一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑及其測定方法
2023-11-03 13:48:12 1
專利名稱：一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑及其測定方法
技術領域：
本發明涉及血漿樣本纖維蛋白原(FIB)含量的測定試劑及其測定方法，屬於臨床檢測試劑及檢測方法技術領域。
背景技術：
血漿纖維蛋白原(FIB)定量測定是臨床上廣泛進行的血凝四項之一(即PT、TT、FIB和APTT)。馮·克勞斯(von Clauss)FIB測定方法屬於功能法測定，是美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的方法。該法的原理是，高濃度凝血酶與低濃度FIB血漿反應，FIB含量與血凝時間成反比。通過在雙對數坐標紙上所做的標準曲線可以查出待測血漿的FIB含量。然而該法存在兩個缺點一、必須使用高濃度的凝血酶，通常為100～200單位/毫升；二、待測血漿必須提前稀釋5～30倍，降低其中的FIB含量。所以，該法成本較高，操作繁瑣，特別是稀釋血漿過程容易產生誤差。美國專利5,292,664和6,448,024通過在高濃度凝血酶溶液中添加凝血酶抑制劑，製成凝血活性降低了的FIB試劑，從而達到直接測定樣本中FIB含量的目的。但該法仍未解決FIB試劑的高成本問題。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術中的缺點，而提供一種測定方法簡便、測量準確度高、成本低的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑及其測定方法。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案一、本發明的試劑的技術方案，配製本試劑的原料組成及其含量如下凝血酶每毫升本試劑含2-20單位緩衝劑每升本試劑含5-100毫摩爾穩定劑每100毫升本試劑含0.05-10克去離子水餘量。
所述的凝血酶採用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者採用基因重組或化學修飾的凝血酶製品。
所述的緩衝劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩衝液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
所述的穩定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、胺基酸、蛋白質；各種穩定劑的含量如下無機鹽 每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類 每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物每100毫升本試劑含0.1-10克胺基酸 每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質 每100毫升本試劑含0.05-2克。
所述的無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；所述的有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；所述的多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；所述的胺基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述的蛋白質選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
本試劑(以下簡稱FIB試劑)的理論根據如下本申請人在試驗中發現，由低濃度凝血酶組成的FIB試劑(每毫升含2～20個單位的凝血酶)與高濃度FIB血漿(即未經稀釋的正常血漿)反應，FIB含量仍與血凝時間成反比；用低濃度凝血酶配製FIB試劑和高濃度FIB血漿所製作的標準曲線與用高濃度凝血酶配製的FIB試劑與低濃度FIB血漿所製作的標準曲線具有同樣好的線性相關(相關係數R2大於0.98)。所以用低濃度凝血酶配製的FIB試劑，無需稀釋血漿即可直接測定樣本的FIB含量。
二、本發明的測定方法的技術方案如下(1)用含穩定劑的緩衝液配製每毫升含2-20單位凝血酶的本試劑；本試劑的PH值範圍為PH7.0-8.0；(2)用配製好的本試劑按常規方法繪製標準曲線；(3)測定方法a、將本試劑及血漿樣本分別於37℃溫育後，按1∶1的體積比混合；b、記錄血凝時間；c、通過標準曲線求出血漿樣本的纖維蛋白原含量。
所述的凝血酶採用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者採用基因重組或化學修飾的凝血酶製品。
所述的緩衝劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩衝液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
所述的穩定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、胺基酸、蛋白質；所述的各種穩定劑的含量如下無機鹽 每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類 每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物每100毫升本試劑含0.1-10克胺基酸 每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質 每100毫升本試劑含0.05-2克。
所述的無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；所述的有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；
所述的多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；所述的胺基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述的蛋白質選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
本發明的測定方法的具體方案如下FIB試劑用前先於37℃溫育5分鐘，使本試劑達到所需溫度。將50μl血漿加入血凝儀的比色杯中，37℃溫育1分鐘，立即添加50μl已預熱至37℃的FIB試劑，記錄血凝時間，改變FIB試劑中的凝血酶濃度使正常樣本(FIB含量為200～400mg/dl)的血凝時間達到6～80秒，更好是10～50秒，最好是15～30秒。
標準曲線製作將參比血漿用咪唑緩衝液進行對倍稀釋，使FIB含量分別達到適宜的濃度梯度，如600mg/dl，300mg/dl、150mg/dl和100mg/dl，分別取此不同濃度的參比血漿50μl於血凝儀的比色杯中，37℃溫育1分鐘，立即添加50μl預熱至37℃的FIB試劑，記錄血凝時間(s)。以參比血漿的FIB含量(mg/dl)為縱坐標，以相應的血凝時間(s)為橫坐標，在雙對數坐標紙上作標準曲線；或用excel軟體進行線性回歸處理和作圖(見圖1)。
在同樣條件下，待測血漿樣本直接與FIB試劑反應，根據其血凝時間(s)，即可在標準曲線上查出相應的FIB含量(mg/dl)。如果將定標點的FIB含量和對應的血凝時間(s)依次輸入全自動或半自動血凝儀，測定結束時，儀器將自動給出待測血漿樣本的FIB含量(mg/dl)。
本發明的有益效果如下(1)測定時不用稀釋血漿樣本，使測定方法簡便。
(2)與臨床常用的clauss FIB試劑相比(其凝血酶濃度通常為每毫升含100～200個單位)大大降低了凝血酶用量，從而降低了本試劑的製造成本。
(3)提高了測量的準確度，減少了操作誤差。這一優點體現在以下3個方面a、使用液體試劑，無需復溶，不存在瓶間差問題；b、省去了測定過程中的血漿樣本稀釋步驟，避免了稀釋過程產生的誤差；c、製作標準曲線所用定標點的FIB含量涵蓋了正常血漿FIB含量範圍(200～400mg/dl)，避免了稀釋血漿引起的生理環境變化，因而更符合功能測定方法的要求。
圖1為用本發明的FIB試劑所作的FIB標準曲線。
具體實施例方式
一、本發明試劑的實施例如下表
注(1)上表中的凝血酶採用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者採用基因重組或化學修飾的凝血酶製品。
(2)上表中的緩衝劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩衝液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
(3)上表中的穩定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、胺基酸、蛋白質；各種穩定劑的含量如下無機鹽 每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類 每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物每100毫升本試劑含0.1-10克胺基酸 每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質 每100毫升本試劑含0.05-2克。
在實施例1中，用1種穩定劑；在實施例2中，用2種穩定劑；
在實施例3中，用3種穩定劑；在實施例4中，用4種穩定劑；(4)在上表中，所述的無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；所述的有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；所述的多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；所述的胺基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述的蛋白質選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
二、本發明測定方法的實施例實施例5本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例1要求稱取0.61克的TRIS(5mmol/L相當的克數)；然後用800毫升去離子水溶解，調PH7.35，最後用去離子水定容1立升。
(2)將上述溶液轉入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒0.5克牛血清白蛋白和2000單位的牛凝血酶凍乾粉，靜置不動，待乾粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，並經細菌漏鬥過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(TRIS 5mmol/L，牛凝血酶2單位/毫升)，2～8冰箱內放置，臨用前於37℃溫育5分鐘。
(3)向血凝儀比色杯中添加37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為26.6s。血漿用咪唑緩衝液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為27.2s和28.0s。用excel軟體進行線性回歸處理，R2＝0.9944。
實施例6本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例2要求稱取4.8克HEPES(相當於含HEPES 20mmol/L)，15克氯化鈉，15克山梨酸鉀；然後用800毫升去離子水溶解，調PH7.0，定容到1立升。
(2)將上述溶液轉入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒5000單位凝血酶凍乾粉，靜置不動，待乾粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，並經細菌漏鬥過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(含HEPES 20mml/L，人凝血酶5單位/毫升)，2～8℃冰箱內放置，臨用前於37℃溫育5分鐘。
(3)向血凝儀比色杯中添加37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為12.1s。血漿用咪唑緩衝液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為15.0s和18.3s。用excel軟體進行線性回歸處理，R2＝0.9995。
實施例7本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例3要求稱取14.4克磷酸氫二鈉(PB)，2.4克磷酸二氫鉀(PB)，9克硫酸鈉，50克甘氨酸；然後用800毫升去離子水溶解，調PH7.35，定容到1立升。
(2)將上述溶液轉入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒1克明膠和10000單位重組人凝血凍乾粉，靜置不動，待乾粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(含PB 60mmol/L，重組人凝血酶10單位/毫升)，2～8冰箱內放置，臨用前於37℃溫育5分鐘。
(3)向凝血儀比色杯中添加於37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為13.7s。血漿用咪唑緩衝液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為18.7s和26.3s。用excel軟體進行線性回歸處理，R2＝0.9993。
實施例8本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例4要求稱取22.5克MOPSO(相當於100mmol/L)，25克溴化鈉，10克賴氨酸，15克丙酸鈉，50克甘油；然後用800毫升去離子水溶解，調PH8.0，最後用去離子水定容1立升。
(2)將上述溶液轉入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒20000單位豬凝血凍乾粉，靜置不動，待乾粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(含MOPSO 100mmol/L，豬凝血酶20單位/毫升)，2～8冰箱內放置，臨用前於37℃溫育5分鐘。
(3)向凝血儀比色杯中添加於37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為7.3s。血漿用咪唑緩衝液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為11.1s和18.0s。用excel軟體進行線性回歸處理，R2＝0.9983。
權利要求
1.一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特徵在於配製本試劑的原料組成及其含量如下凝血酶每毫升本試劑含2-20單位緩衝劑每升本試劑含5-100毫摩爾穩定劑每100毫升本試劑含0.05-10克去離子水餘量。
2.根據權利要求1所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特徵在於所述的凝血酶採用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者採用基因重組或化學修飾的凝血酶製品。
3.根據權利要求2所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特徵在於所述的緩衝劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩衝液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
4.根據權利要求3所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特徵在於所述的穩定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、胺基酸、蛋白質；各種穩定劑的含量如下無機鹽每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物 每100毫升本試劑含0.1-10克胺基酸每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質每100毫升本試劑含0.05-2克。
5.根據權利要求4所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特徵在於無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；蛋白質選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
6.一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特徵在於(1)用含穩定劑的緩衝液配製每毫升含2-20單位凝血酶的本試劑；本試劑的PH值範圍為PH7.0-8.0；(2)用配製好的本試劑按常規方法繪製標準曲線；(3)測定方法a、將本試劑及血漿樣本分別於37℃溫育後，按1∶1的體積比混合；b、記錄血凝時間；c、通過標準曲線求出血漿樣本的纖維蛋白原含量。
7.根據權利要求6所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特徵在於所述的凝血酶採用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者採用基因重組或化學修飾的凝血酶製品。
8.根據權利要求7所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，所述的緩衝劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩衝液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
9.根據權利要求8所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特徵在於所述的穩定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、胺基酸、蛋白質；各種穩定劑的含量如下無機鹽每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物 每100毫升本試劑含0.1-10克胺基酸每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質每100毫升本試劑含0.05-2克。
10.根據權利要求9所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特徵在於無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；多羥基化合物選項自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；蛋白質選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
全文摘要
本發明涉及一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑及其測定方法，配製本試劑的原料組成及其含量如下凝血酶每毫升本試劑含2－20單位；緩衝劑每升本試劑含5－100毫摩爾；穩定劑每100毫升本試劑含0.05－10克；去離子水餘量。本發明的測定方法如下(1)用含穩定劑的緩衝液配製每毫升含2－20單位凝血酶的本試劑；(2)測定方法a.將本試劑及血漿樣本分別於37℃溫育後，按1∶1的體積比混合；b.記錄血凝時間；c.通過標準曲線求出血漿樣本的纖維蛋白原含量。本發明的有益效果是測定時不用稀釋血漿樣本，使測定方法簡便；降低了本試劑的製造成本；提高了測量的準確度，減少了操作誤差。
文檔編號G01N33/86GK101059521SQ200710062020
公開日2007年10月24日 申請日期2007年5月30日 優先權日2007年5月30日
發明者靜天玉 申請人:保定天嶽生物工程有限公司