一種基因工程新藥－血小板因子4的製備方法
2023-12-02 01:55:51 1
專利名稱：一種基因工程新藥－血小板因子4的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程抗腫瘤及保護造血系統的新藥製備方法。
背景技術：
人血小板因子4(human platelet factor4，h PF4)是由骨髓巨核細胞合成的一種同源四聚體蛋白質，每個單體含70個胺基酸，分子量為7800Da，貯存於血小板的a顆粒內，正常人血漿內的含量為1.7-20.9ng/mg。hPF4的一級結構在本領域是熟知的，它的類似物和片段也是熟知的，並在美國專利4,545,828和4,737,580中稱作「制瘤素」。hPF4正常的生理功能是抑制內皮細胞增殖，保護骨髓造血細胞，抵抗肝素的抗凝作用。hPF4的突變體作為治療血管發生疾病的藥物已被公開(中國專利CN 1088216A)。近年來國內外的研究發現，hPF4在抗腫瘤，抑制腫瘤轉移，保護造血細胞，以及治療胰腺炎等方面有誘人的藥理作用，尤其是其能夠抑制內皮細胞的增殖、遷移、抑制血管的生成，從而降低腫瘤組織的血供，通過多種機制抑制腫瘤的生長和擴散。
目前，對腫瘤的治療主要有手術、放療、化療和免疫療法，這些方法對於早期腫瘤的效果較好，但對於晚期腫瘤和絕大多數發展快、播撒早的腫瘤效果卻很差。對於不能實施手術的病重患者，只能靠化療、放療來緩解症狀，而這兩種方法療效差，缺乏選擇性，毒副作用大，會引起白細胞減低和乏力、噁心、嘔吐等消化系統症狀，給患者增加了新的痛苦。如今大量研究表明，PF4具有良好的抗腫瘤效果和造血細胞保護作用，且毒副作用少，使用安全，為腫瘤的治療提供了一種更成熟、更優越的替代藥物。
為了儘快將PF4的優秀的藥理作用應用於臨床，發揮其巨大的治療重要疾病的作用，國內外對PF4因子進行了大量的研究，並已建立了原核和真核表達體系，進行製備，但工藝複雜，表達量少，不足以組織有效的規模化生產，因此也無相關藥物上市。
發明內容
本發明的目的在於提供一種新型基因藥物人血小板4(hPF4)的高效製備方法。該方法具有生產周期短，操作簡單，產量高，成本低，質量穩定，毒副作用少，使用安全的特點。純化工藝簡單可靠，表達量比國內外所報導的表達量高近80倍，達160mg/l，而國內外所報導的表達量一般在2mg/l左右。這些特點為h PF4產業化生產提供了堅實的基礎。
為實現上述目的，本發明的技術方案以如下方式實現(1)設計合成一對特異引物，在PT7-7-rhPF4表達質粒的基礎上，應用聚合酶鏈反應(PCR)對其cDNA進行改造獲得突變體；(2)通過DNA重組技術構建重組hPF4原核表達質粒PBV220-rhPF4，並鑑定rPF4表達質粒的正確性；採用溫控誘導的方法表達非糖基化修飾的人血小板因子4目的蛋白；(3)裂解表達菌株；收集並純化包涵體；rhPF4分離純化；復性和測活(圖1)。
現根據以下實施例進行具體說明實施例1 目的基因的獲取以PT7-7-rhPF4(由閆佔清博士惠贈，本室保存)為模板(圖2)，設計聚合酶鏈式反應(PCR)引物，5『端引入EcoRI和NcoI兩位點，3『端完全去除150bp的非翻譯區AT富含序列，利用PCR定點誘變技術將終止密碼子TAG突變為大腸桿菌強的串聯終止信號TAATAA，引入SalI位點。引物設計如下上遊引物序列P1為5『-CGGAATTCCATGGAAGCTGAAGAAGATGG-3『下遊引物序列P2為5『-TTACGCGTCGACTTATTAACTCTCCAAAAGTTTC-3『PCR反應參數首輪循環94℃ 5min；55℃ 1min；72℃ 1min後續循環94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min末輪循環94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 10min4℃ 10min實施例2重組質粒的構建將PCR擴增產物用酚氯仿抽提純化，乙醇沉澱回收目的基因，然後利用EcoRI和SalI兩個酶切位點，採用T4噬菌體連接酶，將目的基因插入到原核高效表達載體PBV220(由本實驗室保存)中，從而獲得重組表達質粒PBV220-rhPF4(圖3)。該質粒在大腸桿菌可高效表達。實施例3高表達菌株的構造從37℃培養16小時的新鮮平板中挑取一單菌落(直徑2-3mm)於5ml LB培養液(氨苄100ug/ml)37℃、230rpm過夜培養；過夜培養物以1∶50擴種至50mlLB培養液(氨苄100ug/ml)中，37℃、230rpm、3h至OD600＝0.2-0.4(對數生長期)；置冰上20min，轉入離心管中，4000r/min離心10min；.棄上清，倒置離心管1min流盡剩餘液體，然後加入10ml用冰預冷的0.1M CaCl2致敏液懸浮細胞，冰上15min；.4000r/min離心10min，回收細胞，棄上清，倒置1min；.2ml冰上預冷的0.1MCaCl2懸浮細胞；.按照200ul/Eppendorf分裝；每管加入80％的甘油29ul至終濃度10％，標註，置-70℃凍存；若在24h內轉化可置於4℃冰箱中保存。
取感受態細胞一管，加重組質粒(1μg/μL)1μL，混勻，在冰上放置30min；.42℃水浴熱衝擊90s；快速放置於冰上2min；每管加LB培養基800μL，混勻，37℃水浴放置20min，180rpm，45min；將各管稀釋5倍，分別取200μL平鋪於含氨苄青黴素(100mg/L、氯黴素50ug/ml)LB瓊脂板表面，平放置20min後，37℃倒置培養12 h以上，待菌落形成後取出，4℃保存注意事項a感受態細胞拿取時避免反覆溫度變化，影響轉化效率；b預熱LB培養基及鋪板前預熱平板至37℃可提高轉化效率；c鋪板前充分稀釋細胞，可提高氨苄陽性平板的篩選效率。實施例4 hPF4的溫控誘導表達將轉化的表達菌株DH5α接種到5ml LB(含有Amp100mg/L)中，在37℃、230r/min過夜培養；將1ml過夜培養菌液轉入50ml LB培養基(Amp100mg/l，250ml三角瓶)，30℃振蕩培養4小時，OD600約為0.6，升溫至42℃繼續培養4小時，結束培養，離心收菌。實施例5 hPF4的分離0.1mg/ml溶菌酶作用菌體沉澱30分鐘，不斷攪拌，間歇超聲波冰浴破菌400W、230-240次(2秒/次，間隔2秒)。離心取沉澱1.5g重懸於緩衝液A(50 mmol/L，pH8.0 Tris.Cl；50mmol/L NaCl；0.5mmol/L EDTA0.4mmol/L DTT；5％甘油)中，加入PMSF(10mmol/L)10ul，攪拌作用1小時，間歇超聲波冰浴破菌230-240次(2秒/次，間隔2秒)，加入DOC(20％)終濃度0.2％，混勻，靜置10min去除大細胞碎片，13000g、4℃，15min離心，收集包涵體沉澱。然後重懸於3ml洗滌液I(50mmol/L，pH8.0 Tris.Cl；100mM NaCl；0.5mmol/L EDTA；2mol/L尿素；0.2％(v/v)TritonX-100；0.2％DOC)中，靜置30min，13000g、4℃、15min離心，上清及沉澱分別留取樣品，沉澱再充分重懸於洗滌液II(50mmol/L，pH8.0 Tris.Cl；100 mmol/L NaCl；0.5mmol/L EDTA；4mol/L尿素；0.2％(v/v)TritonX-100；0.2％DOC)中，混勻後靜置30min，13000g、4℃、15min離心，大部分重組hPF4即以可溶性的形式存在於上清中。實施例6 PF4的純化該實施例是通過以下過程實施的1、凝膠過濾粗純化用平衡溶液(8mmol尿素，1mmol/LDTT，10mmol/L Tris.Cl PH8.0)流速9ml/min平衡Supex200φ5.0cm*120cm凝膠層析柱5小時以上，待基線信號平衡時將包涵體的裂解液進入到層析柱中，用流動相(8mmol尿素，1mmol/LDTT，10mmol/L Tris.Cl PH8.0)以流速9ml/min洗脫，收集，SDS-PAGE分析。2、反相高壓液相層析二次純化以0.1％TFA+超純水平衡C8φ4.0mm×250mm反相色譜柱，至基線平穩。將步驟1所得樣品進樣，用0.1％TFA+乙晴進行洗脫，收集，SDS-PAGE電泳分析(圖4)。實施例7 rhPF4的復性空氣氧化法將分離純化的rhPF4經透析液I(50mmol/l，pH8.0 Tris.Cl；100mmol/L NaCl；0.5mmol/L EDTA；2mol/L尿素；0.2％DOC)、透析液II(50mmol/l，pH 8.0 Tris.Cl；100mmol/L NaCl；0.5mmol/L EDTA)逐步透析，透析過程中，採用空氣氧化法，加入Cu2+濃度10-6mol/L加速空氣氧化，使rhPF4正確摺疊，採用Millipore Centricon YM-3超濾膜、Millipore Centricon YM-30超濾膜進一步純化、濃縮樣品。實施例8 rhPF4活性測定採用雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制實驗檢測重組PF4的抑制血管形成的生物學活性，通過設立對照可以觀察到重組hPF4可以明顯抑制血管的生成，經顯微鏡對一定面積膜的觀察、計數獲得數據如下兩表表1對載體膜周圍一級、二級血管生長的影響，一級、二級血管計數(X±s)組別N 一級血管數 t值 二級血管數 t值實驗組 24 1.24±0.31 8.23±3.122.28 2.43對照組 22 2.43±0.52 11.65±4.23P＜0.05以藥物載體膜為中心，計數與其邊緣相接的一級、二級血管數，進行比較發現實驗組與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。表2對載體膜周圍大、中、小血管生長的影響，血管計數(X±s)組別 N大血管數 t值 中血管數t值 小血管數t值實驗組 24 5.32±2.40 2.22±1.3234.45±12.121.42 2.31*2.68*對照組 22 5.86±2.56 4.76±2.3169.21±11.32*P＜0.05對照組中、小血管數明顯較多，與實驗組比較有顯著性差異，而大血管數無顯著性差異。
對載體膜下血管生長的影響對照組載體膜下血管生長良好，血管分支適中；實驗組載體膜下出現血管消失的現象，表明初步復性後的重組PF4有明顯的血管生成抑制活性。
發明效果用本發明的方法製備人血小板因子4的優點是生產周期短，操作簡單，產量高，成本低，質量穩定，毒副作用少，使用安全，特別是其產物的表達量比國內外所報導的表達量高出近80倍，為產業化生產提供了堅實的基礎。
圖1-PF4生產流程2-目的基因序列表圖3-重組質粒PF4-pBV220構建4-工程菌誘導表達後的SDS-PAGE電泳圖其中1-蛋白分子量MARKER；2-pBV220/DH5a誘導表達後；3-7-PF4-pBV220/DH5a誘導表達後；8-pBV220/DH5a誘導表達後；9-蛋白分子量MARKER.
權利要求
1.一種基因工程新藥人血小板因子4的製備方法，其特徵是採用所說的基因工程技術可以明顯提高產物的表達量，具體步驟包括A 設計合成一對特異引物，以PT7-7rhPF4表達質粒為模板，應用聚合酶鏈式反應(PCR)對其cDNA進行改造；B 通過DNA重組技術構建重組hPF4原核表達質粒pBV220-rhPF4，採用溫控誘導方法表達目的蛋白；C、裂解表達菌株，收集純化包涵體；D、rhPF4的分離純化，復性、測活。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵是用基因工程手段獲得未經糖基化修飾的人血小板因子4及其突變體。
3.如權利要求1所述的製備方法，其特徵是通過改造hPF4cDNA基因，去除3『端非翻譯區AT富含區，構建成pBV220-hPF4，使其表達量在大腸桿菌中達到160mg/L菌培養液。
4.如權利要求1所說的製備方法，其特徵是目的基因的獲取是以PT7-7rhPF4為模板，設計聚合酶鏈式反應(PCR)引物，5』端引入EcoR1和Ncol兩位點，3』端完全去除150bp的非翻譯區AT富含序列，利用PCR定點誘變技術將終止密碼子TAG突變為大腸桿菌強的串聯終止信號TAATAA，引入Sall位點，設計的上遊引物為P1 5』-CGGAATTCCATGGAAGCTGAAGAAGATGG-3』，下遊引物為P2 5』-TTACGCGTCGACTTATTAACTCTCCAAAAGTTTC-3』
5.如權利要求1所述的製備方法，其特徵是包涵體的純化是用洗滌液I一次洗滌，包涵體測定後，用洗滌液II溶解，低溫高速離心，即可得到純度達85％以上的rhPF4上清液。
6.如權利要求1所述的製備方法，其特徵是rhPF4的復性採用空氣氧化法，加入少量Cu2+濃度1×10-6moI/L，以加速空氣氧化。
全文摘要
本發明涉及一種基因工程新藥人血小板因子4的製備方法,它是採用基因工程技術得到高表達的產物,具體步驟包括:設計合成一對特異引物,以PT7－7rhPF4表達質粒為模板,應用PCR反應對其cDNA進行改造,通過重組技術構建hPF4原核表達質粒,用溫控誘導方法表達目的蛋白,裂解表達菌株,收集純化包涵體,最後分離純化及復性測活,該方法可明顯提高所說產物的表達量。
文檔編號C07K14/00GK1386750SQ0212089
公開日2002年12月25日 申請日期2002年8月13日 優先權日2002年8月13日
發明者牛勃, 張俊芳, 楊琦, 常冰梅, 楊濤, 解軍, 張悅紅, 閻佔清, 郭勇, 李樂意 申請人:牛勃