植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法
2023-12-03 08:25:46 1
專利名稱：植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法
技術領域：
本發明涉及一種使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，屬於植物基因工程技術領域。
背景技術：
貽貝足絲盤分泌的貽貝粘合蛋白質(Mussel Adhesive ftOtein)在溼性環境中任何類型的物質表面上(如金屬、木材、玻璃、礦物、骨骼等)具極強粘合性，如與巖石、 船體等牢固連接。目前認為貽貝粘合蛋白質的強粘合性主要是貽貝足絲蛋白 edulis footprotein，Mefp)中含高濃度的特殊胺基酸3，4_ 二羥基苯丙氨酸(3，4 -dihydroxyphenyl alanine, DOPA)可與蛋白質等極性聚合物間形成很強的氫鍵結合，DOPA 的苯酚基團具有很強的金屬絡合能力，可以在水中材料表面能形成不可逆的有機金屬絡合物。Mefp分泌時為液態，能在水下很快固化形成具有粘附能力的附著基，Mefp含有酪氨酸翻譯後修飾的D0PA，實現粘合蛋白分子內部的交聯，使粘合蛋白質固化並具有防水粘合強度高的優異性能。研究貽貝粘合蛋白質的生物分布和胺基酸組成發現，Mefp具有多個串聯起來的寡肽重複單元，且DOPA含量較高，通過交聯和絡合將大量鐵離子變為堅韌而緻密的塗層，其中Mefp-5的DOPA的含量最高，每4個胺基酸中含有超過1個的D0PA，摩爾分數達到30%，主要分布在足絲的附著基上。Mefp-5含有74個殘基，其超過三分之一的是翻譯後被羥基化或磷酸化修飾過，其中酪氨酸羥基化作用轉變為D0PA，或絲氨酸磷酸化作用轉變為0-磷酸絲氨酸，對鈣親和力很強，從而使Mefp-5的粘接能力最強。天然貽貝粘合蛋白在溼性條件下優良的粘接強度，作為一種生物防腐劑和粘合劑，不會造成環境汙染，在生物安全性和相容性方面具有化學合成的粘合劑無可替代的優勢，因此在醫用方面有極大的應用價值。這些已經被類似的從I eWh提取的粘附蛋白的細胞和組織粘附劑CELL-TAK (美國BD Bioscienee公司)開始應用與臨床；從I edulis 中提取粘附蛋白用於豬皮粘接的研究報導進一步證實。貽貝粘合蛋白正常情況下依靠貽貝分泌產生，呈液態，可以直接從海洋貽貝足部提取獲得，但是天然貽貝分泌的液態蛋白量極少，在短時間內會發生固化，而且提取成本很高，使得貽貝粘合蛋白的材料來源非常短缺。近年來，人們開始嘗試通過基因工程的手段獲得具有天然修飾的貽貝粘合蛋白特性的基因工程產物的粘合蛋白。已有研究重組融合貽貝粘合蛋白可以有效凝聚在金屬材料 (如鈦)表面促進成骨細胞的增殖，得到的重組粘合蛋白材料類似並優於天然粘合劑。Inoue 等最早克隆到了貽貝粘合蛋白的cDNA (召iW Bull, 1994，186:349)，Waite等將粘合蛋白的cDNA轉入大腸桿菌U/w # 7 Jcat/5bi, 1999，18:301)，鄭昕等將粘合蛋白的cDNA轉入巴斯德畢赤酵母(大連輕工業學院學報，2002，21 :100-102)，但均未表達出具有粘接活性的蛋白。Jos印h等將粘合蛋白基因Mefp-3在酵母07炒hciis)中通過融合表達得到蛋白，初步表明了 Mefp-3在真核表達系統中的自組裝能力和其在粘合劑的形成過禾呈中白勺作用(/7TOiei/ Expression and Purification， 2008, 57 (1) :57 - 62)。 Dong等首次將Mefp-3，5的基因在大腸桿菌表達出粘接活性的蛋白，粘接力可達500nN，但表達
and Environmental Microbiology， 2004，70: 3352-9 -,Prog, 2005，21:965-970)；其與六聚His的融合表達的Mefp-5對細胞貼壁效果更好，但存在產率低、純化量低和純化後不溶解等種種缺陷。植物基因工程獲得貽貝粘合蛋白，可以克服原核表達系統的缺陷(如完成外源蛋白修飾和正確摺疊困難)，植物表達系統在規模化生產、安全性和生產成本方面比傳統的細菌、動物細胞和轉基因動物系統均具有較大優勢，如植物系統表達蛋白所需成本僅為原核表達系統的1/50。
發明內容
本發明的目的是提供一種使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，為從植物中得到貽貝粘合蛋白材料來源提供一條新的途徑，推動植物基因工程及醫用粘合劑應用的深入研究。
本發明實現過程如下
一種使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於包括如下步驟
(1)植物轉化受體的獲得；
(2)構建粘合蛋白基因基因的植物表達載體；
(3)採用農桿菌介導法將基因轉入菸草，獲得轉基因植株。上述步驟(1)中，使用菸草種子接種在MS培養基得到無菌苗，無菌苗葉片切塊在MS分化培養基上分化不定芽，不定芽接種在MS生根培養基中生根，建立菸草離體再生體系，再生的菸草植株作為基因轉化受體；所述的MS分化培養基為MS培養基+1. 5mg/L 6-BA ；MS生根培養基組成為MS培養基+0. 2mg/L NAA。上述步驟(2)包括以下步驟
(A)利用PCR方法克隆粘合蛋白基因Mefp-5，測序鑑定；
(B)粘合蛋白基因Mefp-5上遊連接CaMV35S啟動子，下遊連接NOS終止子後，形成的連接產物CaMV35S-Mefp-5-N0S插入載體pCAMBIA 1300的多克隆位點構建植物表達載體，命 SSpMF ；
(C)採用凍融法將pMF和命名為pMFck的對照pCAMBIA1300導入農桿菌LBA4404中， 用於植物的遺傳轉化。上述步驟(3)包括以下步驟
(A)菸草葉片切塊經農桿菌感染後，培養於MS篩選培養基中，誘導不定芽的分化；
(B)篩選培養基上進行抗性篩選培養40 50d，得到假定菸草轉基因小苗；
(C)對轉化菸草pMF、pMFck及其未轉基因的親本對照CK株系進行PCR、RT-PCR擴增， 證明Mefp-5在菸草基因組DNA中的整合和表達，得到可表達粘合蛋白基因的轉基因菸草。所述步驟(A)中農桿菌感染條件為菸草外植體預培養2d，農桿菌濃度0D_=0. 6， 浸染20min，不附加誘導劑乙醯丁香酮。菸草葉片切塊為4周齡。篩選培養基為MS分化培養基+ 30mg/L潮黴素+ 300mg/L頭孢黴素。本發明的優點和積極效果
4本發明粘合蛋白基因Mefp-5的轉化在細胞水平上進行，提高了獲得轉基因植株的遺傳穩定性，有效避免嵌合基因植株的產生；構建的Mefp-5植物表達載體有雙子葉植物喜好的啟動子和終止子，適用於雙子葉植物的遺傳操作；本發明獲得帶有Mefp-5基因植株，表達粘合蛋白Mefp-5，為優質蛋白類粘合劑一貽貝粘合蛋白的材料來源提供一條生物技術新途徑。
圖1為受體外植體「秦煙95」的離體再生體系；
A無菌苗的葉片切片；B葉片切塊邊緣膨大，產生不定芽；C不定芽形成叢生苗；D叢生小苗生根；
圖2為基因的測序結果；A反向測序結果B正向測序結果； 圖3為含Mefp基因的植物表達載體pMF ； 圖4為pMF的酶切驗證； 圖5為培養、篩選得到轉基因植株；
A葉片切口處開始分化；B Hyp抗性不定芽(綠色)；C綠色Hyp抗性苗，白色非轉化苗；D Hyp抗性小苗生根生根；E移栽成活的pMF轉基因再生植株； 圖6為轉基因植株的分子檢測；
A Hyp基因的PCR分析；B Mefp-5基因的PCR分析；C Mefp-5基因的RT-PCR分析； P—質粒陽性對照；M_Marker ；CK—未轉基因菸草植株；廣6—pMF轉基因株系； ① ④一pMFck轉基因株。
具體實施例方式以下通過實施例進一步描述本發明。本發明使用的縮略語對應的中文名稱如下
本發明使用的MS基本培養基按手冊通用方法配製，組成與含量如下大量元素 NH4NO3 1650mg/L, KNO3 1900 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 1700mg/L ；微量元素:KI 0. 83 mg/L, H3BO3 6. 2 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 3 mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6 mg/L, Na2Mn04 · 2H20 0. 25 mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L, FeSO4 ·7Η20 (27. 8)mg/L +Na2-EDTA ·2Η20 (27. 3)mg/L ；有機成分肌醇 100mg/L，煙酸 0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇(維生素 )0.5 mg/L，鹽酸硫胺素(維生素&) 0. 5mg/L，甘氨酸2 mg/L。本發明使用的培養基組成如下
MS培養基組成為MS基本培養基+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH為5. 8 ； MS分化培養基組成為MS培養基+1. 5mg/L 6-BA, pH為5. 8 ； MS生根培養基組成為MS培養基+0. 2mg/L NAA, pH為5. 8 ；
MS篩選培養基組成為MS分化培養基+ 30mg/L潮黴素(Hyg)+ 300mg/L頭孢黴素 (Cef)，pH 為 5.8。YEB基本培養基組成為牛肉浸膏5 g/L，酵母浸膏1 g/L，蛋白腖5 g/L，蔗糖5 g/ L，0. 002 mmol/L MgSO4. 7H20 ；
YEB液體培養基組成為YEB基本培養基，附加lOOyg/mL鏈黴素(Str. ),50yg/mL卡那黴素，ρΗ7· 2 ；
實施例1轉基因受體植物菸草的高效再生體系確立
本發明所用菸草品種為「秦煙95」，常規MS培養基萌發產生無菌苗。以無菌苗的葉片 (圖1Α)為外植體，在25士2°C，光照強度為30 50 mol · πΓ2 · s—1，16h/8h光/暗培養條件下，葉片切塊在MS分化培養基上誘導出芽(圖1 B)，形成叢生苗(圖1 C)，分化率為100%。 將高2cm左右的不定芽轉到MS生根培養基7d後即誘導生根(圖1 D)。本發明建立的菸草離體再生體系分化率高、再生快，適合作為基因轉化受體。實施例2粘合蛋白基因克隆和植物表達載體構建
本發明所用目的基因為粘合蛋白基因根據GenBank中粘合蛋白基因ife/pi 序列，設計引物利用PCR克隆粘合蛋白基因ife//7i，連接到T載體後，測序鑑定(圖2)。將序列正確的基因經BamHI和Mil酶切回收，同時回收經EcoRI和BamHI 酶切的CaMV35S啟動子片段、SalI和I^stI酶切的NOS終止子片段，連接酶進行連接後，插入植物雙元表達載體pCAMBIA 1300多克隆位點EcoRI和I3StI之間，以得到串聯CaMV35S_ Mefp-^-NOS的植物表達載體，命名為pMF (圖3)，轉化子質粒DNA，進行酶切鑑定(圖4)。採用液氮速凍5 min，37°C水浴熱激2 min，復甦培養2小時的凍融方法將重組質粒導入農桿菌LBA4404的感受態細胞中，用於植物的遺傳轉化。同時採用凍融法將 pCAMBIA 1300導入農桿菌LBA4404中，用作後期植物遺傳轉化的陰性對照，命名為pMFck (不含基因)。實施例3轉基因菸草的獲得
對照菸草(CK)葉片在附加不同潮黴素濃度梯度(5、10、20、30、40、50mg/L)的MS分化培養基培養，根據不定芽分化及存活情況，確定轉化受體葉片對選擇劑潮黴素的敏感性為 30mg/Lo以4周齡的菸草葉片切塊(5mmX5mm)預培養0，1，2，3和4天後，進行含pMF和 pMFck植物表達載體的農桿菌轉化浸染，浸染時採用不同農桿菌濃度(0D_=0. 2、0. 4、0. 6、 0. 8、1.0)，不同浸染時間(10、15、20、25和30min)，不同誘導物乙醯丁香酮(AS)濃度(0、10、 20、30、40mg/L)，然後經共培養和篩選培養，統計菸草抗性不定芽和白化苗發生率以獲得農桿菌轉化優化的程序。轉化程序為預培養2d，農桿菌濃度為0D_=0. 6，浸染20min，不附加誘導劑AS轉化效果最好，pMF和pMFck農桿菌轉化的抗性發生率分別為56. 3%和51. 7%。預培養2d的菸草葉片用OD6tltl = 0.6的農桿菌菌液感染20min，置於MS分化培養基上共培養。5d後轉化的菸草外植體轉入MS篩選培養基上除菌並誘導抗性不定芽。選擇培養3d時，外植體邊緣開始形成不定芽(圖5 A)，但這些不定芽中的絕大多數在MS篩選培養基上繼代培養過程中逐漸白化，僅少數可以分化出再生苗(圖5 B);隨著在篩選培養基上繼代次數的增多，抗性再生苗仍呈現綠色(圖5 C)。所有處理在25士2°C、光照強度為30 50mol · πΓ2 · s—1的培養室內進行16h/ !光/暗培養，2周轉接一次，連續繼代培養。待再生綠苗生長到1 2cm高時，將其從母體上切下，隨即插入附加30mg/L潮黴素的MS生根培養基上誘導生根(圖5 D)。獲得假定的外源粘合蛋白Mefp-5基因轉化菸草再生植株。以常規CTAB法提取假定的轉基因植株基因組DNA，Trizol法提取RNA，根據Hyg、 Mefp-5基因序列設計合成PCR引物，分別對轉化菸草pMF (編號1 6)、pMFck (編號① ④)及其未轉基因的親本對照(CK)株系進行場叉截1//7-5基因的PCR、以及ife//7-5基因的RT-PCR分子生物學檢測。其中Hyg基因PCR引物上遊為5，_AGC TGC GCC GAT GGT TTC TAC AA-3，，下遊為 5，-ATC GCC TCG CTC CAG TCA ATG-3，，擴增片段長度為 509bp，擴增程序設定為94°C，預變性5min ;94°C，變性50 s ;60. 5°C，退火40 s;72°C，延伸30 s ；循環30 次；72°C，延伸 8min。4°C，保溫。基因 PCR 及 RT-PCR 引物(MF)上遊為 5，-CAA AGG TGG TTA TTA CCC-3，，下遊為 5，-AAC TGT ACC ACC TCC ATA-3，，擴增片段長度為 210bp，擴增程序設定為 94°C，預變性 5 min;94°C，l min ；56°C,30 s;72°C，30 s ；循環 30 次；72°C， 延伸5 min。4 °C，保溫。轉基因菸草中辦穿基因的PCR擴增(圖6 A)與Mefp-5基因PCR 和RT-PCR擴增(圖6 B、圖6 C)，分別可以檢測到預期的目的條帶(509bp、210bp和210bp)， 表明目的基因在菸草基因組中整合併表達，陽性轉基因植株是可表達粘合蛋白基因的菸草。 將鑑定後的陽性轉基因菸草小苗繼代擴繁，小苗高6 8cm時，打開培養瓶蓋子， 25士2°C、光照強度為30 50mol · m_2 · s—1的培養室內16h/8h光/暗培養2 3天，隨後於室溫適應1 2天正常煉苗後，移栽至花盆土中成活(圖5 E)。
權利要求
1.一種使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)植物轉化受體的獲得；(2)構建粘合蛋白基因Mefp-5基因的植物表達載體；(3)採用農桿菌介導法將Mefp-5基因轉入菸草，獲得轉基因植株。
2.根據權利要求1所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於步驟 (1)中，使用菸草種子接種在MS培養基得到無菌苗，無菌苗葉片切塊在MS分化培養基上分化不定芽，不定芽接種在MS生根培養基中生根，建立菸草離體再生體系，再生的菸草植株作為基因轉化受體。
3.根據權利要求2所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於所述的MS分化培養基為MS培養基+1. 5mg/L 6-BA ；MS生根培養基組成為MS培養基+0. 2mg/L NAA。
4.根據權利要求1所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於步驟(2) 包括以下步驟(A)利用PCR方法克隆粘合蛋白基因Mefp-5，測序鑑定；(B)粘合蛋白基因Mefp-5上遊連接CaMV35S啟動子，下遊連接NOS終止子後，形成的連接產物CaMV35S- Mefp-5-NOS插入載體pCAMBIA 1300的多克隆位點構建植物表達載體，命 SSpMF ；(C)採用凍融法將pMF和命名為pMFck的對照pCAMBIA1300導入農桿菌LBA4404中， 用於植物的遺傳轉化。
5.根據權利要求1所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於步驟(3) 包括以下步驟(A)菸草葉片切塊經農桿菌感染後，培養於MS篩選培養基中，誘導不定芽的分化；(B)篩選培養基上進行抗性篩選培養40 50d，得到假定菸草轉基因小苗；(C)對轉化菸草pMF、pMFck及其未轉基因的親本對照CK株系進行PCR、RT-PCR擴增， 證明Mefp-5在菸草基因組DNA中的整合和表達，得到可表達粘合蛋白基因的轉基因菸草。
6.根據權利要求5所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於所述的菸草葉片切塊為4周齡。
7.根據權利要求5所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於所述的篩選培養基為MS分化培養基+ 30mg/L潮黴素+ 300mg/L頭孢黴素。
8.根據權利要求5所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特徵在於步驟(A) 中農桿菌感染條件為菸草外植體預培養2d，農桿菌濃度0D_=0. 6，浸染20min，不附加誘導劑乙醯丁香酮。
全文摘要
本發明公開了一種使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，包括如下步驟(1)植物轉化受體的獲得；(2)構建粘合蛋白基因Mefp-5基因的植物表達載體；(3)採用農桿菌介導法將Mefp-5基因轉入菸草，獲得轉基因植株。本發明粘合蛋白基因Mefp-5的轉化在細胞水平上進行，提高了獲得轉基因植株的遺傳穩定性，有效避免嵌合基因植株的產生；構建的Mefp-5植物表達載體有雙子葉植物喜好的啟動子和終止子，適用於雙子葉植物的遺傳操作；本發明獲得帶有Mefp-5基因植株，表達粘合蛋白Mefp-5，為優質蛋白類粘合劑--貽貝粘合蛋白的材料來源提供一條生物技術新途徑。
文檔編號A01H5/00GK102433357SQ20111042989
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者李立文, 步懷宇, 王英娟, 趙宇瑋 申請人:西北大學