先天性甲狀腺功能減低症多基因測序引物及檢測方法
2023-12-01 13:57:06 1
先天性甲狀腺功能減低症多基因測序引物及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種先天性甲狀腺功能減低症多基因測序引物及檢測方法，屬於分子生物學和臨床檢驗學領域。一組檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因PCR引物序列，由Pax-8基因PCR引物序列、TG基因PCR引物序列、IYD基因PCR引物序列、DUOX2基因PCR引物序列、NIS基因PCR引物序列、TSHR基因PCR引物序列和TPO基因PCR引物序列中的一種或多種引物序列組成。本發明的優點是：利用新一代測序對引起先天性甲狀腺功能減低症的多致病基因同時檢測，耗費時間少、檢測效率高、成本低、靈敏度和特異度均較高，可以快速、全面實現對臨床患者基因突變檢測及疾病分類。
【專利說明】先天性甲狀腺功能減低症多基因測序引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種先天性甲狀腺功能減低症多基因測序引物及檢測方法，特別涉及 先天性甲狀腺功能減低症（簡稱先天性甲低，Congenital hypothyroidism, CH)多基因測 序檢測分析方法，屬於分子生物學領域和臨床檢驗學領域。
【背景技術】
[0002] 先天性甲狀腺功能減低症（簡稱先天性甲低，Congenital hypothyroidism, CH) 是導致新生兒智力和體格發育障礙的最常見的內分泌疾病之一，其患病率在不同地域、不 同種族、以及不同環境均可存在差異。CH患病率在全國平均水平為1/2050,而在廣西患病 率可達1/835,早期診斷和治療是降低疾病危害的主要措施。
[0003] 目前CH的診斷主要分為一般性診斷和甲狀腺核素掃描診斷。一般性診斷主要是 通過實驗測定血液TSH、FT3、FT4濃度水平，確定甲狀腺功能低下的程度和性質。病因學診 斷，主要包括放射性核素甲狀腺掃描，以明確甲狀腺的發生、發育及功能情況。前者的影響 因素較多，靈敏度和特異度均有待於提高，且不能對疾病進行分型，而甲狀腺核素掃描僅對 有形態學改變的永久性CH診斷有效。
[0004] 核酸測序通過對目的基因片段進行DNA序列檢測，從而得到目的基因 DNA序列信 息，是現代分子生物學中應用廣泛的一項重要技術，長久以來廣泛應用於基因突變檢測以 及基因分型等領域。一代測序又稱為"Sanger測序"，由於結果直觀，因此是DNA測序的 "金標準"，但因其成本高，通量過低，手工操作時間長，只能對基因進行單獨監測檢測，對多 基因引起的疾病臨床應用存在困難。
【發明內容】
[0005] 本發明的主要目的在於克服現有CH檢測技術的不足，提供一組能對導致先天性 甲狀腺功能減低症的多基因進行快速、全面檢測的、且適用於臨床患者基因突變檢測及疾 病分類的多基因測序引物。
[0006] 本發明的第二個目的是提供一種結果準確、通量高、時的間短、成本低能同時檢測 先天性甲狀腺功能減低症的多個候選基因的檢測方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：
[0008] -組檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，由Pax-8基因 PCR引 物序列、TG基因 PCR引物序列、IYD基因 PCR引物序列、DU0X2基因 PCR引物序列、NIS基因 PCR引物序列、TSHR基因 PCR引物序列和ΤΡ0基因 PCR引物序列中的一種或多種引物序列 組成。
[0009] 所述Pax-8基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 12所示的核苷 酸序列。
[0010] 所述TG基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 13-SEQ ID No. 72所示的核苷酸 序列。
[0011] 所述IYD基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 73 - SEQ ID No. 82所示的核苷 酸序列。
[0012] 所述DU0X2基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 83-SEQ ID No. 100所示的核 苷酸序列。
[0013] 所述NIS基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 101 - SEQ ID No. 118所示的核 苷酸序列。
[0014] 所述TSHR基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 119-SEQ ID No. 136所示的核 苷酸序列。
[0015] 所述ΤΡ0基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 137 - SEQ ID No. 166所示的核 苷酸序列。
[0016] 本發明主要利用oligo 6. 0軟體設計DU0X2、TG、TSHR等七種CH相關基因共139 個外顯子的PCR擴增引物（表1)，根據外顯子相距遠近程度，合併部份外顯子共同設計引 物，共計83對引物。引物設計遵循如下幾個原則：引物的長度範圍在19-23bp適宜；引物應 無二聚體，尤其是3'端二聚體形成的可能性；無髮夾結構；上下遊引物Tm值相差不宜超過 5°C;GC含量以45-55%為宜。當上下遊引物確定以後，在NCBI資料庫中利用Blast對上遊 和下遊引物進行比對分析，確保引物的特異性及擴增效率。與目前illumina、安捷倫以及羅 氏公司的捕獲技術獲得150_400bp片段相比，擴增產物長度平均在1. 5kb左右，通過PCR長 片段擴增，可以對目標區域進行有效地捕獲。
[0017] 表1 :本發明多基因 PCR引物序列
[0018]
【權利要求】
1. 一組檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特徵在於：由Pax-8 基因 PCR引物序列、TG基因 PCR引物序列、IYD基因 PCR引物序列、DU0X2基因 PCR引物序 列、NIS基因 PCR引物序列、TSHR基因 PCR引物序列和TPO基因 PCR引物序列中的一種或多 種引物序列組成。
2. 根據權利要求1所述的檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特 徵在於：所述Pax-8基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 1 - SEQ ID No. 12所示的核苷 酸序列。
3. 根據權利要求1所述的檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特 徵在於：所述TG基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 13 - SEQ ID No. 72所示的核苷酸 序列。
4. 根據權利要求1所述的檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特 徵在於：所述IYD基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 73-SEQ ID No. 82所示的核苷酸 序列。
5. 根據權利要求1所述的檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特 徵在於：所述DU0X2基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 83 - SEQ ID No. 100所示的核 苷酸序列。
6. 根據權利要求1所述的檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特 徵在於：所述NIS基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 101-SEQ ID No. 118所示的核苷 酸序列。
7. 根據權利要求1所述的檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特 徵在於：所述TSHR基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 119 - SEQ ID No. 136所示的核 苷酸序列。
8. 根據權利要求1所述的檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因 PCR引物序列，其特 徵在於：所述TP0基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 137-SEQ ID No. 166所示的核苷 酸序列。
9. 一種檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因測序檢測方法，其特徵在於：採用新一 代測序對CH多個致病基因和相關基因同時進行突變檢測；所述CH多個致病基因為Pax-8 基因、TG基因、IYD基因、DU0X2基因、NIS基因、TSHR基因和TPO基因中的一種或多種。
10. 根據權利要求9所述的一種檢測先天性甲狀腺功能減低症的多基因測序檢測方 法，其特徵在於所述方法包括以下步驟： (1) 設計多基因 PCR引物序列：為序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 166中的一種或 多種； (2) 提取DNA樣本：用常規方法提取測試者的DNA樣本； (3) 擴增目標區域：利用TAKARA高保真酶，按照25μ1體系，利用美國AB Veriti梯度 PCR儀，擴增30個循環，其中各基因外顯子PCR擴增的熱循環條件如下： 95? 預變性 5min ;95°C，30sec，6(TC，30sec，72°C，2min30sec ;30 個循環，72? 延伸 10min ； (4) PCR產物純化：所有產物均取2. 5 μ 1進行電泳鑑定；所有剩餘PCR產物均採用美國 Omega公司過柱試劑盒進行純化回收； (5) 文庫的製備：攜帶測序引物片段的轉座子，隨機打斷上述步驟的擴增產物（擴增 子），並將測序引物片段連接於片段化的擴增子（長度約為300bp)的兩端進行PCR擴增，測 序引物由標籤序列、P5/P7序列等組成，得到可用於測序的DNA片段； (6) miseq測序：利用MiSeq Reagent Kit(300 cycles PE)試劑盒測序，稀釋文庫並使 其變性，製備所需的預填充試劑盒，將文庫混合液裝到指定槽的試劑盒中，設置實驗步驟並 檢查各運行參數，選擇Sequence開始運行，實驗結束後查看測序結果； (7) 生物信息學分析 首先對新一代測序數據進行預處理，包括剪除3'端質量值低於20的序列、去除平均 質量值低於20的序列；然後使用bwa將質控後的序列比對到參考基因組序列上（版本號 hgl9)，利用GATK工具判讀SNP和Indel位點；利用SNPnexus工具注釋SNP，找到可能性的 功能性位點，最後利用dbSNP、千人基因組資料庫、HGMD等資料庫，過濾人群中存在的多態 性位點。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120186SQ201410383359
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】陳少科, 顧學範, 陳榮譽, 付春雲, 羅靜思, 範歆, 李川 申請人:廣西壯族自治區婦幼保健院