一種複合微生態製劑及其應用的製作方法

2023-12-02 03:05:11

專利名稱：一種複合微生態製劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種複合微生態製劑，具體地說是涉及包含多種益生菌的複合微生態製劑及其應用，屬於微生態製劑技術領域。

背景技術：
目前，對動物疾病的預防和治療藥物基本仍採用抗生素，但由於長期、大量使用抗生素，耐藥性、菌群失調、免疫力下降、疾病復發率高、藥物殘留等種種弊端日益嚴重，同時也嚴重危害動物機體及人類健康。當前，世界各國對抗生素各自採取了禁用或限制使用的措施，如歐盟從2006年全面禁止使用抗生素；世界衛生組織(WTO)提出了「在食用動物中減少抗生素使用的全球原則」；我國已啟動「飼料安全工程」，並禁用了一批毒性和殘留較大的藥物。在此形式下，改變養殖觀念、預防重於治療，並開發應用無毒、無藥殘的新型綠色飼料添加劑是必然趨勢。
微生態製劑是目前常用和研究較多的一種綠色、安全的飼料添加劑，此類製劑是由動物有益菌經工業化發酵生產得到的，包含有很多有益微生物及其代謝產物構成的活菌製劑，可以直接飼餵動物。微生態製劑通過維持腸道內微生態的平衡而發揮作用，具有防病、增強機體免疫力、促進生長、增加體重等多種功能，且無汙染，無殘留，不產生抗藥性，是一種綠色、安全的飼料添加劑。
目前，市場上的微生態製劑存在以下幾個方面的主要質量問題(1)活菌含量低，而研究表明，如果一種菌在盲腸內容物中的濃度低少107個/g，則該菌產生的酶及代謝產物不足以影響宿主，難以滿足治療需要；(2)水分含量偏高，這是影響微生態製劑質量的重要因素之一；(3)不耐抗生素；(4)對胃酸和膽鹽不穩定，致使只有少數菌株進入腸道後仍具有活性，達不到發揮作用所需的活菌數量。由於微生態製劑存在的這些質量問題，從而影響了其在動物上的應用效果，限制了微生態製劑的廣泛應用。


發明內容
本發明的目的在於提供一種活菌含量高、水分含量低、包含具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫及耐受常用抗生素等抗逆性能和產酸、產酶及抑制病原菌等益生功能的多種益生菌的微生態製劑。
本發明的另一目的在於提供該微生態製劑的用途。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的 本發明提供一種複合微生態製劑，該製劑包含地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、糞腸球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.2386菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2388菌粉中的任三種或四種。
其中，所述的地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母具有良好的耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫、耐受常用抗生素等抗逆性能和產酸、產酶、抑制病原菌等益生功能，為申請人從健康動物腸道或糞便中分離、選育得到，經中國農業微生物菌種保藏管理中心鑑定，並於2008年3月3日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(簡稱CGMCC)，保藏號分別為CGMCC No.2383、CGMCC No.2386、CGMCC No.2388。
嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌可以按常規方法分離得到，也可從市場上購買得到，本發明為從市場上購買得到。
本發明的複合微生態製劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶0.8～2.5∶1.5～2.5。
本發明的複合微生態製劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1～3.5∶0.8～3.5∶0.8～3.5。
本發明的複合微生態製劑包含糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶1.5～2.5。
本發明的複合微生態製劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1～1.5∶2～2.5∶2～2.5。
本發明的複合微生態製劑還可進一步包含載體，載體為石粉、葡萄糖、硫酸鉀鋁、玉米芯粉中的任一種或兩種。
本發明的另一目的在於提供該複合微生態製劑在畜禽飼料添加劑中的應用。該複合微生態製劑可以根據畜禽及其所處生長階段不同確定包含的益生菌種類、載體種類及其比例，以更有針對性的製成各畜禽通用型或專用型的微生態製劑，從而更好的發揮微生態製劑的功能，如本發明的複合微生態製劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，載體為石粉，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶1.5～2.5∶1.5～2.5∶3.5～4.5，即可製成豬通用型複合微生態製劑，總有益菌數達2～5×109cfu/g；複合微生態製劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.5～2.5∶15～20，即製成仔豬專用型複合微生態製劑，總有益菌含量5～9×108cfu/g；複合微生態製劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉、硫酸鉀鋁和石粉，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶0.8～1.2∶4.5～5.5∶1.5～2.5，即製成母豬專用型複合微生態製劑，總有益菌含量2～5×109cfu/g；複合微生態製劑包含枯草芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌僂和玉米芯粉，上述各成分的重量配比為3～3.5∶3～3.5∶2.5～3.5∶0.5～1.5，即製成飼料廠豬產品專用型複合微生態製劑，益生菌總菌含量可達2～5×1010cfu/g；複合微生態製劑包含糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶1.5～2.5∶15～20，即製成雛禽專用型複合微生態製劑，總有益菌含量5～9×108cfu/g；複合微生態製劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和石粉，上述各成分的重量配比為1～1.5∶2～2.5∶2～2.5∶5～5.5，即製成肉禽專用型複合微生態製劑，總有益菌數達2×109cfu/g；複合微生態製劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽胞桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和石粉，上述各成分的重量配比為1∶1～1.2∶1～1.2∶7～8，即製成蛋禽專用型複合微生態製劑，總有益菌數達2～5×109cfu/g；複合微生態製劑包含枯草芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和玉米芯粉，上述各成分的重量配比為3∶3～3.5∶3～3.5∶0.5～1.5，即製成飼料廠雞產品專用型複合微生態製劑，益生菌總菌含量可達2～5×1010cfu/g。
本發明中所選育的地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母與枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在製備中採用液體深層高密度發酵技術和噴幹或者凍幹一系列的後處理加工工藝技術製成菌粉，製劑中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫及耐受常用抗生素等抗逆性能和產酸、產酶及抑制病原菌等益生功能。
本發明的複合微生態製劑能提高飼料利用效率，增加肉蛋奶等產量，促進動物生長，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善動物產品品質。
本發明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2383、糞腸球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.2386菌粉、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No.2388菌種的分離、選育及其菌粉的製備過程如下 1、增菌培養將健康動物(豬或者家禽)的新鮮糞便或腸道內容物樣品接種於增殖液體培養基中，在30～37℃恆溫培養增殖； 2、分離純化對步驟1增菌培養物在增殖培養基平板上進行劃線培養，從中挑取各個具有特徵形態的菌落再劃線培養和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然後將斜面菌種保藏於4℃冰箱中，待用； 其中所述增殖培養基為BPY培養基、MRS培養基、98號培養基中的一種； 3、抗逆性強的優良菌種的選育對步驟2所分離、純化的菌株進行抗逆性篩選，可以對所分離、純化的菌種直接進行抗逆性能測定，從中篩選出抗逆性強的天然優良菌種；或通過梯度培養逐漸增加溶液的酸性(至pH為1.5左右)及膽汁鹽濃度，選出具有耐酸及耐膽汁特性的菌株；或通過傳統的物理、化學誘變方法、現代基因工程技術，定向選育出抗逆性強的菌種；再做菌種鑑定及生物學性能測定 1)耐酸性測定將斜面菌種接種到種子培養基中活化，30～37℃靜置培養8～20h，按5～10％接種量分別接種於pH值2.0、3.0、4.0的人工模擬胃液中，0h計數作對照，2h、6h取樣用磷酸緩衝液按10倍系列稀釋，進行平板活菌計數，計算存活率； 其中所述種子培養基為BPY培養基、MRS培養基、98號培養基中的一種； 2)耐膽鹽測定將斜面菌種接種於培養基中，30～37℃靜置培養8-24h活化，按5～10％接種量分別接種於0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同濃度的豬膽鹽溶液中，0h計數作對照，2h、6h取樣用生理鹽水按10倍系列稀釋計數，進行平板活菌計數，計算存活率； 3)耐高溫測定將斜面菌種接種於種子培養基中，30～37℃培養16-24h活化，分別於50℃～80℃水浴處理15～30min，處理前的做對照，計算存活率； 4)耐藥性測定採用藥敏性紙片法； 5)產酶測定採用中華人民共和國輕工業行業標準，工業用α-澱粉酶製劑(QB/T1805.1-1993)，工業酶製劑通用試驗方法(QB/T1803-1993)對地衣芽孢桿菌進行澱粉酶活力測定；採用行業標準工業用蛋白酶製劑(QB/T1805.3-1993)，對地衣芽孢桿菌進行蛋白酶活力測定； 6)產酸測定採用離子色譜法對糞腸球菌CGMCC No.2386進行有機酸產量測定； 7)抑菌試驗採用牛津杯法(又稱管碟法)對常見致病菌進行抑菌測定； 本發明所選育的地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383在人工模擬胃液(pH2.0～4.0)中處理6h，存活率在49.5％以上；在豬膽鹽溶液(濃度0.3-3g/kg)處理6h，存活率為100％；50～80℃處理15～30min，存活率為100％；對青黴素G、阿莫西林、大觀黴素、紅黴素、吉他黴素、桿菌肽鋅、林可黴素7種抗生素有耐藥性；對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌三種致病菌均有較好的抑制作用，抑菌圈直徑在12～20mm；產蛋白酶活力為1000u/ml；產澱粉酶活力為800u/ml。
本發明所選育的糞腸球菌CGMCC No.2386在人工模擬胃液(pH2.0～4.0)中處理6h，存活率在18.0％以上；在豬膽鹽溶液(濃度0.3-3g/kg)處理6h，存活率為12.6％以上；50～80℃處理15～30min，存活率為0.43％；對青黴素G、頭孢噻肟、慶大黴素、大觀黴素、新黴素、紅黴素、吉他黴素、桿菌肽鋅、林可黴素、諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、複方磺胺甲基異惡唑13種抗生素有耐藥性；對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌三種致病菌均有很好的抑制作用，抑菌圈直徑在16～21mm；乳酸、乙酸、異丁酸總酸產量為4.2g/L，乳酸產率達到89.4％。
本發明所選育的釀酒酵母CGMCC No.2388在人工模擬胃液(pH2.0～4.0)中處理6h，存活率在15.4％以上；在豬膽鹽溶液(濃度0.3-3g/kg)處理6h，存活率為11.5％以上；50～80℃處理15～30min，存活率為0.19％； 4、菌粉的製備 地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉的製備方法，包括如下的步驟 1)平板培養復壯將地衣芽孢桿菌菌種接種於BPY平板培養基上，於30-37℃培養12-24h，使地衣芽孢桿菌復壯，並形成單菌落，挑取單菌落於接種於斜面培養基上，於30-37℃培養24-36h； 2)一級種子的製備將步驟1)培養的枯草芽孢桿菌菌種轉接茄子瓶BPY斜面培養基上，於30～37℃培養12～16h，使其處於對數中後期，得一級種子； 3)二級種子的製備將步驟2)製備的一級種子用無菌水製成菌懸液，接種到裝有1-1.6M3 BPY種子培養基的2M3種子罐中，溫度30～37℃，轉速200～250rpm，罐壓0.05Mpa，通風比1∶0.6～0.8(14.4～19.2M3/h)，培養10～14h，為二級種子液； 4)地衣芽孢桿菌發酵液的製備將步驟3)製備的二級種子液按照3～10％的接種量接種到裝有12～16M3發酵培養基的發酵罐中，溫度30～37℃，轉速220～300rpm，罐壓0.05Mpa，通風比1∶0.6～0.8，培養16～20h，至芽孢形成率90％以上，活菌數為1～2×1010cfu/ml，則中止發酵，得地衣芽孢桿菌發酵液； 所述的發酵培養基為麩皮1～2％，豆粕1～2％，氯化鈉0.2～0.8％，硫酸鎂0.01～0.05％； 5)地衣芽孢桿菌菌粉的製備在步驟4)製備的發酵液中加入20～25％的填充物，混勻，進行噴霧乾燥，進風溫度120～130℃，排風溫度40～50℃，霧化器轉速15000～18000rpm，得到水分含量＜5％的地衣芽孢桿菌菌粉。
所述的填充物為米糠、沸石粉、稻殼粉中的任一種。
B、糞腸球菌CGMCC No.2386菌粉的製備方法，包括如下的步驟 1)平板培養復壯將糞腸球菌菌種接種於MRS平板培養基上，於32～37℃培養12～24h，使糞腸球菌菌復壯，並形成單菌落；挑取單菌落接種於斜面培養基上，於32～37℃培養24～36h； 2)一級種子的製備將步驟1)培養的糞腸球菌斜面菌種轉接到裝有250ml～300ml MRS培養基的500mL三角瓶中，於32～37℃培養12～16h，轉速100～150rpm，使其處於對數中後期，為一級種子； 3)二級種子的製備將步驟2)培養的乳酸桿菌一級種子轉接到裝有1.2～1.6L MRS培養基的2.0L三角瓶中，於32～37℃靜止培養12～16h，為二級種子液； 4)發酵液的製備將步驟3)製備的二級種子液按照3～6％的接種量接種到裝有12～16M3發酵培養基的發酵罐中，溫度35～37℃，轉速120～160rpm，罐壓0.05Mpa，培養16～20h，至活菌數為2～5×109cfu/ml，中止發酵； 所述的發酵培養基為葡萄糖1～2％，大豆蛋白腖1～2％，硫酸銨0.5～1.0％，氯化鈉0.2～0.8％，硫酸鎂0.01～0.05％； 5)糞腸球菌菌粉的製備將步驟4)製備的發酵液，3500～5000rpm離心，得到菌泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為15～20％的凍幹保護劑，混勻，於-25℃～-45℃冷凍乾燥，得到水分含量＜5％的糞腸球菌菌粉。
所述的凍幹保護劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖、麥芽糊精和穀氨酸鈉的混合物，按照脫脂奶粉∶甘油∶蔗糖∶麥芽糊精∶穀氨酸鈉＝2∶0.5～1.0∶0.5～1.0∶0.5～1.5∶0.5～1.0的比例混合而成。
C、釀酒酵母CGMCC No.2388菌粉的製備方法，包括如下的步驟 1)平板培養復壯將冰箱保藏的釀酒酵母斜面菌種採用劃線接種的方法在98號平板培養基上劃線接種，於28～32℃培養24～36h，使釀酒酵母復壯，並形成單菌落；挑取單菌落於新鮮的98號斜面培養基上，於28～32℃培養24～36h，放置冰箱備用； 2)一級種子的製備將步驟1)培養好的釀酒酵母新鮮斜面菌種轉接到裝有200～250ml 98號培養基的500mL三角瓶中，於28～32℃培養12～16h，轉速100～150rpm，使其處於對數中後期，為一級種子； 3)二級種子的製備將步驟2)培養好的釀酒酵母種子液轉接到裝有1.0～1.2L 98號培養基的2.0L三角瓶中，於28～32℃靜止培養12～16h，為二級種子液； 4)發酵液的製備將步驟3)製備的二級種子按照3～10％的接種量接種到裝有15～16M3發酵培養基的發酵罐中，溫度28～32℃，轉速150～200rpm，罐壓0.05Mpa，培養12～16h中止發酵，此時活菌數為1～3×109cfu/ml； 所述的發酵培養基為紅糖1～2％，大豆蛋白腖1～2％，酵母膏0.2～0.5％，氯化鈉0.5～1.0％，硫酸鎂0.01～0.05％，磷酸氫二鉀0.2～0.5％； 5)釀酒酵母菌粉的製備將步驟4)製備的發酵液，2000～3000rpm離心，得到菌泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為10～15％的凍幹保護劑，混勻後於-25℃～-45℃冷凍乾燥，得到水分含量＜5％的釀酒酵母菌粉； 所述的凍幹保護劑為脫脂奶粉、甘油、麥芽糊精按照2∶0.5～1∶1～2比例混合而成。
通過下列實施例將更具體的說明本發明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發明，而不是以任何方式限制本發明的範圍。

具體實施例方式 實施例1、優良菌種的的分離、篩選、選育及鑑定 1)增菌培養將健康動物(豬或者家禽)的新鮮糞便、腸道內容物樣品接種於BPY液體培養基中，在37℃恆溫培養增殖48h； 2)地衣芽孢桿菌的分離純化對步驟1)增菌培養物100℃水浴5min，然後在BPY培養基平板上進行劃線培養，從中挑取各個具有特徵形態的菌落再劃線培養和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然後保存於4℃冰箱中，待用； 菌落形態菌落表面粗糙，不光澤，乳白色不透明，邊緣不整齊，直徑2-3mm，隨著培養時間的延長，變為紅褐色；鏡檢細胞為桿菌1.6～3.8μm×0.6～1.2μm，革蘭氏陽性，芽孢中生，橢圓形，不膨大，初步確定為地衣芽孢桿菌； 3)糞腸球菌的分離純化對步驟1)增菌培養基在MRS培養基平板上進行劃線培養，從中挑取各個具有特徵形態的菌落再劃線培養和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然後保存於4℃冰箱中，待用； 菌落形態菌落圓整，表面光滑，呈乳白色，大小1-3mm；細胞圓形或卵圓形，直徑0.5～1.0um，大多數成短鏈或對，革蘭氏染色陽性； 4)釀酒酵母的分離純化對步驟1)增菌培養基在98號培養基平板上進行劃線培養，從中挑取各個具有特徵形態的菌落再劃線培養和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然後保存於4℃冰箱中，待用； 菌落形態菌落為軟而溼潤，乳酪色、有光澤、平坦或稍凸起、邊緣整齊；細胞為球形或卵形，直徑5～10um，繁殖方式芽殖； 對步驟3)或者4)所分離、純化的糞腸球菌或者釀酒酵母菌株進行抗逆性篩選，可以對所分離、純化的菌種直接進行抗逆性能測定，從中篩選出抗逆性強的天然優良菌種；或通過梯度培養逐漸增加溶液的酸性(至pH為1.5左右)及膽汁鹽濃度，選出具有耐酸及耐膽汁特性的菌株；或通過傳統的物理、化學誘變方法、現代基因工程技術，定向選育出抗逆性強的菌種；並對其進行菌種鑑定，最後對選育出的菌株進行抗逆性性能測定。
實施例2、3株優良菌種的抗逆性和生物學性能測定 3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383、糞腸球菌CGM CC No.2386、釀酒酵母CGMCC No.2388的生物學性能和抗逆性能測定 1)地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383培養物的製備將冰箱保藏的斜面菌種接種到BPY種子培養基中活化，37℃、200rpm培養18h，得到芽孢率在95％以上的培養物； 2)糞腸球菌CGMCC No.2386培養物的製備將冰箱保藏的斜面菌種接種到MRS種子培養基中活化，35℃、100rpm培養16h，即得； 3)釀酒酵母CGMCC No.2388培養物的製備將冰箱保藏的斜面菌種接種到98號種子培養基中活化，30℃、150rpm培養16h，即得； 4)耐酸性測定將上述製備的培養物按5％接種量分別接種於pH值2.0、3.0、4.0的人工模擬胃液中，0h計數作對照，2h、6h取樣用磷酸緩衝液按10倍系列稀釋，進行平板活菌計數，計算存活率。
本發明選育的3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383、糞腸球菌CGMCC No.2386、釀酒酵母CGMCC No.2388在胃酸中存活率結果見表1。
人工模擬胃液的製備量取9.5％～10.5％濃鹽酸16.4毫升，加蒸餾水至1000毫升，做基礎人工胃液，用鹽酸或氫氧化鈉調pH值2.0、3.0、4.0，各取10mL(9mL)，分裝於試管中，100℃下蒸汽滅菌15分鐘，在無菌條件下，每10mL液體中加入0.100g胃蛋白酶。
表1 3株菌種在人工模擬胃液中的存活率
5)耐膽鹽測定將上述製備的3株菌種的培養物，按5％接種量分別接種於0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同濃度的豬膽鹽溶液中，0h計數作對照，2h、6h取樣用生理鹽水按10倍系列稀釋計數，進行平板活菌計數，計算存活率。
本發明所選育的3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383、糞腸球菌CGMCC No.2386、釀酒酵母CGMCC No.2388在膽鹽中存活率結果見表2。
膽鹽的製備0.85％生理鹽水中各9mL，分裝於試管中，121℃下蒸汽滅菌30分鐘，在無菌條件下，製成0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同濃度的豬膽鹽溶液。
表2 3株菌種在不同濃度豬膽鹽中處理6h的存活率

6)耐高溫測定將上述製備的3株菌種的培養物，分別於50℃、60℃ 70℃、80℃水浴處理15min、30min，計算存活率。
表3 3株菌種在不同高溫下處理不同時間的存活率(％)
7)耐藥性測定採用藥敏紙片法。
表4 3株菌種的耐藥性測定結果


8)產酶測定採用中華人民共和國輕工業行業標準，工業用α-澱粉酶製劑(QB/T1805.1-1993)，工業酶製劑通用試驗方法(QB/T1803-1993)對地衣芽孢桿菌進行澱粉酶活力測定；採用行業標準工業用蛋白酶製劑(QB/T1805.3-1993)，對地衣芽孢桿菌進行蛋白酶活力測定。
地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383澱粉酶活力為800u/ml；蛋白酶活力為1000u/ml。
9)產酸測定採用離子色譜法對糞腸球菌CGMCC No.2386發酵液進行了產酸測定。
產酸結果表明，糞腸球菌CGMCC No.2386總有機酸量為4.2g/L，其中乳酸量為3.76g/L，乙酸量為0.39g/L，還有少量的異丁酸。
10)抑菌試驗採用牛津杯法對常見致病菌進行抑菌測定。
a、在裝有10mL營養肉汁培養基的試管中活化三株致病菌K99、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌，37℃恆溫培養20h； b、雙層平板的製備取直徑90mm的平板，注入滅菌的營養瓊脂15～20mL，水平放置使之凝固，作為底層，另取營養瓊脂(冷至50℃左右)與37℃240h培養的指示菌液適量(50mL培養基加8mL左右)混勻，吸取10mL澆在底層培養基上，水平放置使之凝固，作為菌層； c、加樣品用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯，打開皿蓋，放在培養基上。在牛津杯中加滿相同量的發酵液上清液(約200uL)，每個樣品2個重複。將加完樣的雙碟小心放入37℃恆溫箱內，培養16-18h後，取出測量抑菌圈大小。
表5 3株菌種對常見致病菌的抑菌結果
實施例3、地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉的製備 1)平板培養復壯將地衣芽孢桿菌菌種接種於BPY平板培養基上，於37℃培養24h，使地衣芽孢桿菌復壯，並形成單菌落，挑取單菌落於接種於斜面培養基上，於37℃培養36h； 2)一級種子的製備將步驟1)培養的枯草芽孢桿菌菌種轉接茄子瓶斜面培養基上，於37℃培養12h，使其處於對數中後期，得一級種子； 所述的斜面培養基為BPY固體培養基； 3)二級種子的製備將步驟2)製備的一級種子用無菌水製成菌懸液，接種到裝有1.6M3 BPY種子培養基的2M3種子罐中，溫度37℃，轉速200rpm，罐壓0.05Mpa，通風比1∶0.6～0.8(14.4～19.2M3/h)，培養10～14h，為二級種子液； 4)地衣芽孢桿菌發酵液的製備將步驟3)製備的二級種子液按照10％的接種量接種到裝有16M3發酵培養基的發酵罐中，溫度37℃，轉速220rpm，罐壓0.05Mpa，通風比1∶0.6～0.8，培養20h，至芽孢形成率90％以上，活菌數為1～2×1010cfu/ml，則中止發酵，得地衣芽孢桿菌發酵液； 所述的發酵培養基為麩皮2％，豆粕1％，氯化鈉0.8％，硫酸鎂0.01％。
5)地衣芽孢桿菌菌粉的製備在步驟4)製備的發酵液中加入25％的填充物米糠，混勻，進行噴霧乾燥，進風溫度120～130℃，排風溫度40～50℃，霧化器轉速15000～18000rpm，得到水分含量＜5％的地衣芽孢桿菌菌粉。
所述的填充物為米糠、沸石粉、稻殼粉中的任一種。
實施例4、糞腸球菌CGMCC No.2383菌粉的製備 1)平板培養復壯將糞腸球菌菌種接種於MRS平板培養基上，於37℃培養24h，使糞腸球菌菌復壯，並形成單菌落；挑取單菌落接種於斜面培養基上，於37℃培養24h； 2)一級種子的製備將步驟1)培養的糞腸球菌斜面菌種轉接到裝有300mlMRS培養基的500mL三角瓶中，於37℃培養12h，轉速100rpm，使其處於對數中後期，為一級種子； 3)二級種子的製備將步驟2)培養的糞腸球菌一級種子轉接到裝有1.6LMRS培養基的2.0L三角瓶中，於37℃靜止培養12h，為二級種子液； 4)發酵液的製備將步驟3)製備的二級種子液按照3％的接種量接種到裝有16M3發酵培養基的發酵罐中，溫度37℃，轉速120rpm，罐壓0.05Mpa，培養16h，至活菌數為2×109cfu/ml，中止發酵； 所述的發酵培養基為葡萄糖2％，大豆蛋白腖1％，硫酸銨0.5％，氯化鈉0.2％，硫酸鎂0.05％。
5)糞腸球菌菌粉的製備將步驟4)製備的發酵液，5000rpm離心，得到菌泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為20％的凍幹保護劑，混勻，於-45℃冷凍乾燥，得到水分含量＜5％的糞腸球菌菌粉； 所述的凍幹保護劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖、麥芽糊精和穀氨酸鈉的混合物，按照脫脂奶粉∶甘油∶蔗糖∶麥芽糊精∶穀氨酸鈉＝2∶1.0∶1.0∶1.5∶1.0的比例混合而成。
實施例5、釀酒酵母CGMCC No.2383菌粉的製備 1)平板培養復壯將冰箱保藏的釀酒酵母斜面菌種採用劃線接種的方法在98號平板培養基上劃線接種，於30℃培養46h，使釀酒酵母復壯，並形成單菌落；挑取單菌落於新鮮的98號斜面培養基上，於30℃培養36h，放置冰箱備用； 2)一級種子的製備將步驟1)培養好的釀酒酵母新鮮斜面菌種轉接到裝有200ml 98號培養基的500mL三角瓶中，於30℃培養12～16h，轉速150rpm，使其處於對數中後期，為一級種子； 3)二級種子的製備將步驟2)培養好的釀酒酵母種子液轉接到裝有1.2L98號培養基的2.0L三角瓶中，於30℃靜止培養12h，為二級種子液； 4)發酵液的製備將步驟3)製備的二級種子按照10％的接種量接種到裝有15～16M3發酵培養基的發酵罐中，溫度30℃，轉速200rpm，罐壓0.05Mpa，培養16h中止發酵，此時活菌數為1.5×109cfu/ml； 所述的發酵培養基為紅糖1％，大豆蛋白腖1％，酵母膏0.2％，氯化鈉0.5％，硫酸鎂0.01％，磷酸氫二鉀0.2％。
5)釀酒酵母菌粉的製備將步驟4)製備的發酵液，2000pm離心，得到菌泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為10～15％的凍幹保護劑，混勻後於-25℃冷凍乾燥，得到水分含量＜5％的釀酒酵母菌粉； 所述的凍幹保護劑為脫脂奶粉、甘油、麥芽糊精按照2∶0.5∶1比例混合而成。
實施例6、複合微生態製劑的製備 表6 複合微生態製劑的製備 實施例7、實施例6製備的仔豬專用型複合微生態製劑對仔豬的功效試驗 試驗動物選用35日齡斷奶，體重在9kg左右的長白x大白雜交仔豬作為試驗動物，共120頭，試驗豬來源於飼養管理規範、防疫措施嚴格的北京全利民豬場，一批選齊，出生日期相差不超過7天。
試驗設計採用隨機單因子設計。試驗分四組，每組有三個重複，每個重複10頭斷奶仔豬，組間和重複間體重差異不超過平均體重的5％。
試驗日糧採用玉米一豆粕型日糧作基礎日糧，對照組飼餵基礎日糧，試驗組I為在基礎日糧上添加1‰仔豬專用型複合微生態製劑，試驗組II為在基礎日糧上添加100g/T預防拉稀的抗生素阿散酸，試驗組III為在基礎日糧上添加1‰仔豬專用型複合微生態製劑+添加100g/T預防拉稀的抗生素阿散酸。基礎日糧組成及營養水平見表7。
飼養管理採用地面平養飼養，各組間除日糧不同外，其它條件完全一致，按常規進行。人工投料、自由採食、自由飲水，保持豬舍清潔。試驗期30天，預飼期7天。
表7 飼餵基礎日糧組成及營養水平
測試指標及方法在試驗開始和結束時早晨空腹對豬只稱重，分別以重複組為單位進行全群稱重、計算耗料量、日增重、料肉比、腹瀉率等指標，並進行差異性顯著檢驗。試驗結果如下 (1)生產性能 試驗仔豬的生產性能見表8。從表8可以看出，在平均日增重仔豬試驗組I、試驗組II和試驗組III比對照組分別提高7.3％、7.5％、9.5％；在料肉比方面試驗組I、試驗組II和試驗組III比對照組分別降低5.5％、5.2％、8.0％；在腹瀉率方面試驗組I、試驗組II和試驗組III比對照組分別降低67.3％、47.7％、70.1％。試驗組I與試驗組II相比在日增重、料肉比方面差異不顯著，但是在預防腹瀉方面差異顯著，說明仔豬專用型複合微生態製劑可以替代飼料中預防腹瀉的抗生素。試驗組III在日增重、料肉比和腹瀉方面都好於試驗組I、試驗組II和對照組，說明仔豬專用型複合微生態製劑與抗生素合用有協同作用。在平均耗料方面各組之間差異不顯著。
表8 試驗仔豬的生產性能 實施例8、實施例6製備的母豬專用型複合微生態製劑對哺乳母豬的功效試驗 1、試驗方法 試驗豬的選擇從豬場選擇臨產前1周左右分娩的母豬，選取健康無病、年齡、胎次、體重基本一致的豬18頭隨機分成兩組，試驗組和對照組各9頭。
飼料組成對照組飼餵基礎日糧，試驗組為在基礎日糧上添加1‰母豬專用型複合微生態製劑。
飼養管理試驗在本場的同一產房內進行，由同一飼養人員飼喂，飼養管理條件一致，飼料採取乾料加水拌溼後飼喂，在試驗母豬轉入產床時開始飼餵試驗料，日餵3次，自由採食，以吃飽不剩料為原則。試驗組和對照組分別統計耗料量、仔豬出生重和28天斷奶體重，採取全天供水的辦法，任豬自由飲水。每日由飼養員清理糞便，打掃圈舍一次，隨時觀察試驗組的生長和健康情況，不論是哺乳母豬還是仔豬，發生疾病，及時治療。
2、試驗結果及分析 在試驗期內，添加飼餵0.1％母豬專用型複合微生態製劑的試驗組28天斷奶均重為8.27kg，而未添加母豬專用型複合微生態製劑的對照組28天斷奶均重為7.54kg，試驗組比對照組多增重0.73kg，經t檢驗，兩組差異顯著(p＜0.05)，且試驗組成活率明顯高於對照組，其成活率分別為95.83％和91.67％。結果見表9。
表9 母豬專用型複合微生態製劑對哺乳母豬生產性能的影響

採食與健康情況整個試驗過程中，添加母豬專用型複合微生態製劑的哺乳母豬表現喜食、採食速度快、採食量比對照組略有增加，且毛色紅潤光亮。
耗材情況試驗期間試驗組和對照組平均每頭哺乳母豬耗料6.42kg和6.31kg。試驗組母豬在產仔8天後出現明顯的溢乳現象，表明母豬專用型複合微生態製劑能夠提高母豬的泌乳量。試驗後期，試驗組和對照組均有仔豬拉稀現象，肌注恩諾沙星和口服乳酶生治療後排糞正常，且試驗仔豬毛較稀，皮膚紅潤，糞便減少且乾燥，臭味也減少，說明飼餵母豬專用型複合微生態製劑對於調節哺乳母豬腸道內微生物菌群平衡，防止仔豬腹瀉增強母豬的抗病能力，有一定作用。
3、結論 (1)母豬專用型複合微生態製劑作為飼料添加劑可以提高哺乳母豬乳汁的分泌，解決母豬乳汁不足的問題； (2)在飼料中添加0.1％母豬專用型複合微生態製劑可提高仔豬斷奶重和成活率，經濟效益顯著。
實施例9、實施例6製備的蛋禽專用型複合微生態製劑對蛋雞的功效試驗 1、試驗方法 試驗動物與日糧隨機選用60周齡矮小蛋雞3000隻，隨機分為2組，每組1500隻，按照隨機分組安排試驗。
試驗日糧分別為I.空白對照組(基礎日糧組)；II.試驗組(基礎日糧+0.1％蛋禽專用型複合微生態製劑)。基礎日糧其組成和營養成分見表10。試驗雞為三層籠養，每籠3隻，自由採食和飲水，按常規進行飼養管理，試驗在北京密雲水泉村蛋雞場進行。
表10 基礎日糧組成和營養成分 注每千克日糧中維生素A12000IU，維生素D31500IU，維生素E25IU，維生素K31.0mg，硫胺素5.5mg，核黃素5.0mg，泛酸16mg，維生素B6 8.0mg，生物素0.3mg，膽鹼500mg，葉酸1.8mg，維生素B 120.008mg，鐵90mg，銅20mg，碘0.45mg，錳80mg，鋅80mg，硒0.2mg，DL-蛋氨酸1.50g. 測定指標每天觀察記錄每重複產蛋數、蛋重、不合格蛋數和雞隻死淘情況；每周末統計耗料量；分別統計每組雞產蛋後期的產蛋率、蛋重、破損率、死亡率、採食量和料蛋比。
2、結果與分析 2.1、蛋禽專用型複合微生態製劑對矮小蛋雞生產性能的影響 試驗結果如表11所示，在產蛋後期，添加0.1％蛋禽專用型複合微生態製劑組II產蛋率分別比空白對照組提高2.53％，蛋重有所增加；在蛋雞死亡率和蛋殼破損率方面下降。
表11 蛋禽專用型複合微生態製劑對矮小蛋雞生產性能的影響 3、結論 (1)在飼料中添加0.1％蛋禽專用型複合微生態製劑能顯著提高蛋雞的產蛋率，產蛋率提高2.53％； (2)在飼料中添加0.1％蛋禽專用型複合微生態製劑能減少疾病的發生和降低蛋雞的死亡率； (3)在飼料中添加0.1％蛋禽專用型複合微生態製劑能能提高機體的免疫能力，預防由於熱應激或接種疫苗等方面引起的應激反應。
綜上所述，本發明的微生態製劑添加到飼料中，對保證雞隻健康狀態、協調促進機體消化吸收能力、提高蛋雞生產性能和飼料的消化利用率等均有很好的作用。
實施例10、實施例6製備的肉禽專用型複合微生態製劑對肉雞的功效試驗 1、試驗材料與方法 試驗動物與分組選用1日齡商品代艾維因混合健雛480隻，採用完全隨機單因子設計分4組進行試驗。每組設4個重複，每重複30隻(開始體重組間差異不顯著，P＞0.05)。試驗期49天。
試驗設計以維吉尼亞黴素作為抗生素對照，對照組基礎日糧，試驗組1基礎日糧+1‰肉禽專用型複合微生態製劑，試驗組II基礎日糧+5mg/kg維吉尼亞黴素。
供試日糧與飼養管理本試驗基礎日糧配方及營養水平各組完全相同(見表12)，飼養管理條件各組完全一致。
表12 基礎日糧組成及營養水平 2、試驗結果 2.1 體增重各試驗組的體增重均極顯著高於對照組(P＜0.01)，試驗II組最高，但與試驗1組相比，差異不顯著(P＞0.05)，兩個試驗組體增重分別比對照組提高10.24％和12.48％，說明各試驗組的增重效果均好於對照組。各階段增重效果詳見表13。
表13.供試雞體重統計表 單位g 2.2採食量各組全期總採食量差異不顯著(P＞0.05)，詳見表14。
表14 採食量統計表 單位克/只 2.3 料重比、死亡率見表15 表15 料重比、死亡率分析表 各試驗組料重比均明顯低於對照組(P＜0.01)，分別比對照組降低了7.80％和9.58％；死亡率各試驗組均顯著低於對照組(P＜0.01)，分別比對照組下降75.65％和82.90％；試驗1組、試驗II組之間差異不顯著。
2.4經濟效益分析 試驗組1多耗料多耗料(克/只)(4595.9-4519.75)×飼料價格(元/克)(0.0028)＝0.21322元 菌粉成本全期耗菌粉(克/只)(4595.90×0.1％)×菌粉價格(元/克)(0.06)＝0.2757元 增重效益全期增重(克/只)(2073.68-1880.88)×銷售價格(元/克)(0.01)＝1.928元 每隻肉雞可多增收增重效益-多耗料成本-菌粉投入(1.928-0.21322-0.2757)＝1.439元 3.結論 3.1艾維因肉仔雞日糧中添加1‰肉禽專用型複合微生態製劑可使體增重提高10.24％、料重比降低7.50％、發病死亡率下降75.65％。
3.2艾維因肉仔雞日糧中添加1‰肉禽專用型複合微生態製劑組與添加5mg/kg維基尼亞黴素組在體增重、料重比、發病死亡率等指標上均差異不顯著(P＞0.05)。
3.3艾維因肉仔雞日糧中添加1‰肉禽專用型複合微生態製劑可使每隻雞增收1.439元，艾維因肉仔雞日糧中添加1‰凝結芽孢桿菌可使每隻雞增收1.308元。
權利要求
1、一種複合微生態製劑，其特徵在於包含地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、糞腸球菌CGMCC No.2386菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、釀酒酵母CGMCC No.2388菌粉中的任三種或四種。
2、如權利要求1所述的複合微生態製劑，其特徵在於包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶0.8～2.5∶1.5～2.5。
3、如權利要求1所述的複合微生態製劑，其特徵在於包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1～3.5∶0.8～3.5∶0.8～3.5。
4、如權利要求1所述的複合微生態製劑，其特徵在於包含糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶1.5～2.5。
5、如權利要求1所述的複合微生態製劑，其特徵在於包含嗜酸乳桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1～1.5∶2～2.5∶2～2.5。
6、如權利要求1所述的複合微生態製劑，其特徵在於進一步包含載體，載體為石粉、葡萄糖、硫酸鉀鋁、玉米芯粉中的任一種或兩種。
7、權利要求1～6任一項所述的複合微生態製劑在製備畜禽飼料添加劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種複合微生態製劑及其應用，具體地說是涉及包含多種益生菌的複合微生態製劑及其應用。該製劑包含地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、糞腸球菌CGMCC No.2386菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、釀酒酵母CGMCC No.2388菌粉中的任三種或四種，製劑活菌含量高，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫及耐受常用抗生素等抗逆性能和產酸、產酶及抑制病原菌等益生功能。該製劑可根據畜禽及其所處生長階段不同確定包含的益生菌種類、載體種類及其比例。本發明的複合微生態製劑能提高飼料利用效率，增加肉蛋奶等產量，促進動物生長，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善動物產品品質。
文檔編號C12R1/10GK101580799SQ200810106520
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月14日 優先權日2008年5月14日
發明者孫佔敏, 張玳華, 白玉卿, 琨 姚, 賈秋英, 宇 劉, 軍 趙, 趙雁青, 雲 莫 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司