固相白色氨基反射層樣品池製造方法
2023-07-05 06:59:31 1
專利名稱：：固相白色氨基反射層樣品池製造方法
技術領域：
：本發明屬於固相白色氨基反射層樣品池製造方法。
背景技術：
：固相免疫分析、親和層和固相酶等技術都需要將生物活性物質(免疫配基、核酸、酶等)結合於惰性大分子材料，如瓊脂糖、纖維素、尼龍及各種塑料表面；其中聚苯乙烯(PS)因原料來源容易，物理、化學性質穩定，易於加工成型等，使其應用最為普遍。結合於固相表面分子的數量及生物活性或親和力是影響提高免疫分析檢測靈敏度的因素之一(半抗原，蛋白質和核酸聚與修飾的苯乙烯固相的共價連接，免疫學方法雜誌，CovalentLinkingofhaptens，proteinandnucleicacidtoamodifiedpolystyrenesupport.JImmunolMethods1993.159177-187)。物理吸附法由於吸附後分子活性降低，且經長期保存及操作中的多次衝洗髮生分子脫落，致使其靈敏度、重複性及穩定性明顯降低。自上世紀70年代，人們採用各種化學和物理方法將生物分子共價結合於固相，包括將塑料經過化學修飾成活性基團(氨基，羧基和硫氫基)，活性基團移植和活性分子與聚苯乙烯共聚等方法，但由於聚苯乙烯表面的氫鍵非常穩定，許多結果不甚理想。有的雖然已形成商品，但由於成本高出常規材料數倍，不適合普遍應用，所以現在常規應用的ELSIA固相仍然採用物理吸附法(用於免疫分析的蛋白質與塑料表面共價連接技術，免疫方法學雜誌，1987，98129-135Covalentbindingofproteintograftedplasticsurfacessuitablesuitablesuitablesuitablefor.Immunol.Methods.1987，98129-135)。因此，研製適於常規應用含活性基團的固相材料成為提高超微量免疫分析靈敏度的關鍵技術之一。尼龍(聚己內醯胺)作為可游離出自由氨基的多氨，很早就引起人們的關注。但多數研究都集中於預先將生物分子結合與尼龍膜上之後再覆蓋於聚苯乙烯(PS)微孔板(嗜熱菌蛋白酶固定在聚醯胺上，生物技術和生物工程2003，82(2)190-199。ImmobilizationofThermolysintopolyamideNonwovenMaterials.Biotechnol.andBioeng.2003，82(2)190-199)。不適合做ELSIA固相樣品池。關於將尼龍結合於聚苯乙烯為樣品池的報導(半抗原結合的尼龍塗布於聚苯乙烯板作為酶聯免疫分析固相，免疫方法學雜誌1990，12743-49.Haptenatednylon-coatedpolystyreneplatesasasolidphaseforELSIA.J.ImmunolMethods.1990，12743-49)，由於採用靜止狀態下的自然結合，被證明結合不均勻，不能耐受尼龍水解釋放氨基的強酸處理以及化學偶聯中的有機溶劑，導致聚苯乙烯(PS)表面被侵蝕、破壞，不適合於做常規固相材料。
發明內容為了提高超微量免疫分析靈敏度，研製適於固相時間分辨螢光免疫分析應用的固相材料，解決以反射代替透射、將化學共價結合代替物理吸附等技術問題，本發明提供了一種在聚苯乙烯微孔板的表面固定一層白色不透明的尼龍層，經化學修飾後作為DSLFIA技術中使用的固相白色氨基反射層樣品池的製造方法。本發明的方法提供的固相白色氨基反射層樣品池的結構如圖1所示。它是一個有底的圓臺型或圓柱型的杯狀體；是由基體1、中層2、內表面層3構成；所述的基體1是聚苯乙烯(PS)微孔板，中層2是聯結於基體1聚苯乙烯(PS)微孔板的內表面的nylon-6膜層，內表面層3是與中層2的nylon-6膜層以共價結合的多胺基層；所述的基體1聚苯乙烯(PS)微孔板的內表面和中層2的nylon-6膜層的聯結是用吡啶/丙酮預先活化處理基體1的內表面，用乙酸/間甲酚/吡啶溶解、活化nylon-6，使兩者之間發生疏水性相互作用，同時吡啶兼有活化PS和溫和的「侵蝕」作用，可使nylon-6快速牢固地聯結於PS微孔板的內表面而形成內表面層2；對內表面層2的尼龍層進行烷基化處理，可使nylon-6表面生成的烷基-OR很容易地與2，6-二氨基己酸的一個氨基共價結合，形成另一端游離氨基的手臂，該「手臂」的游離氨基能與蛋白質的游離氨基形成較牢固的共價結合的內表面層3是多胺基層，於是得到固相白色不透明反射式樣品池。下面再詳細介紹本發明的製造固相白色氨基反射層樣品池方法的步驟和條件，以便對本發明作進一步地說明。本發明所用試劑A.基體1活化劑6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液(V/V)。B.中層2的nylon-6的活化劑(0.5-0.9％吡啶)的乙酸/間甲酚溶液(V/V)。C.環氧氯丙烷的乙醚溶液環氧氯丙烷與乙醚溶液體積比為1∶9。D.三乙基氧嗡四硼酸脂(TOTFB)試劑製備40ml5％(v/v)三氟化硼乙醚(v/v)溶液在持續攪拌下，加入12.5ml的環氧氯丙烷的乙醚溶液，在30分鐘內加完，之後加熱回流一小時，室溫再攪拌3小時，濾出TOTFB，再用無水乙醚衝洗3次，得到的TOTFB。其產率為90％--95％以上。E.TOTFB二氯甲烷溶液含0.01-0.05g/mlTOTFB三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)二氯甲烷溶液。F.戊二醛液將0.5M戊二醛液以5％(v/v)相溶於0.2M硼酸鹽緩衝溶液(pH＝7.6)。G.1，6己二胺溶液濃度為0.5M1，6己二胺的(pH＝9.5)的碳酸鹽緩衝溶液。本發明製備方法的步驟和條件(1).nylon-6與PS基體1的連接向由PS基體1孔內加入基體1活化劑，室溫放置1-3分鐘，棄去溶液後立即加入含12-18％聚醯胺-6粉的中層2nylon-6的活化劑，沿中軸線慢速旋轉基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結合於基體1孔的內表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的固相白色氨基反射層樣品池中層2的膜層；(2).尼龍膜表面烷基化加入TOTFB二氯甲烷溶液上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷衝洗2次，用二氧六環衝洗1次；(3).修飾尼龍膜表面將戊二醛溶液加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去，加入0.2MpH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩衝溶液衝洗三次，再加入1，6己二胺(pH＝9.5)溶液，室溫放置3小時，倒掉，然後用PBS溶液衝洗3次，即得固相白色氨基反射層樣品池。本發明的製備方法的相關的反應過程如下上述的過程說明為使已結合於PS表面nylon-6聚己內醯氨結構游離出活性基團，採用自合成的三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)烷化處理微孔板內表面的尼龍層，不影響nylon-6結構，且能充分暴露活性基團用戊二醛連接1，6-己二胺，即接長「手臂」，提高了游離氨基反應機率。利用戊二醛雙功能團作用，一端結合「手臂」上的游離氨基，另一端游離的醛基結合蛋白質的游離氨基，形成交牢固的共價結合。1.採用吡啶/丙酮預先活化處理PS表面，用乙酸/間甲酚/吡啶溶解、活化尼龍，使兩者之間發生疏水性相互作用。同時吡啶兼有活化PS和溫和的「侵蝕」作用，可使nylon-6快速牢固的結合於PS表面。2.為使nylon-6聚己內醯氨結構游離出活性基團，以往用鹽酸部分水解法，由於過度水解會使nylon結構斷裂，控制水解時間又導致游離氨基暴露不充分，故採用自己合成的三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)烷化處理微孔板內表面的尼龍層，不影響nylon-6結構，且能充分暴露活性基團後者用戊二醛很容易聯結1，6-己二胺，即接長「手臂」。3.利用戊二醛雙功能團作用，一端結合「手臂」上的游離氨基，另一端游離的醛基結合蛋白質的游離氨基，形成牢固的共價結合。本發明的技術特點和效果1.利用nylon-6結合於PS的內表面的固相白色氨基反射層樣品池，採用新的溶解多氨技術和特定的PS活化劑、多氨凝固劑，使多胺均勻、牢固移植於nylon-6的表面，形成白色反射光的多胺基內層。2.該多胺內表面固相在室溫暴露空氣中能長期保存並能耐受強酸、鹼、有機溶劑不變形、不脫落。為使nylon-6聚己內醯氨結構游離出活性基團，以往用鹽酸部分水解法，由於過度水解會使nylon結構斷裂，控制水解時間又導致游離氨基暴露不充分，故採用TOTFB烷化處理尼龍層。該法不會影響nylon-6結構，且能充分暴露活性基團利用戊二醛雙功能團作用，一端結合「手臂」上的游離氨基，另一端游離的醛基結合蛋白質的游離氨基，提高結合免疫配基的活性。3.採用吡啶代替二氯甲烷。因為吡啶不但揮發慢而且能促進溶解狀態的nylon聚集及與PS的結合，在PS表面形成均勻、堅韌、不能透過有機溶劑的薄膜；並在其與PS結合時，對活性氨基含量、機械強度及對有機溶劑耐受性等方面收到理想的效果。4.用TOTFB處理nylon表面，文獻中已有報導，但都是用nylon膜反應，洗脫需經過大量液體浸泡，而本發明採用池內衝洗三次，非特異結合為3.41％，實驗/非特異＝12.9，顯著高於ELISA2.1倍診斷標準。5.將本發明的方法製造的固相白色氨基反射層樣品池用於放射性標記免疫分析，配基結合率達43.98％，為已有的PS微孔板的2.5-13.1倍。證明本發明的方法製造的固相白色氨基反射層樣品池具有較高活性及靈敏度。6.本發明方法製造的固相白色氨基反射層樣品池的批內誤差統計實驗及對照組平均CV＝5.0％，各組8個平行樣本CV＜10％，顯著高於已有的PS微孔板。7.本發明方法製造的固相白色氨基反射層樣品池的破壞性實驗結果證明蛋白質完全變性的溫度為65℃，實驗採用50℃保持加溫48小時，樣品池偶聯抗體的結合率仍保持41％，比實驗前降低了4.6％。而已有的方法製造的PS樣品池結合率5％，已完全失效。8.本發明的固相白色氨基反射層樣品池的性能可與與丹麥生產的NuncCovalink-NH微孔板相比，實用性則比其優越。例如Nunc板的活性基團為-NH，本發明為-NH2，該基團聯結蛋白質的氨基更容易，更穩定；Nunc板售價比PS微孔板貴2倍。本發明因操作簡便，取材容易，成本只比PS微孔板貴20％左右。用本發明的方法製造的固相白色氨基反射層樣品池既可用於應用於固相免疫分析(放射免疫分析、螢光免疫分析、酶聯免疫分析、時間分辨螢光免疫分析)DNA晶片等生物技術分析領域，還可以用做親和層析固相結合劑，即將直徑為5-8μmPS微珠按本方法移植活性氨基，可作為高效能親和層析材料，且可以反覆使用，其功能及成本均比常用的聚丙烯醯胺凝膠為優，具有廣泛的應用價值。圖1是固相白色氨基反射層樣品池結構示意圖。具體實施例方式本發明的實施例所使用的試劑及其製備A.基體1活化劑6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液(V/V)。B.中層2的nylon-6的活化劑(0.5-0.9％吡啶)的乙酸/間甲酚溶液(V/V)。C.環氧氯丙烷乙醚溶液環氧氯丙烷與乙醚溶液體積比為1∶9。D.三乙基氧嗡四硼酸脂(TOTFB)及製備40ml5％(v/v)三氟化硼乙醚(v/v)溶液在持續攪拌下，加入12.5ml的環氧氯丙烷的乙醚溶液，在30分鐘內加完，之後加熱回流一小時，室溫再攪拌3小時，濾出TOTFB，再用無水乙醚衝洗3次，得到的TOTFB。其產率為90％--95％以上。得到的TOTFB必須在48小時內用完，否則失效。E.TOTFB二氯甲烷溶液含0.01-0.05g/mlTOTFB三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)二氯甲烷溶液。F.戊二醛硼酸鹽緩衝溶液將0.5M戊二醛液以5％(v/v)相溶於0.2M硼酸鹽緩衝溶液(pH＝7.6)。G.1，6己二胺溶液濃度為0.5M1，6己二胺的(pH＝9.5)的碳酸鹽緩衝溶液。實施例1(1).向由PS構成的基體1內加入400μl基體1活化劑，室溫放置1分鐘，棄去溶液後立即加入200μl由中層2nylon-6活化劑溶解的12％nylon-6溶液，沿中軸線慢速旋轉(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結合於基體1的內表面，形成nylon-6膜層厚度為0.1-0.2mm的固相白色氨基反射層樣品池中層2nylon-6膜層；(2).加入400μl5％三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷衝洗2次，二氧六環衝洗1次；3.將200μl0.5M戊二醛加入上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去。加入0.2MpH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩衝溶液衝洗三次；再加入200μl0.058g/ml的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉。然後用PBS緩衝溶液衝洗3次，即得本發明的固相白色氨基反射層樣品池。實施例2(1).向由PS構成的基體1內加入400μl基體1活化劑，室溫放置1分鐘，棄去溶液後立即加入200μl用中層2nylon-6活化劑溶解的13％nylon-6溶液。沿中軸線慢速旋轉(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結合於基體1的內表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的固相白色氨基反射層樣品池中層2nylon-6膜層；(2).加入400μl4％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去.用二氯甲烷衝洗2次，二氧六環衝洗1次；3.加入200μl0.5M戊二醛硼酸鹽緩衝溶液到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去。加入0.2MpH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩衝溶液衝洗三次；再加入200μl0.5M的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉，然後用PBS緩衝溶液衝洗3次，即得到本發明的固相白色氨基反射層樣品池。實施例3(1).向由PS構成的基體1內加入400μl基體1活化劑。室溫放置1分鐘，棄去溶液後立即加入200μl由中層2nylon-6活化劑溶解的14％nylon-6溶液。沿中軸線慢速旋轉(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結合於基體1的內表面，形成nylon-6膜層厚度為0.1-0.2mm的固相白色氨基反射層樣品池中層2nylon-6膜層；(2).加入400μl3％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去。用二氯甲烷衝洗2次，二氧六環衝洗1次；所述的TOTFB合成方法是按文獻(酶固定於尼龍的化學，生物化學.J.1975，147593-603AchemistryfortheImmobilizationofEnzymesonnylon.Biochem.J.1975，147593-603)合成方法合成；3.將200μl0.5M戊二醛硼酸鹽溶液加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，加入0.2MpH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩衝溶液衝洗三次；再加入200μl0.5M的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉，然後用PBS溶液衝洗3次，即得本發明的固相白色氨基反射層樣品池。實施例4(1).向由PS構成的基體1內加入400μl基體1活化劑，室溫放置1分鐘，棄去溶液後立即加入200μl用中層2nylon-6活化劑溶解的15％nylon-6溶液。沿中軸線慢速旋轉(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結合於基體1的內表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的固相白色氨基反射層樣品池中層2nylon-6膜層；(2).加入400μl2％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷衝洗2次，二氧六環衝洗1次；3.將200μl戊二醛硼酸鹽緩衝溶液(pH＝7.6)的加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘後加入0.2MpH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩衝溶液衝洗三次；再加入200μ溶於0.1M碳酸鹽緩衝溶液(pH＝9.5)0.5M的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉，然後用PBS溶液衝洗3次，即得本發明的固相白色氨基反射層樣品池。實施例5(1).向由PS構成的基體1內加入400μl基體1活化劑。室溫放置1分鐘，棄去溶液後立即加入200μl由中層2nylon-6活化劑溶解的16％nylon-6溶液，沿中軸線慢速旋轉(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結合於基體1的內表面，形成nylon-6膜層厚度為0.1-0.2mm的固相白色氨基反射層樣品池中層2nylon-6膜層；(2).加入400μl1％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去。用二氯甲烷衝洗2次，二氧六環衝洗1次；3.加入200μl0.5M戊二醛硼酸鹽緩衝溶液到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，加入0.2MpH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩衝溶液衝洗三次；再加入200μl0.5M1，6己二胺碳酸鹽緩衝溶液(pH＝9.50)，室溫放置3小時，倒掉。然後用PBS溶液衝洗3次，即得本發明的固相白色氨基反射層樣品池。權利要求1.一種固相白色氨基反射層樣品池製造方法，其特徵在於製備方法的步驟和條件如下(1).nylon-6與PS基體1的聯結向固相白色氨基反射層樣品池的PS基體1內加入基體1活化劑吡啶/丙酮溶液，室溫放置1-3分鐘，棄去溶液後立即加入含12-18％聚醯胺-6粉的中層2nylon-6的活化劑，沿中軸線慢速旋轉基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結合於基體1池的內表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的固相白色氨基反射層樣品池中層2的膜層；(2).尼龍膜表面烷基化加入TOTFB二氯甲烷溶液上述的(1)樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷衝洗2次，用二氧六環衝洗1次；(3).修飾尼龍膜表面將戊二醛溶液加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去，加入0.2MpH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩衝溶液衝洗三次，再加入1，6己二胺(pH＝9.5)溶液，室溫放置3小時，倒掉，然後用PBS溶液衝洗3次，得固相白色氨基反射層樣品池。2.一種如權利要求1所述的固相白色氨基反射層樣品池製造方法，其特徵在於所述的基體1活化劑為6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液(V/V)。中層2的nylon-6的活化劑為(0.5-0.9％吡啶)的乙酸/間甲酚溶液(V/V)。TOTFB二氯甲烷溶液為含0.01-0.05g/mlTOTFB三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)二氯甲烷溶液。戊二醛液為將0.5M戊二醛液以5％(v/v)相溶於0.2M硼酸鹽緩衝溶液(pH＝7.6)。1，6己二胺溶液為將的0.5M的1，6己二胺溶液(v/v)溶於0.1M(pH＝9.5)的碳酸鹽緩衝溶液。全文摘要本發明涉及一種固相白色氨基反射層樣品池製造方法。其方法為採用吡啶/丙酮預先活化處理PS表面，用乙酸/間甲酚/吡啶溶解、活化尼龍，使兩者之間發生疏水性相互作用，可使nylon－6牢固、均勻的結合於PS樣品池的內表面；用TOTFB直接進行處理使尼龍膜上的氧原子烷基化；nylon－6膜上的烷基經戊二醛雙功能團作用，共價連接一端結合「手臂」上的游離氨基，另一端游離的醛基結合蛋白質的游離氨基形成交牢固的共價結合，得到固相白色氨基反射層樣品池。該樣品池可以多次重複使用。本發明的方法可以用於固相酶方法，提高酶工程的效果，降低其成本。文檔編號B01J20/00GK1763527SQ20051010741公開日2006年4月26日申請日期2005年9月30日優先權日2005年9月30日發明者潘利華,馬世鹽,郭淑英,鈕倩申請人:中國科學院長春應用化學研究所