野生茄子耐鹽基因StNHXl植物表達載體的製作方法

2023-11-04 05:09:57 2

專利名稱：野生茄子耐鹽基因StNHXl植物表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及了野生茄子『Torvum Vigor』耐鹽基因Na+/H+反向轉運體(StNHXl)植 物表達載體的構建，屬於分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
土壤鹽漬化是一個世界性難題，全世界鹽漬化土面積約10億公頃；我國鹽漬土面 積約3，460萬公頃，耕地鹽鹼化760萬公頃，近1/5耕地發生鹽漬化，其中原生鹽化型、次生 鹽化型和各種鹼化型分布分別佔總面積的52%、40%和8%。鹽對於植物的毒害作用主要是由於水分虧缺導致的滲透脅迫以及過量的Na+對重 要生化過程的毒害。植物克服鹽脅迫的機制是Na+的外排和液泡區室化。質膜Na+/H+反向 轉運蛋白利用質膜H+-ATPase產生的跨膜質子梯度將Na+排出細胞，減少Na+向葉片中的長 距離轉運而保護光合組織免受鹽的毒害。液泡膜Na+/H+反向轉運蛋白則利用液泡膜質子泵 (H+-ATPase和H+-PPase)產生的跨膜質子梯度將Na+區室化進入液泡，不僅減輕了過多Na+ 的累積對細胞質的毒害，而且可以利用NaCl作為溶質維持滲透勢以驅動水分進入細胞。因 此，NaVH+反向轉運蛋白在植物耐鹽性中發揮著重要作用.

發明內容
技術問題本發明涉及野生茄子『Torvum Vigor』耐鹽基因Na+/H+反向轉運體 (StNHXl)植物表達載體的構建，屬於分子生物學領域。構建的植物表達載體導入農作物，可 增強其耐鹽性。技術方案野生茄子『Torvum Vigor』耐鹽基因Na+/H+反向轉運體植物表達載體的構建1)野生茄子『Torvum Vigor』中StNHXl耐鹽基因的克隆以野生茄子『Torvum Vigor』(為日本砧木品種，購自日本Takii種苗株式會 社)幼嫩葉片為材料，提取葉片總RNA，取2μ g總RNA反轉錄cDNA。根據番茄中耐鹽基因 NHXl (Venema K, Belver A, Marin-Manzano M C, Rodriguez-Rosales M P, Donaire J P. A novel intracellular K./H+antiporter related to Na./H+antiporters is important for K+ionhomeostasis in plants. J. Biol. Chem. 2003, 278(25) 22453-22459)白勺)ψ 列(AccessNO. :AJ306630. 1)設計引物，在『Torvum Vigor』葉片cDNA中擴增耐鹽基因 StNHXl 上遊引物F 5，-GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG-3，下遊引物R 5，-CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC-3，將PCR產物(1599bp)連接到pMD19_T載體(購自TaKaRa公司)上，命名為 pMD19-StNHXl，測序驗證；2) StNHXl基因連接至pBI121質粒BamHI/Sac I雙酶切質粒pMD19_StNHXl回收StNHXl片段，同樣雙酶切pBI121質粒(購自上海希匹吉生物技術有限公司)回收pBI121-GUS_(12947bp)；將回收的兩片段用 T4連接酶連接，命名為pl21-GUS_-StNHXl，轉化DH5a感受態細胞，後續試驗備用；3) StNHXl基因連接至pCAMBIA1301質粒構建植物表達載體Hind III/EcoR I 雙酶切 pBI121_GUS:StNHXl 回收 35S prom-StNHX 1-N0S term 片段(2685bp)，同樣雙酶切pCAMBIA1301質粒(購自澳大利亞CAMBIA公司)回收其大片段 (11786bp)；將回收的兩片段用T4連接酶連接，命名為pCAMBIA1301-StNHXl，轉化DH5a感 受態細胞(購自南京天為生物科技有限公司)後進行PCR和酶切驗證，構建成功。有益效果野生茄子『Torvum Vigor' (Solanum torvum Swartz)具有較強的耐鹽性，可在含 SOmmol化4的NaCl營養液中正常生長。為了探討植物的耐鹽機理，培育出能在鹽漬土壤中 生存的農作物新品種，將野生茄子的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因(StNHXl)轉入農作物 中，可望培育出轉基因耐鹽新品種(見參考文獻①Xue Z Y，Zhi D Y, Xue G P, Zhang H， Zhao Y X, Xia G M. Enhanced salt tolerance of transgenic wheat(Tritivumaestivum L. )expressing a vacuolar Na./H+antiporter gene with improved grain yields insaline soils in the field and a reduced level ofleaf Na+· Plant Science, 2004,167 849-859 ；(② Wu Y Y, Chen Q J, Chen M, Chen J, Wang X C. Salt-tolerant transgenic perennial ryegrass(Lolium perenne L. )obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of thevacuolar Na+/H+antipoter gene. Plant Science, 2005，169 65-73)。因此，以野生茄子為材料，利用RT-PCR技術，從中分離野生茄 子液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因，並對獲得的基因構建植物表達載體，為該基因的基因 進一步利用奠定基礎。本發明構建的野生茄子『Torvum Vigor』耐鹽基因StNHXl的植物表達載體 pCAMBIA1301-StNHXl為茄子中首次報導，可轉染其它植株，增強其耐鹽性，可進行植物品種 改良。
四

圖1植物表達載體的雙酶切鑑定1 =DNAMarker2、3 :pCAMBIA1301-StNHXl/BamHI/Sac I4 :DNA Marker5、6 :pCAMBIA1301-StNHXl/Hind III/EcoR I7 :DNA Marker圖 235S prom-StNHX 1-N0S term 示意3pCAMBIAl301-StNHXl植物表達載體質粒圖譜
五具體實施例方式野生茄子耐鹽基因StNHXl植物表達載體的構建過程1.野生茄子『Torvum Vigor』耐鹽基因StNHXl的克隆以野生茄子『Torvum Vigor』為材料(日本砧木品種，購自日本Takii種苗株式會社)，待長至八片真葉時，IOOmmol · L^1NaCl處理三天後取幼嫩葉片，按照TaKaRa公司的
TotalRNA提取試劑盒說明書提取葉片總RNA，取2 μ g總RNA反轉錄cDNA ；根據番茄耐鹽基
因 NHXl 序列(Access NO. :AJ306630. 1)設計引物上遊引物 F 5，-GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG-3，下遊引物 R 5，-CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC-3，野生茄子『Torvum Vigor，耐鹽基因StNHXl基因開放閱讀框長1599bp，以反 轉錄的cDNA為模板進行PCR反應，反應體系(20yL) :ddH20 10. 2 μ L，5 X Buffer 4μ L, dNTP (2. 5mmol · L-1) 1. 6 μ L，F、R 弓 | 物(20 μ mol · L-1)各 1 μ L，cDNA( < 1 μ g) 1 μ L，DNA STARl μ L ；擴增程序94°C預變性4min，93°C變性 30s，56. 8°C退火 30s，72°C延伸 100s，30 個 循環，72°C溫育IOmin ；將PCR產物連接到pMD19-T載體(購自TaKaRa公司)上，命名為pMD19_StNHXl， 轉化DH5ci感受態細胞(購自南京天為生物科技有限公司)，進行序列測定；2. StNHXl基因連接至pBI121質粒DBamH I/Sac I 雙酶切 pMD19_StNHXl 質粒酶切體系(50μ L) :ddH20 31. 5 μ L，10 X Buffer E 5μ L, BSAO. 5 μ L, pMD19-StNHXlplasmid 10 μ L, BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1. 5 μ L ;37°C，反應 2h ;2) BamH I/Sac I 雙酶切 pBI121 質粒酶切體系(50μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5μ L, BSA0. 5 μ L, pBI121plasmidlO μ L, BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1· 5 μ L ;37°C，反應 2h ;3)回收 pMD19-StNHXl 的 StNHXl 片段(1599bp)和 pBI121 的 pBI121_GUS-片段 (12947bp)，將回收的兩片段用T4連接酶連接連接體系(IOyL):ddH20 3 μ L，StNHXl 片斷 4 μ L，pBI121_GUS-l μ L， IOXBufferl μ L, T4 連接酶 1 μ L ;4°C，過夜連接；連接產物命名為ρ 12l-GUS_-StNHXl，轉化DH5 α感受態細胞；3. StNHXl基因連接至pCAMBIA1301質粒構建植物表達載體l)Hind III/EcoR I 雙酶切 pBI121_GUS:StNHXl酶切體系(50μL) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0· 5 μ L，plasmid 10 μ L，BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1· 5 μ L ;37°C，反應 2h ；2)Hind III/EcoR I 雙酶切 pCAMBIA1301酶切體系(50μL) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0. 5 μ L, plasmid 10 μ L, BamHI 1· 5 μ L，Sac I 1· 5 μ L ;37°C，反應 2h ;3)回收 pBI121-GUS:StNHXl 的 35S prom-StNHX 1-N0S term 片段(2685bp)和 PCAMBIA1301的pCAMBIA1301_片段(11786bp)，將回收的兩片段用T4連接酶連接連接體系(10μ L) :ddH20 3 μ L,35S prom-StNHXl-NOS term 4 μ L, ρ0ΑΜΒΙΑ130Γ1 μ L, IOXBuffer 1 μ L, T4 連接酶 1 μ L ；連接產物命名為pCAMBIAl301-StNHXl，轉化DH5 α感受態細胞後進行PCR和酶切 驗證，構建成功。綜上所述，本發明構建的野生茄子耐鹽基因StNHXl植物表達載體為茄子中首次報導，導入植物中，可增強其耐鹽性，進行植物品種改良。
權利要求
野生茄子耐鹽基因StNHX1植物表達載體，其構建方法為1)野生茄子『Torvum Vigor』中StNHX1耐鹽基因的克隆以野生茄子『Torvum Vigor』幼嫩葉片為材料，提取葉片總RNA，取2μg總RNA反轉錄cDNA，設計引物在野生茄子『Torvum Vigor』葉片cDNA中擴增StNHX1基因上遊引物F5』 GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG 3』下遊引物R5』 CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC 3』將PCR產物連接到pMD19 T載體上，命名為pMD19 StNHX1，測序驗證；2)StNHX1基因連接至pBI121質粒BamH I/Sac I雙酶切質粒pMD19 StNHX1回收StNHX1片段，同樣雙酶切pBI121質粒回收pBI121 GUS ；將回收的兩片段用T4連接酶連接，命名為p121 GUS StNHX1，轉化DH5α感受態細胞；3)StNHX1基因連接至pCAMBIA1301質粒構建植物表達載體HindIII/EcoR I雙酶切pBI121 GUS StNHX1回收35S prom StNHX1 NOS term片段，同樣雙酶切pCAMBIA1301質粒回收其大片段；將回收的兩片段用T4連接酶連接，命名為pCAMBIA1301 StNHX1，轉化DH5α感受態細胞後進行PCR和酶切驗證，構建成功。
2.權利要求1所述植物表達載體pCAMBIA1301-StNHXl在提高作物的耐鹽性方面的應用。
全文摘要
本發明涉及野生茄子『Torvum Vigor』(Solanum torvum Swartz)Na+/H+反向轉運體耐鹽基因(Na+/H+antiporter gene，StNHX1)植物表達載體的構建，屬於分子生物學領域。根據番茄(Solanum lycopersicum)NHX1基因序列，設計引物在野生茄子中擴增StNHX1基因(含有BamH I、Sac I酶切位點)，將StNHX1片段替換pBI121的GUS CDS，酶切pBI121載體後將35S prom-StNHX1-NOS term片段連接到pCAMBIA1301質粒，構建成植物表達載體pCAMBIA1301-StNHX1。該植物表達載體轉化大豆後將會提高其耐鹽性，對提高我國大豆分子育種的技術水平具有重要理論和實踐意義。
文檔編號C12N15/82GK101955972SQ20101050181
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月11日 優先權日2010年10月11日
發明者朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰, 陳國戶 申請人:南京農業大學