構建幹擾載體的方法
2023-12-01 16:04:21
構建幹擾載體的方法
【專利摘要】本發明公開了構建幹擾載體的方法。步驟如下：首先幹擾片段寡脫氧核苷酸，即將目標幹擾片段脫氧核苷酸使用無菌的雙蒸水稀釋，直至其濃度達到1ug/ul,其後分別取相應的片段溶液進行退火，形成雙鏈；將載體進行雙酶切，首先製備大腸桿菌，然後將載體轉化，然後將質粒進行少量抽提，再進行酶切鑑定；最後將DNA模板與雙酶切載體連接；最後將陽性菌落PCR初步進行鑑定即可。質粒在進行抽提的時候，應加大菌體使用量；鑑定前可以使用菌脫液進行菌脫，其PH需要在5－5.5之間。本發明的有益效果是，與預期的結果一致，誤差較小，而且平均值準確，操作簡便。
【專利說明】構建幹擾載體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種實驗方法，具體來說，構建幹擾載體的方法。
【背景技術】
[0002]載體(vector)，能載帶微量物質共同參與某種化學或物理過程的常量物質，在基因工程重組DNA技術中將DNA片段(目的基因)轉移至受體細胞的一種能自我複製的DNA分子。三種最常用的載體是細菌質粒、噬菌體和動植物病毒。在基因操作過程中使用運載體有兩個目的:一是用它作為運載工具，將目的基因轉移到宿主細胞中去；二是利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量的複製(稱為克隆)。現在所用的運載體主要有兩類:一類是細菌細胞質的質粒，它是一種相對分子質量較小、獨立於染色體DNA之外的環狀DNA(—般有I~200 kb左右，kb為千鹼基對)，有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。質粒能通過細菌間的接合由一個細菌向另一個細菌轉移，可以獨立複製，也可整合到細菌染色體DNA中，隨著染色體DNA的複製而複製。另一類運載體是噬菌體或某些病毒等。現在人們還在不斷尋找新的運載體，如葉綠體或線粒體DNA也有可能成為運載體。
【發明內容】
[0003]為克服上述技術問題，我們提出了以下技術方案:
構建幹擾載體的方法，步驟如下:首先幹擾片段寡脫氧核苷酸，即將目標幹擾片段脫氧核苷酸使用無菌的雙蒸水稀釋，直至其濃度達到lug/ul，其後分別取相應的片段溶液進行退火，形成雙鏈；將載體進行雙酶切，首先製備大腸桿菌，然後將載體轉化，然後將質粒進行少量抽提，再進行酶切鑑定；最後將D N A模板與雙酶切載體連接；最後將陽性菌落P CR初步進行鑑定即可。
[0004]本發明中，質粒在進行抽提的時候，應加大菌體使用量。
[0005]本發明中，鑑定前可以使用菌脫液進行菌脫，其P H需要在5 — 5.5之間。
[0006]本發明的有益效果是，與預期的結果一致，誤差較小，而且平均值準確，操作簡便。
【具體實施方式】
[0007]構建幹擾載體的方法，步驟如下:首先幹擾片段寡脫氧核苷酸，即將目標幹擾片段脫氧核苷酸使用無菌的雙蒸水稀釋，直至其濃度達到lug/ul，其後分別取相應的片段溶液進行退火，形成雙鏈；將載體進行雙酶切，首先製備大腸桿菌，然後將載體轉化，然後將質粒進行少量抽提，再進行酶切鑑定；最後將D N A模板與雙酶切載體連接；最後將陽性菌落P c R初步進行鑑定即可。質粒在進行抽提的時候，應加大菌體使用量；鑑定前使用菌脫液進行菌脫，其P H需要在5.3。
[0008]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.構建幹擾載體的方法，其特徵在於，步驟如下:首先幹擾片段寡脫氧核苷酸，即將目標幹擾片段脫氧核苷酸使用無菌的雙蒸水稀釋，直至其濃度達到lug/ul，其後分別取相應的片段溶液進行退火，形成雙鏈；將載體進行雙酶切，首先製備大腸桿菌，然後將載體轉化，然後將質粒進行少量抽提，再進行酶切鑑定；最後將D N A模板與雙酶切載體連接；最後將陽性菌落P CR初步進行鑑定即可。
2.如權利要求1所述的構建幹擾載體的方法，其特徵在於，質粒在進行抽提的時候，應加大菌體使用量。
3.如權利要求1所述的構建幹擾載體的方法，其特徵在於，鑑定前可以使用菌脫液進行菌脫，其P H需要在5 — 5.5之間。
【文檔編號】C12N15/66GK103602696SQ201310525087
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】徐麗 申請人:徐麗