)上，從而調節一系列基因的表達，進而引導植物的正常生長和 發育。因此ARF蛋白在生長素調控植物生長發育的信號傳導中有著重要的作用。ARF17蛋 白缺少二聚化的結構域III和IV，其中間結構域富含kr，其可能是一個抑制型轉錄因子。 ARF17受miR160調控，且過量表達以後會產生子葉增生，真葉捲曲，根長及側根數目異常、 花期前死亡和不育等表型。雖然在擬南芥中ARF17過量表達會產生多種表型，但由於缺少 ARF17的突變體，ARF17本身在植物中的功能不是很清楚。儘管對生長素極性運輸和作用機理已有比較深入的了解，但是在花葯發育中生長 素的信號通路及調控花葯開裂、花絲伸長、絨氈層發育和花粉形成等方面分子機制尚不清 楚。擬南芥的arfl7突變體，是單基因隱性突變，符合孟德爾方式遺傳規律。該突變體呈不 育的表型，突變體中小孢子從四分體中釋放後很快破裂降解。因此，ARF17在植物生命周期 中，從雙倍孢子體向單倍雄配子體轉換過程中起關鍵作用，通過生物技術手段實現對擬南 芥育性的調控將有助於在模式植物上創建一個全新的雄性不育育種應用途徑。

發明內容
所要解決的技術問題本發明所要解決的技術問題是提供一種花葯發育控制基因，以補充現有雄性不育 基因序列的特異性的分子標記的不足，而此標記具備鑑定擬南芥或其他植物的雄性不育植 物的基因型的潛力；在此基因的應用方面，提供一種新的雄不育植株獲得方法，即利用本發 明克隆的基因進行分子水平的轉基因育種，以克服常規的雜交和回交育種方法育種的時間 長、育種效果不確定的缺陷。技術方案本發明的技術方案之一是提供一種分離的花葯發育控制蛋白多肽，所述的多肽選 自下組a) SEQ ID No. 2胺基酸序列的多肽；或b)在SEQ ID No. 2的胺基酸序列中經過取代、缺失或插入1_10個胺基酸所衍生 的，且具有花葯發育控制功能的蛋白。上述的花葯發育控制蛋白多肽的一種優選方式為具有SEQ ID No. 2胺基酸序列的 多肽。本發明的技術方案之二是提供一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列 選自下組a)編碼權利要求1所述多肽的多核苷酸；或b)SEQ ID No. 1 中包含 SEQ ID No. 1 中 355-660 位和 820-1068 位的多核苷酸序 列。在一種優選方式中，所述的多核苷酸編碼如SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列的多肽。在另一種優選方式中，所述的多核苷酸如SEQ ID No. 1所示、或者包含SEQ ID No. 1中355-660位和820-1068位的多核苷酸序列。本發明的技術方案之三是提供一種載體，該載體含有上述的技術方案之二所述的 多核苷酸。本發明的技術方案之四是提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有 上述的技術方案之三所述的載體。本發明的技術方案之五是提供一種花葯發育控制蛋白的製備方法，包含以下步 驟a)在適合表達花葯發育控制蛋白的條件下，培養上述的技術方案之四所述的宿主 細胞；和b)從培養物中分離出所述的花葯發育控制蛋白。本發明的技術方案之六是提供一種製備轉基因植物的方法，包括如下步驟a)將上述的技術方案之二所述的多核苷酸轉入植物細胞；和b)將步驟a)中的植物細胞再生植株。本發明的技術方案之七是提供一種上述的技術方案之一所述的花葯發育控制蛋 白多肽、以及上述的技術方案之二所述的多核苷酸的用途，其特徵在於，用於控制植物花葯 的發育。本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對於本領域的技術人員而言是顯而易 見的。


下面結合附圖對理解本發明做進一步詳細描述，但並非對本發明做限定。圖1顯示了突變體背景下ARF17基因的的突變位點。黑色長方形代表外顯子，基 因內黑線代表內含子。圖2顯示了擬南芥雄性不育突變體arfl7的不育表型。A.野生型植株果莢飽滿， 可育；B.突變體植株果莢短小，完全不育；C.轉基因互補植株恢復育性。圖3顯示了野生型與突變體的花葯發育組織學觀察。㈧，⑶，(C)，(G)，(H)，⑴ 為野生型花葯；(D)，(E)，(F)，(J)，(K)，(L)為arfl7花葯。(A)野生型第五期(B)野生型 花葯第六期。(C)野生型第七期內為四分體。(D)第五期arf 17花葯基本正常。(E)第六期 arfl7花葯。(F)第七期arfl7花葯中絨氈層空泡化，四分體形態較為異常。(G)第八期早 期的野生型花葯，小孢子已從四分體中分離。(H)野生型第九期花葯。小孢子進入空泡化過 程，外壁已形成。(I)第十期野生型。(J)第8期arf 17突變體的小孢子也能從四分體中分 離。(K)第九期突變體。小孢子以及絨氈層都開始降解，孢粉素積累異常。(L)第十期突變 體中小孢子已經降解。dMp，降解的小孢子；E，花葯外壁；En，花葯內壁；MI，中層細胞；Ms，小 孢子母細胞；Mp，小孢子；Pg，花粉；Sp，孢粉素；T，絨氈層；Tds，四分體.標尺=IOym.圖4顯示了野生型與arfl7突變體小孢子發育的透射電鏡圖像(A) - (D)野生型小孢子第六期(A)，第七期(B)，第九期(C)第十期(D).(E)-(H) (A)-(D)中黑框所劃出區域的放大圖片。(I)_(L)arf 17小孢子第六期(I)，第七期(J)，第九期(K)第十期(L). (M)-(P) (I)-(L)中黑框所劃出區域的放大圖片。 (M), (N)第六期及第七期花葯切片，顯示突變體小孢子母細胞及四分體的胼胝質沉積較少。 (K)，(0)第九期及第十期花葯切片，顯示野生型中小孢子外壁骨架及頂蓋結構發育正常， (L)，(P) arfl7突變體中積累異常，小孢子敗育。dMsp，降解的小孢子；dPg，降解的花粉；Ex， 花粉外壁；Ms，小孢子母細胞；Msp，小孢子；Pg，花粉；Tds，四分體.標尺=4μπι。圖5顯示了胼胝質染色及CALS5基因的表達。㈧野生型的四分體中正常的胼胝 質。(B)野生型四分體的胼胝質螢光及淚滴型的形狀。(C)arf 17突變體在明場下胼胝質 層幾乎觀察不到。(D)紫外激發螢光顯示突變體的四分體上胼胝質信號較淺。(E)半定量 RT-PCR(F)定量PCR檢測CALS5在野生型及突變體花苞中的表達。Tubulin作為對照基因。圖6顯示了 ARF17基因的表達模式。(A). ARF17在不同組織中的定量RT-PCR結 果。Rt -M ；St 莖；Lf 葉；Inf 花序；Sdl 幼苗。B-H以ARF17為探針的原位雜交結果，雜 交探針為anti-sense。(B).野生型花葯發育第C期；D.花葯發育第6期早期。E.花葯發 育第6期晚期。F.花葯發育第7期。G.花葯發育第8期。H.花葯發育第10期。I.花葯 發育第6期，雜交探針為sense。Sp 造孢細胞；Msp 小孢子；T 絨氈層；小孢子母細胞； Tds:四分體；Pg:花粉。圖7顯示了生長素響應報告基因DR5:⑶S在野生型和arfl7中的表達分析。 (A) - (E) DR5 ⑶S在野生型不同組織中的表達。㈧DR5 ⑶S在野生型花葯發育的第四到 第十期表達。(B)DR5::⑶S在野生型花序中的表達。(C)DR5::⑶S在野生型葉尖生長點表 達(星號所示)。(D) IAA處理後，DR5::⑶S除在野生型花葯中表達外，還在花瓣、花萼等部 位表達。(E) IAA處理後，DR5::GUS在野生型葉子裡的表達明顯升高。(F)-(I)DR5:⑶S在 arfl7突變體不同組織中的表達情況。(F)DR5:⑶S在arfl7突變體各時期的花序中都沒 有表達。(G)DR5::⑶S在arf 17突變體葉子的尖部正常表達(星號所示)。(H) IAA處理後， DR5:⑶Sarfl7在突變體各時期的花葯中仍然沒有表達，但在、花萼等部位表達。(I) IAA處 理後，DR5:⑶S在在arfl7突變體葉子的尖部表達大量增加。發明人實現本發明的具體技術包括如下步驟步驟一，擬南芥雄性不育突變體arfl7的分離和遺傳分析通過外源T-DNA插入誘 變野生型擬南芥Col生態型植株，通過大量篩選得到表型穩定的突變體arf 17。該突變體的 營養生長與野生型無明顯差異，表型為果莢短小，內不含有種子，如圖2所示。將arfl7作 為母本與野生型C0I-O父本雜交後可形成正常果莢，說明突變體雌蕊發育正常。通過雜交 F2代表型分離比分析，本發明確定arfl7是一個符合單基因控制遺傳規律的隱型突變體。步驟二，分離控制擬南芥育性的ARF17基因為了分離造成該突變體不育表型的 基因，本發明採用TAIL-PCR的方法，通過對側翼序列的測序表明，突變體中生長素響應因 子 AUXINRESPONSE FACTOR 17 (ARF17，AT1G77850)的第一個外顯子上有 T-DNA 插入(圖1)。進一步的連鎖分析發現，所有不育植株在該位點上都是純合插入。步驟三，ARF17基因的功能分析為證明突變體雄性不育的表型是ARF17的缺失所 導致的，本發明進行了互補實驗驗證。首先從野生型植株中克隆出AT1G77850基因組(包 含上遊1. 5kb啟動子和下遊300bp在內5. OKb片段)以及編碼區cDNA片段，分別構建到不 同的雙元表達載體中，利用農桿菌介導法轉化入arf 17突變體Fl代，待果莢成熟後收取種 子，在平板上用T-DNA片段所含抗性進行篩選，從而得到轉基因植物。經過對轉基因T2代植株的背景分析，證明了該基因的突變導致了該突變體的不育表型。本發明正確的克隆了 ARF17基因(SEQ ID No. 1)，胺基酸序列分析表明ARF17基因包含三個外顯子和兩個內含 子，編碼一個由585個胺基酸殘基構成的蛋白，屬於生長素響應因子ARF轉錄因子家族(SEQ IDNo2)；其中，所述SEQ ID No. 1中的355-660位為轉錄因子B3DNA結合區序列；所述SEQID No. 1中的820-1068位為AUXIN響應因子結構域序列。步驟四，ARF17基因調控小孢子胼胝質的合成以及花粉外壁的發育通過細胞學 光鏡切片觀察比較了 arfl7突變體與野生型的整個花葯發育過程，發現在花葯發育第六 期，突變體中小孢子母細胞不如野生型緻密，中層細胞退化程度要比野生型嚴重。減數分裂 完成後中，突變體四分體外的胼胝質雖然能夠形成，但其形狀並不是滴漏形結構並且彼此 間隙不如野生型明顯，說明突變體的胼胝質形成有問題。到花葯發育第九期，突變體中大多 數小孢子已經降解，而且其外壁的沉積也出現異常。透射電鏡觀察表明，在四分體時期，突 變體小孢子和胼胝質正常形成，但孢粉素沉積異常，比野生型多且大，而且小孢子周圍沒有 初生外壁形成(圖4)。小孢子從四分體釋放以後，突變體小孢子未形成任何外壁結構，只有 異常的孢粉素沉積。此外，通過RT-PCR的方法，發現在arf 17突變體背景下，在花葯中特異 性表達的與胼胝質合成相關的基因CALS5的表達有強烈下調。綜上所述，arfl7的小孢子 由於缺乏外壁結構，導致降解，從而引起花粉敗育(圖5)。步驟五，ARF17基因在花葯中高表達ARF17在所有檢測的組織中均有表達，包括 根、莖、葉、小的花苞和幼苗，但是在小的花苞中的表達較其它組織比明顯較高。為更詳細的 了解ARF17在花葯中的時空表達，我們進行了原位雜交試驗。我們設計了 5』端的原位探針 進行檢測。原位雜交實驗表明ARF17在花葯發育的第六期前期開始高表達，雜交信號特異 性地在絨氈層和小孢子母細胞中，而到了第六期的後期，表達有所減弱，但仍然在絨氈層， 小孢子母細胞中表達，而正義鏈探針在花葯發育的第六期沒有雜交信號。到了四分體時期 和第八期，ARF17隻在絨氈層有微弱表達(圖6)。ARF17在花葯中的表達譜與其功能較一 致，在花葯發育的第六期控制了花葯發育所需關鍵基因的表達。其突變後也導致第六期花 藥結構異常。步驟六，ARF17參與花葯生長素信號轉導ARF家族轉錄因子能和結合在有生長素 誘導元件基因的啟動子上，啟動基因表達，在生長素信號傳導過程中有著重要作用。為研究 ARF17在花葯生長素信號途徑中的作用，我們用雜交的方法將DR5 GUS導入突變體中。含有 DR5 GUS的野生型花葯和葉的尖部都能觀察到GUS基因的活性，突變體的葉尖部位DR5 GUS 基因表達正常，說明突變體中成功導入了 DR5::⑶S基因(圖7)。但在arf 17突變體花葯中 未能檢測到GUS表達，說明arf 17花葯中生長素信號途徑受到影響。我們進一步對野生型 和突變體進行外源生長素處理，結果顯示施加外源生長素以後野生型和突變體的葉，花萼 和花瓣等部位的DR5 ⑶S基因表達明顯上升，而突變體花葯中仍未檢測到DR5 ⑶S基因的 表達，說明arfl7突變體除花葯外，其它組織的生長素信號正常。總結這些數據，突變體花 藥中DR5:⑶S基因的異常表達可能是因為生長素信號轉導過程受到影響，而ARF17則可能 是生長素控制花葯生長信號途徑中的關鍵因子。糧食供給是人類生存與發展的根本。植物的生殖器官為動物和人類提供了食物的 主要來源。由於雄性不育品種為農業生產上異花授粉提供了極大的便利，所以控制作物的 雄性生殖發育對作物育種和農業生產至關重要。隨著基因工程技術的發展使得應用ARF17基因調控植物育性成為可能。有益效果在本發明提供的ARF17基因為一種擬南芥雄性不育的調控基因，與先前報導的其 他雄性不育調控基因不同，為新發現的特異性的雄性不育分子標記，以此標記可鑑定擬南 芥或其他植物的雄性不育植物的基因型。在此基因的應用方面，本發明提供的新的雄不育植株獲得方法，即利用本發明克 隆的基因進行分子水平的轉基因育種，克服了常規的雜交和回交育種方法育種的時間長、 育種效果不確定的缺陷。利用本發明的ARF17基因，通過反義敲除的手段還能提供一種新的雄性不育植株
獲得方法。在本發明對ARF17基因的研究過程中還揭示，它是一個生長素響應因子ARF轉錄 因子，該基因通過調節CALS5基因的表達調控了胼胝質的合成過程以及後續的花粉發育過 程，突變體發育後期花粉完全敗育。ARF17是在花葯發育6-9期非常重要的一個基因，也是 目前報導的第一個與生長素轉導途徑相關的參與小孢子外壁發育形成的轉錄因子。利用該 發育生物學的調控因子，可以進一步為控制胼胝質形成和花粉壁發育過程提供可供選擇的 手段。如本文所用，術語「雄性不育」是指植物雄性生殖器官不能產生正常功能的雄配子 (花粉)。如本文所用，術語「單基因隱型突變體」是指突變體受到單個基因的控制，其遺傳 分離比符合孟德爾遺傳規律。如本文所用，術語「生長素響應因子ARF轉錄因子」是指一系列編碼在核內調控基 因表達並能結合在生長素誘導元件啟動子上的調控基因如本文所用，術語「T-DNA插入突變」是指利用轉基因的方法把外源DNA片段插入 目的植物從而使其基因突變的方法。如本文所用，術語「TAIL-PCR」是指利用依照目標序列旁的已知序列的3個較高退 火溫度的嵌套特異性引物和一系列較短且Tm值較低的隨機簡併引物組合，通過3輪熱不對 稱的溫度循環分級反應來進行PCR擴增，獲得已知序列的側翼序列。
具體實施例方式本發明經過深入而廣泛的研究，從擬南芥分離出控制花葯發育的調控蛋白ARF17， 其調控了雄性小孢子的發育過程。本發明已經證實，通過調節ARF17的活性可以產生花粉 敗育的植物，所以開發和利用此基因進行人工創製不育系等農業應用方面具有很大的經濟 效益。如本文所用，ARF17蛋白多肽是用標準的蛋白純化技術純化的ARF17蛋白，純的 多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽，天然 多肽，合成多肽，優選重組多肽。該多肽可以是糖基化的，或是非糖基化的。本發明還包括 ARF17蛋白的片段，衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」，「衍生物」和「類似物」是指基 本上保持本發明的天然ARF17蛋白相同生物學功能和活性的多肽。本發明中，術語「ARF17 多肽」指具有ARF17蛋白相同功能的SEQ ID No. 2的多肽或其他變異形式。這些變異形式包括(但不限於)若干個胺基酸的缺失，插入或取代，以及在C末端或N末端添加數個氨基 酸。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然變異體、誘導變異 體，在高或低的嚴緊度條件下能與ARF17雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利用抗ARF17的抗 血清獲得的多肽或蛋白。發明還提供ARF17蛋白或多肽的類似物，這些類似物與天然ARF17 蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾差異，或者兼而有之。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆操 作手冊，或按照製造廠商所建議的條件。常規無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑 廠，限制性內切酶購自上海皓嘉生物公司，引物由上海生工公司合成。原位探針製備試劑盒 購自美國Roche公司，MMLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶等其餘分子生物學試劑均購自美國 Promega公司。Eppendorf梯度式PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司，螢光PCR儀為美國 ABI公司產品。實施例11.擬南芥(Arabidopsis thaliana)突變體 arfl7，原始野生型為 Columbia (Col) 生態型(上海師範大學植物分子生物學實驗室保存)。2.擬南芥材料栽培條件擬南芥在0. 1 %的瓊脂糖中4°C春化2-4天後培養在黑 土；蛭石；珍珠巖(1:6: 0. 25)的混合土中。培養時在其上層罩一層塑料膜以保持溼 度，當擬南芥萌發出子葉後去掉塑料層。光照時間為16小時光照，8小時黑暗，溼度保持在 60-70%，溫度控制在22-25°C，光照強度為50 μ ΕπΓ、—1，營養液為PNS (表1)。表1. PNS母液成分和1升1 X PNS配方
權利要求
1.一種分離的花葯發育控制蛋白多肽，其特徵在於，所述的多肽選自下組a)SEQ ID No. 2胺基酸序列的多肽；或b)在SEQID No. 2的胺基酸序列中經過取代、缺失或插入1_10個胺基酸所衍生的，且 具有花葯發育控制功能的蛋白。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於，所述的多肽為SEQID No. 2胺基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸的核苷酸序列選自下組a)編碼權利要求1所述多肽的多核苷酸；或b)包含SEQID No. 1中355-660位和820-1068位的多核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸編碼如SEQID No. 2 所示的胺基酸序列的多肽。
5.根據權利要求4所述的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸的序列如SEQID No. 1所示、或者包含SEQ ID No. 1中355-660位和820-1068位的多核苷酸序列。
6.一種載體，其特徵在於，含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞含有權利要求6所述的 載體。
8.—種花葯發育控制蛋白的製備方法，包含以下步驟a)在適合表達花葯發育控制蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；和b)從培養物中分離出所述的花葯發育控制蛋白。
9.一種製備轉基因植物的方法，包括如下步驟a)將權利要求3所述的多核苷酸轉入植物細胞；和b)將步驟a)中的植物細胞再生植株。
10.一種權利要求1所述的花葯發育控制蛋白多肽、以及權利要求3所述的多核苷酸的 用途，其特徵在於，用於控制植物花葯的發育。
全文摘要
本發明涉及一種花葯發育控制基因及其在擬南芥雄性不育中的應用。從T-DNA插入突變體庫中篩選到擬南芥雄性不育突變體arf17，克隆並鑑定了控制擬南芥育性的基因ARF17，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，遺傳互補實驗證明野生型中的ARF17基因可以恢復突變體的雄性不育表型。胺基酸序列分析實驗表明ARF17是一個ARF(AUXIN RESPONSE FACTOR)家族的轉錄因子，定位於細胞核中。擬南芥中，該基因的突變導致雄性完全敗育。該基因在闡述控制胼胝質合成和外壁形成關鍵基因的轉錄來調控植物育性方面，以及雜交制種提高作物產量方面具有非常重要的應用價值。
文檔編號C12N15/63GK102140132SQ20101061852
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者朱駿, 楊仲南, 楊俊 申請人:上海師範大學