覆盆子提取物及其應用的製作方法
2023-12-04 03:03:06
覆盆子提取物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於中藥開發利用領域，具體涉及覆盆子開發利用。本發明提取物包括水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分任一部分；提取物具有預防、治療抗老年痴呆作用。原料來自綠色植物，具有廣闊的開發空間及應用前景。
【專利說明】覆盆子提取物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於中藥開發利用領域，具體設計覆盆子開發利用。
【背景技術】
[0002]進入21世紀，老齡化社會正在悄然來臨，我國於1999年末成為老年型國家，而且我國老年人口以3%的速度增長。在老年人中疾病的排列順序是心臟病、腫瘤、腦血管病，第四位是老年性痴呆。據估計，在65歲以上的老年人中，有10%患有輕度和中度痴呆。4-5%患有嚴重痴呆，85歲以上的老人這個比例超過15%。有專家預言，老年性痴呆將是21世紀人類第一殺手，目前全球的老年性痴呆病人估計在2000-2500萬。美國超過400萬，中國已超過500萬。痴呆給病人、家庭和社會帶來諸多方面的危害，如個人生活質量下降，治療藥物、醫療、護理照料費用，由於病人的精神症狀、行為和人格障礙給社會和他人帶來損失。在美國老年性痴呆(Alzheimer』 s disease, AD)的費用僅次於心臟病和腫瘤而居第三位,在1994年為830億。我國雖然沒有對AD病人費用統計，每年估計至少花費50億元。到2050年，我國老年痴呆病人將超過3000萬，預計費用將超過I萬億元。痴呆患者不僅對本人極為痛苦，而且對家庭和社會的負擔很大，因此，尋找有效藥物以延緩、控制AD病情的發展是極為重要的。
[0003]迄今，現代醫學尚無能終止或逆轉老年性痴呆病理改變而起到根本治療作用的療法。
【發明內容】
[0004]針對現有技術的問題，本發明提供了一種覆盆子提取物，及其在製備預防、治療抗老年痴呆藥物中的應用。·
[0005]本發明具體方案如下:
覆盆子提取物，包括水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分；
所述水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步驟提
取:
1、取覆盆子藥材粉碎，用75%乙醇滲漉到基本無色，分別用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑後，分別得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水溼法裝柱的聚醯胺柱，水洗脫後，收集水洗脫液即氯仿部位水洗脫液；
聚醯胺柱水洗脫後，再用乙醇洗脫，收集洗脫液得氯仿部位乙醇洗脫液；
聚醯胺柱再用氨水甲醇液洗脫，洗脫液用4mol/L鹽酸中和pH至中性後，上DlOl大孔樹脂，用70%丙酮洗脫，收集洗脫液得氯仿部位丙酮洗脫液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水溼法裝柱的聚醯胺柱，水洗脫，收集水洗脫液得乙酸乙酯部位水洗脫液；聚醯胺柱水洗後，用乙醇洗脫，收集洗脫液得乙酸乙酯部位乙醇洗脫液；
聚醯胺柱再用氨水甲醇液洗脫，將洗脫液用4mol/L鹽酸中和至中性，上DlOl大孔樹脂，70%丙酮洗脫，以除去無機鹽，得乙酸乙酯部位丙酮洗脫液；
4、步驟2)氯仿部位水洗脫液浸膏與步驟3)乙酸乙酯部位水洗液合併，減壓濃縮，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得水洗部分；該部分主要成分為留醇和萜類成分；將氯仿部位丙酮洗脫液與乙酸乙酯部位丙酮洗脫液合併，回收丙酮後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得丙酮洗脫部分，該為部分主要成分為鞣質和黃酮聚合物。
[0006]取氯仿部位乙醇洗脫液，回收乙醇後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得氯仿部分；該部分主要成分為黃酮和酚酸類；
取乙酸乙酯部位乙醇洗脫液，回收乙醇後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得乙酸乙酯部分，該部分主要成分為黃酮和酚酸類；
本發明還涉及上述提取物在製備預防、治療抗老年痴呆藥物中的應用。
[0007]本發明提取物來自植物成分覆盆子，具有良好的抑制老年痴呆的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1 HE染色照片
A空白組海馬CAl區HEX400 B模型組海馬CAl區HEX400 C腦復康組海馬CAl區HE X 400 D水洗高劑量組海馬CAl區HE X 400 E水洗低劑量組海馬CAl區HEX 400 F氯仿高劑量組海馬CAl區HEX400 G氯仿低劑量組海馬CAl區HEX400 H丙酮高劑量組海馬CAl區HEX400 I丙酮低劑量組海馬CAl區HEX400 J乙酸乙酯高劑量組海馬CAl區HEX400 K乙酸乙酯低劑量組海馬CAl區HEX400。
[0009]圖2免疫組化照片`
L 空白組 Pser404_tauX400 M 模型組 Pser404_tauX400 N 腦復康組Pser404-tau X 400 O 水洗高劑量組 Pser404_tau X 400 P 水洗高劑量組 Pser404_tauX400Q丙酮高劑量組Pser404-tauX400 R丙酮低劑量組Pser404-tauX400 S氯仿高劑量組Pser404_tau X 400 T氯仿低劑量組Pser404_tau X 400 U乙酸乙酯高劑量組Pser404-tau X 400 V 乙酸乙酯低劑量組 Pser404_tauX400。
【具體實施方式】
[0010]實施例1覆盆子提取物製備
1、取覆盆子藥材粉碎，用75%乙醇滲漉到基本無色，分別用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑後，分別得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水溼法裝柱的聚醯胺柱，水洗脫後，收集水洗脫液即氯仿部位水洗脫液；
聚醯胺柱水洗脫後，再用乙醇洗脫，收集洗脫液得氯仿部位乙醇洗脫液；
聚醯胺柱再用氨水甲醇液洗脫，洗脫液用4mol/L鹽酸中和pH至中性後，上DlOl大孔樹脂，用70%丙酮洗脫，收集洗脫液得氯仿部位丙酮洗脫液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水溼法裝柱的聚醯胺柱，水洗脫，收集水洗脫液得乙酸乙酯部位水洗脫液；聚醯胺柱水洗後，用乙醇洗脫，收集洗脫液得乙酸乙酯部位乙醇洗脫液；
聚醯胺柱再用氨水甲醇液洗脫，將洗脫液用4mol/L鹽酸中和至中性，上DlOl大孔樹脂，70%丙酮洗脫，以除去無機鹽，得乙酸乙酯部位丙酮洗脫液；
4、水洗部分:步驟2)氯仿部位水洗脫液浸膏與步驟3)乙酸乙酯部位水洗液合併，減壓濃縮，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得水洗部分；該部分主要成分為留醇和萜類成分；
丙酮洗脫部分:將氯仿部位丙酮洗脫液與乙酸乙酯部位丙酮洗脫液合併，回收丙酮後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得丙酮部分，該為部分主要成分為鞣質和黃酮聚合物；
氯仿部分:取氯仿部位乙醇洗脫液，回收乙醇後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得氯仿部分；該部分主要成分為黃酮和酚酸類；
乙酸乙酯部分:取乙酸乙酯部位乙醇洗脫液，回收乙醇後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得乙酸乙酯部分，該部分主要成分為黃酮和酚酸類。 [0011]實施例2覆盆子提取物對腎陽虛型老年性痴呆大鼠海馬CAl區形態學及tau蛋白過度磷酸化的影響實驗
兔抗Pser404-tau試劑盒，Abgent公司產品；兔SP檢測試劑盒,北京中杉金橋生物技術有限公司，批號為11137A10 ;DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號為911882A。
[0012]I實驗方法
1.1造模與給藥
SD大鼠120隻，雄性，SPF級，體重180-220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK(湘)2009-0004。實驗動物適應I周后，Morris水迷宮實驗篩選動物，剔除10隻後(剔除離群，在逃避潛伏期內總是找不到平臺的大鼠)，隨機分成11組:空白組、模型組、腦復康組、覆盆子水洗高劑量組、水洗低劑量組、丙酮洗脫高劑量組、丙酮洗脫低劑量組、氯仿醇洗高劑量組、氯仿醇洗低劑量組、乙酸乙酯提取高劑量組、乙酸乙酯提取低劑量組，每組10隻。每天觀察記錄動物的一般情況，每5天稱體重一次，觀察體重變化情況。
[0013]空白組腹腔注射生理鹽水(0.5ml/100g)，其餘各組均腹腔注射D-半乳糖(125mg/kg)，連續6周，造成亞急性衰老模型。然後空白組和模型組灌胃生理鹽水(lml/100g )，腦復康(西藥單一成分:吡拉西坦)組(0.4g/100g.d)預防性灌胃腦復康混懸液；
各給藥組灌胃覆盆子提取物，取實施例1覆盆子水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分，所得計量以覆盆子原藥材計，分別分為高劑量組和低劑量組。高劑量各組均預防性灌胃2.4g/100g.d，低劑量各組均預防性灌胃1.2g/100g.d，連續4周。
[0014]灌胃最後2周，採用氫化可的松混懸液給大鼠肌肉注射(25mg/kg)造成腎陽虛模型，造模完成後進行歷時6天的Morris水迷宮實驗。
[0015]1.2腦標本處理
心臟取血後直視下將輸液針刺入左心室至升主動脈，同時剪開右心耳，用0.9%溫生理鹽水250ml灌注至肝臟完全變白，右心室流出澄清液體後，右腦快速取出放預冷的4%多聚甲醛固定24h，乙醇系列脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，切片厚2-4μπι，連續切片，每5張取一張，分別進行HE染色和免疫組化染色。光鏡下每張切片計數3個視野(400X)的細胞，總和除以3作為該大鼠的細胞計數。
[0016]1.3形態學檢測
HE染色:⑴烤片30min_lh 「2)二甲苯I IOmin ;(3)二甲苯II IOmin ;⑷無水乙醇I 3min ；
(5)無水乙醇 II 3min ；(6) 95% 乙醇 I 3min ；(7) 95% 乙醇 II 3min ；(8) 75% 乙醇 3min ;(9)自來水洗去乙醇幾秒；(1Φ蘇木精染色5min ;(11)自來水泛藍30min ;(12)伊紅10-30秒；(13) 95%乙醇I過；(14) 95%乙醇II過；(15)無水乙醇I 3min ;(16)無水乙醇II 3min ;(17)乾燥；(18)二甲苯I 2min ；(19)二甲苯II 2min ;?)乾燥，中性樹膠封片。
[0017]1.4免疫組化染色法檢測海馬CAl區Pser404_tau陽性細胞的表達
⑴58°C烤片1.5h ;⑵常規脫臘至水:二甲苯I lOmin—二甲苯II IOmin —無水乙醇I 5min —無水乙醇 II 5min — 95% 乙醇 I 3min — 95% 乙醇 II 3min — 80% 乙醇 3min —雙蒸水3minX3次；⑶抗原修復:高壓鍋煮沸後修復lOmin，PBS衝洗3minX3次；⑷滴加3%H202去離子水37°C孵育lOmin，消除內源性過氧化物酶活性，PBS衝洗3minX3次；(5)滴加封閉用正常山羊血清工作液37°C孵育15min，傾去，勿洗；(6)滴加一抗工作液，4°C過夜；
(7)37°C復溫45min，PBS衝洗5minX3次；⑶滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37°C孵育15min，PBS衝洗5minX3次；(9)滴加辣根酶標記鏈黴卵白素工作液，37°C孵育15min，PBS衝洗5minX3次；(W)二氨基聯苯胺(DAB)顯色5min,自來水衝洗30min ;(11)蘇木精復染5min,自來水衝洗20min ;02)脫水透明:95%乙醇I (過)一95%乙醇II (過)一無水乙醇I 3min —無水乙醇II 3min —乾燥一二甲苯I 2min — 二甲苯II 2min —乾燥一中性樹膠封片。
[0018]2統計學處理
所有數據用f 表示，使用SPSSl1.5軟體進行單因素方差分析，組間用LSD法。
[0019]3 結果
3.1海馬CAl區HE染色結果
結果見表1及圖1。正常組:大鼠海馬形態完整，細胞排列緻密整齊，形態正常，細胞結構正常，核仁清晰，神經元細胞數量多。
[0020]模型組:大鼠海馬形態破碎，結構異常，細胞變形，空泡壞死，胞核固縮，核深染，神經元細胞數量明顯減少。
[0021]給藥組:相比較模型組而言，除水洗低劑量和氯仿低劑量，各給藥組大鼠海馬神經細胞形態均有不同程度的恢復。神經元細胞數量比模型組多，染色較正常，排列較整齊，結構較正常，分布較均勻。
[0022]表1覆盆子活性成分對腎陽虛型老年性痴呆大鼠海馬CAl區細胞總數、
【權利要求】
1.覆盆子提取物，其特徵在於包括水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分； 所述水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步驟提取: 1)取覆盆子藥材粉碎，用75%乙醇滲漉到基本無色，分別用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑後，分別得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏； 2)氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水溼法裝柱的聚醯胺柱，水洗脫後，收集水洗脫液即氯仿部位水洗脫液； 聚醯胺柱水洗脫後，再用乙醇洗脫，收集洗脫液得氯仿部位乙醇洗脫液； 聚醯胺柱再用氨水甲醇液洗脫，洗脫液用4mol/L鹽酸中和pH至中性後，上大孔樹脂，用丙酮洗脫優選用70%丙酮洗脫，收集洗脫液得氯仿部位丙酮洗脫液； 3)乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水溼法裝柱的聚醯胺柱，水洗脫，收集水洗脫液得乙酸乙酯部位水洗脫液； 聚醯胺柱水洗後，用乙醇洗脫，收集洗脫液得乙酸乙酯部位乙醇洗脫液； 聚醯胺柱再用氨水甲醇液洗脫，將洗脫液用4mol/L鹽酸中和至中性，上大孔樹脂，70%丙酮洗脫，以除去無機鹽，得乙酸乙酯部位丙酮洗脫液； 4)取步驟2)氯仿部位水洗脫液浸膏與步驟3)乙酸乙酯部位水洗液合併，減壓濃縮，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得水洗部分； 取氯仿部位乙醇洗脫液，回收乙醇後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得氯仿部分； 將氯仿部位丙酮洗脫液與乙酸乙酯部位丙酮洗脫液合併，回收丙酮後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得丙酮洗脫部分； 取乙酸乙酯部位乙醇洗脫液，回收乙醇後，使其濃度相當於每毫升浸膏含藥材重2g，得乙酸乙酯部分。
2.如權利要求1所述覆盆子提取物，其特徵在於所述步驟2)和3)中大孔樹脂為DlOl大孔樹脂。
3.權利要求1所述覆盆子提取物在製備預防、治療抗老年痴呆藥物中的應用。
【文檔編號】A61K36/73GK103623082SQ201310624223
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】謝一輝, 黃麗萍, 樊浩, 張雨恬, 龔嘉華, 練波 申請人:江西中醫藥大學