一種腦中風相關位點檢測方法
2023-12-01 13:59:26
專利名稱：：一種腦中風相關位點檢測方法
技術領域：
：本發明涉及疾病相關位點檢測
技術領域：
，更具體地，涉及腦中風相關位點檢測方法
技術領域：
，特別是指一種腦中風相關位點檢測方法。
背景技術：
：腦中風(Stroke)主要是指供應腦的動脈發生粥樣硬化，引起血管堵塞、狹窄或破裂，造成部分腦組織的損害。它是由腦血管病變引起的腦部疾病的總稱，故又稱為"腦血管病"、"腦血管意外"或"腦卒中"。主要分為出血性腦中風(腦出血或蛛網膜下腔出血)和缺血性腦卒中(腦梗塞、腦血栓形成)二大類，以腦梗塞最為常見。腦中風具有發病急、來勢兇的特點，具有極高的病死率(急性期30%)和致殘率(76%)，是世界上最重要的致死性疾病之一，在我國每年腦中風的發病人數約有200萬人以上。由於一直缺乏有效的治療措施，目前認為預防是最好的措施。腦中風是多基因、多因素的疾病。到目前為止的人類基因組學研究結果顯示，多個基因中的變異位點，導致了人與人之間罹患腦中風遺傳風險性的不同。已知的基因包括strok-l，strok-2等。strok-l是同型半胱氨酸代謝中的關鍵酶之一，strok-l基因的變異會引起高半胱氨酸血症，而高半胱氨酸血症在動脈粥樣硬化和腦血管病的發病機制中起重要作用。strok-2基因的表達產物具有舒張血管、抑制血小板的黏附和聚集和抑制血管平滑肌細胞增殖等功能。這些基因中的特定變異位點均構成腦血管病的危險遺傳因素。通過檢測個體該類變異位點的基因型，即可預測腦中風發病風險。中風是完全能夠預防的。只要飲食合理，注意控制血壓，多參加有利於身體健康的活動，加強對相關疾病的防治，可以將中風的發生率降低到最低限度，這就是一級預防。儘管我們目前還不能全面說出死亡率下降的所有原因，但毫無疑問中風病人死亡率下降與近年來重視中風的預防有關。因此，為了更早地預防腦中風的發生，需要在腦中風發生前就提前通過基因檢測準確篩查出高風險人群，並對這一人群進行有針對性的健康管理，才能做到真正的早預防，再結合其它手段定期檢測，真正實現腦中風的早發現、早治療，以達到提前進行個性化預防的目的。
發明內容本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種腦中風相關位點檢測方法，該檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，為是否進一步採取有針對性的健康管理以及後續的檢測手段提供參考依據。為了實現上述目的，本發明採用的技術方案如下該腦中風相關位點檢測方法，其特點是，包括步驟a.提取來自人的樣本的基因組DNA;b.根據至少2個腦中風相關基因分別設計一對T叫man探針對和一對引物對，所述T叫man探針對的5'端和3'端分別標記螢光報告基團和螢光淬滅基團，分別對所述基因組DNA進行螢光定量PCR擴增；c.根據螢光定量PCR擴增結果來判斷所述腦中風相關基因是否發生突變。較佳的，所述腦中風相關基因的數目是4個。更佳的，所述腦中風相關基因是MTHFR基因、ENOS基因、PDE4D基因和PONl基因。更進一步地，所述Taqman探針對和所述引物對用於檢測MTHFR基因的rsl801133位點，ENOS基因的rs1799983位點，PDE4D基因的rs702553位點，P0N1基因的rs622位點。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和HEX標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和VIC標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDN0:9和SEQIDNO:IO所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和TET標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDNO:13和SEQIDN0:14所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和TET標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。本發明的創新點在於幾個腦中風有關的侯檢位點的整合，通過選取多個腦中風的侯檢位點，根據MTHFR基因、ENOS基因、PDE4D基因和PONl基因設計特異性引物和Taqman探針對來自人的樣本的基因組DNA進行螢光定量PCR擴增，根據產生的螢光的量和螢光的種類可以知道侯檢位點的基因型，設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，將基因體檢的結果作為腦中風健康管理的主線，監控疾病的發生發展。如果是腦中風遺傳風險度高的人群，建議減少一切腦中風的外在致病因素，並每半年進行一次檢查，做到早預防，早發現，早治療，延緩甚至避免疾病的發生。具體實施例方式為更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例作進一步說明。1.基因組DNA提取1.l試劑和儀器1.1.1試劑和耗材基因組DNA抽提試劑盒(TIANampBLOODDNAkit,DP318-03;TIANampMicro微量樣品基因組DNA提取試劑盒，DP316;TIANamp口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，DP322-03)含細胞裂解液CL;緩衝液GA;緩衝液GS;緩衝液GB;緩衝液GD;漂洗液PW;洗脫緩衝液TB;CarrierRNA;RNase-freeddH20;蛋白酶K(20mg/ml);吸附柱；收集管(2ML);1.5ML無菌收集管；無水乙醇。1.1.2儀器DENVILLE260離心機，XW-80A旋渦混合器，H.H.S指針式電熱恆溫水浴鍋。1.2提取步驟從全血中提取基因組DNA1.2.1取200ill的抗凝全血至1.5ml的E卯endorf管中，如果樣本的量少於200iil，則加入緩衝液GS補充至200ia。如果樣本量多於200iil，需要用細胞裂解液CL處理，具體步驟如下在樣品中加入1-2.5倍體積的細胞裂解液CL，顛倒混勻，10，OOOrpm離心1分鐘，吸取上清，留下細胞核沉澱(如果裂解不徹底，可重複以上步驟一次)，向離心收集到的細胞核沉澱中加200iU緩衝液GS，振蕩至徹底混勻。1.2.2加入20ill的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200y1的緩衝液GB，立刻充分顛倒混勻。56t:水浴樣本10分鐘，水浴過程中請每隔3分鐘上下輕柔顛倒混勻樣本，溶液應變清亮。(如溶液未徹底變清亮，可延長裂解時間至溶液變清亮為止)。1.2.3加入200y1無水乙醇，充分顛倒混勻，這時可能會出現絮狀沉澱。1.2.4將上一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.5向吸附柱中加入500iU緩衝液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.6向吸附柱中加入700iil漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.7向吸附柱中加入500iil漂洗液PW，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。1.2.8將吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。吸附柱置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。1.2.9將吸附柱轉入一個乾淨的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200ii1洗脫緩衝液TB，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。注意洗脫緩衝液體積不應少於50iU，體積過小影響回收效率。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘。洗脫液的pH對於洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍內(可以用NaOH將水的pH值調到此範圍)，pH值低於7.0會降低洗脫效率；且DNA產物應保存在_20°C，以防DNA降解。2.Taqman探針法檢測侯檢位點2.1實驗試劑及儀器2.1.1實驗試劑螢光定量試劑:ABITaqMan2XPCRMastermix(P/N:4326614，Lot:G15502)。普通PCR試劑寶生物工程(大連)有限公司的ExTaqDNA聚合酶(P/N:DRR100B，Lot:CKA1801A)。2.1.2實驗儀器ABI9700型PCR儀和ABI7900HT型螢光定量PCR儀。2.1.3檢測位點探針及引物表tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage72.2.3根據反應過程中釋放的螢光的量和螢光的種類來判斷對應候選位點的基因型。3.結果分析根據最終終點讀板結果分型圖進行分析，結果如下反應1:用於檢測MTHFR基因的rsl801133位點，該候檢位點在人群中有三種基因型CC，TT和CT，其中攜帶CC基因型為正常人群，攜帶TT和CT基因型的人群較攜帶CC基因型的人群有較高的風險罹患腦中風，患病風險機率大小TT型>CT型>CC型，分型圖分析結果表明rsl801133位點為CT，非正常基因型；反應2:用於檢測ENOS基因的rsl799983位點，該候檢位點在人群中也有三種基因型GG，TT和GT，其中攜帶GG基因型為正常人群，攜帶TT和GT基因型的人群較攜帶GG基因型的人群有較高的風險罹患腦中風，患病風險機率大小TT型>GT型>GG型，分型圖分析結果表明rsl799983位點為GG，正常基因型；反應3:用於檢測PDE4D基因的rs702553位點，該候檢位點在人群中也有三種基因型TT，AA和TA，其中攜帶TT，TA基因型為正常人群，攜帶AA基因型的人群較攜帶TT和TA基因型的人群有較高的風險罹患腦中風，患病風險機率大小AA型>TA型和TT型，分型圖分析結果表明rs702553位點為AA，非正常基因型；反應4:用於檢測P0N1基因的rs622位點，該候檢位點在人群中也有三種基因型AA，GG和GA，其中攜帶AA基因型為正常人群，攜帶GG和GA基因型的人群較攜帶AA基因型的人群有較高的風險罹患腦中風，患病風險機率大小GG型>GA型>AA型，分型圖分析結果表明rs622位點為GG，非正常基因型；根據上述檢測結果，可以判斷上述受檢的MTHFR基因、PDE4D基因和P0N1基因異常，僅ENOS基因正常，受檢者較正常人患腦中風的機率要高不少，其患腦中風的遺傳傾向屬於中度風險人群，需要進行專門的針對性的健康管理，但是是否已經患有腦中風，還需要進行進一步的檢查，因為其與多種因素有關。如果其中沒有基因異常，則基本無需進行專門的針對性的健康管理，但是如果其中更多個基因異常，那麼就更需要進行進一步的腦中風檢查以確定是否已經患有腦中風，並進行專門的針對性的健康管理。綜上所述，本發明的腦中風相關位點檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，為是否進一步採取有針對性的健康管理以及後續的檢測手段提供參考依據。需要說明的是，在本發明中提及的所有文獻在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，以上所述的是本發明的具體實施例及所運用的技術原理，在閱讀了本發明的上述內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改而不背離本發明的精神與範圍，這些等價形式同樣落在本發明的範圍內。序列表7〈110〉上海基康生物技術有限公司〈120〉一種腦中風相關位點檢測方法〈160>16〈210>1〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(22)〈223〉根據人MTHFR基因序列設計的Taqman探針〈400>1gtctgcgggagccgatttcatc22〈210>2〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈222〉(1).(24)〈223〉根據人MTHFR基因序列設計的Taqman探針〈400>2tgtctgcgggagtcgatttcatca24〈210>3〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據人MTHFR基因序列設計的上遊引物〈400>3ggctgacctg朋gc3cttgaa21〈210>4〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature:0103]〈222〉(1).(17):0104]〈223>根據人MTHFR基因序列設計的下遊引物:0105]〈400〉4:0106]tgcccatgtcggtgcat17:0107]〈210〉5:0108]〈211〉25:0109]人工序列:0川]〈220〉:0112]〈221〉misc_feature:0113]〈222〉(1)...(25):0114]〈223〉根據人ENOS基因序列設計的Taqman探針:0115]6:0118]〈211〉24:0119]〈212〉DNA:0120]〈213〉人工序列:0121]〈220〉:0122]〈221>misc_feature:0123]〈222〉(1).(24):0124]〈223〉根據人ENOS基因序列設計的Taqman探針:0125]〈400〉6:0126]ccagatgagcccccagaactcttc24:0127]19:0129]〈212>DNA:0130]〈213〉人工序列:0131]〈220〉:0132]〈221〉misc_feature:0133]〈222〉(1).(19):0134]〈223>根據人ENOS基因序列設計的上遊引物:0135]〈400>7:0136]aggaaacggtcgcttcgac19:0137]〈210〉8〈211〉21人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1)..(21)〈223〉根據人ENOS基因序列設計的下遊引物8ccttcttgagaggctcaggga21〈210>9〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈22l>misc—feature〈222>(1)..(21)根據人PDE4D基因序列設計的Taqman探針〈400>9ttcctacatgtttaacatgta21〈210>1021〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據人PDE4D基因序列設計的Taqman探針〈400>10ttcctacatgattaacatgta21〈210>11〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈222〉(1).(24)〈223〉根據人PDE4D基因序列設計的上遊引物〈400>11attatgccacattcttgctcaaag24〈210>12〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列說明書〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(23)〈223〉根據人PDE4D基因序列設計的下遊引物〈400〉12g朋gtegtgggaccaggatc3朋23〈210>13〈211〉19〈212〉DNA人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(19)〈223〉根據人PONl基因序列設計的T叫man探針13ctacttacaatcctgggag1914cctacttacgatcctg16〈210〉15〈211〉25DNA〈213〉人工序列〈22l〉misc—feature〈222〉(1).(25)〈223〉根據人PONl基因序列設計的上遊引物〈400>15cacttttatggcacaaatgatcact25〈210〉16〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222>(1)...(20)根據人PONl基因序列設計的下遊引物〈400〉16tgccaccactcgaacttcac20權利要求一種腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，包括步驟a.提取來自人的樣本的基因組DNA；b.根據至少2個腦中風相關基因分別設計一對Taqman探針對和一對引物對，所述Taqman探針對的5』端和3』端分別標記螢光報告基團和螢光淬滅基團，分別對所述基因組DNA進行螢光定量PCR擴增；c.根據螢光定量PCR擴增結果來判斷所述腦中風相關基因是否發生突變。2.根據權利要求1所述的腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，所述腦中風相關基因的數目是4個。3.根據權利要求2所述的腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，所述腦中風相關基因是MTHFR基因、ENOS基因、PDE4D基因和P0N1基因。4.根據權利要求3所述的腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，所述T叫man探針對和所述引物對用於檢測MTHFR基因的rsl801133位點，ENOS基因的rsl799983位點，PDE4D基因的rs702553位點，P0N1基因的rs622位點。5.根據權利要求1所述的腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，所述T叫man探針對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和HEX標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:3禾PSEQIDNO:4所示的核苷酸序列。6.根據權利要求1所述的腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，所述T叫man探針對是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和VIC標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:7禾PSEQIDNO:8所示的核苷酸序列。7.根據權利要求1所述的腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，所述Taqman探針對是SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和TET標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。8.根據權利要求1所述的腦中風相關位點檢測方法，其特徵在於，所述Taqman探針對是SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和TET標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDN0:15和SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。全文摘要本發明涉及一種腦中風相關位點檢測方法，包括步驟提取來自人的樣本的基因組DNA；根據至少2個腦中風相關基因分別設計一對Taqman探針對和一對引物對，所述Taqman探針對的5』端和3』端分別標記螢光報告基團和螢光淬滅基團，分別對所述基因組DNA進行螢光定量PCR擴增；根據螢光定量PCR擴增結果來判斷所述腦中風相關基因是否發生突變，較佳的，所述腦中風相關基因的數目是4個，是MTHFR基因、ENOS基因、PDE4D基因和PON1基因，本發明的檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，為是否進一步採取有針對性的健康管理以及後續的檢測手段提供參考依據。文檔編號C12Q1/68GK101760530SQ20081020822公開日2010年6月30日申請日期2008年12月26日優先權日2008年12月26日發明者趙翊均,陳奕雄申請人:上海基康生物技術有限公司