免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法

2023-12-01 17:14:46 1

專利名稱：免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法
技術領域：
本發明涉及病毒檢測的方法，尤其涉及免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的 方法。
背景技術：
登革熱和登革出血熱(DF/DHF)是由黃病毒屬的4個型登革病毒引起的蟲媒 病毒病，廣泛流行於全球熱帶和亞熱帶地區，以東南亞國家最為嚴重，我國自1978 年以來也在海南和廣東沿海一帶發生了較大的流行。目前檢測登革病毒感染的方法 仍離不開動物接種艦細胞培養接種分離，實驗結果表明，採用細胞接種培養分離 法檢測登革病毒是確診流行病菌病菌原較為可靠的方法，但費時、繁瑣，需要嚴 格的實驗割牛，並且至少l周時間內能出結果，達不到早期、快速診斷的目的。

發明內容
本發明的目的在於，克服現有技術的不^處，^f共一種免疫螢光技術檢測蚊 蟲體內登革病毒的方法，直接,AlfiL液標本或媒介蚊體內檢測出登革病毒抗原，做到 早期診斷，早發現陽性蛟媒，從而控制登革熱的播散。
本發明戶欣免疫螢光技術檢須敝蟲體內登革病毒的方法，採用AX經口感染蚊 蟲DEN-2病毒，分別用細胞培養接種_^:頭部壓片免疫螢光法進行了檢測，確認 :^S伊蚊、白紋伊蛟和C6/36細胞成功感染了病毒。用蚊頭部壓片免疫螢光技術, 可直接檢測出蛟體內是否攜帶病毒，比細胞培養和乳鼠接種更為簡便、省時、敏感。 20天內均能檢測出蛟體攜帶病毒的狀況。本發明所述方法為今後媒介蚊蟲現場監測 打下了良女 S礎。本發明戶脫的免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法，取單 只t恤感染的白紋伊蚊一20'C凍麻。在解剖鏡下用手術刀將蛟頭部切下，置於玻片 上用解剖針擠壓頭部，j鵬內物質流出、塗勻；晾乾後用預冷丙酮固定10min;滴 加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG;放溼盒內;在37'C^f牛下孵育30 min， PBGS 洗滌3次，自然晾乾後滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、 37。C孵育30min， PBS洗滌，於螢光顯微鏡下觀察染色結果。
採用本發明戶誠免疫螢光駄檢觀敝蟲體內登革病毒的方法，可以省去病毒分
離培養這一步，直接/她液標本纖介蚊體內檢測出登革病毒抗原，無疑可做到早 期診斷或及早發現陽性蚊媒，從而控制登革熱的播散。 附圖
i兌明
附圖是本發明所述免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法步驟框圖。1—
取野外現場捕捉的艦伊蚊、白紋伊i^文在-2(TC凍麻2—取一隻放在解剖鏡下用 手術刀將蚊頭部切下，置於載玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內物質流出，塗勻3 ^TP後用預冷丙酮固定10min;滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG放溼 盒內；37-C孵育30min， PBGS洗滌3次4一自然晾乾後滴加用伊文氏藍PBS稀 釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC，37。C孵育30min， PBS洗滌，自然晾乾5—將 載玻片放於螢光顯微鏡下觀察染色結果
具體實施例方式
現參照附圖，結合實施例說明如下
免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法，採用人工經口感染蚊蟲DEN-2 病毒，分別用細胞培養接種及蚊頭部壓片免疫螢光法進行了檢測，確認駄伊蚊、 白紋伊蚊和C6/36細胞成功感染了病毒。用蚊頭部壓片免疫螢光技術，可直接檢測 出蚊體內是否攜帶病毒，比細胞培養和乳鼠接種更為簡便、省時、敏感。20天內均 育g檢測出蚊體攜帶病毒的狀況。本發明戶服方法為今後媒介蚊蟲現場監測打下了良 女M礎。本發明所述的免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法，取單只t&lf[L感 染的白紋伊蚊一20°C凍麻。在解剖鏡下用手術刀將蚊頭部切下，置於玻片上用解剖 針擠壓頭部，使腦內物質流出、塗勻；晾乾後用預冷丙酮固定10min;滴加用PBS 稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG;放溼盒內;在WC條件下孵育30min， PBGS洗滌3 次，自然晾乾後滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、 37°(:孵 育30min， PBS洗滌，於螢光顯微鏡下觀察^結果。
免疫螢光技術檢測蛟蟲體內登革病毒微用材料
1 .蚊蟲
,伊蚊、白紋伊蚊為軍事醫學科學院微生物學流行病學研究所昆蟲養殖室常 年飼養的敏感品系。以及野外現場捕捉的蚊蟲。
2 .病毒
試驗用的DEN-2為New Guinea B株由軍事醫學禾鬥學院〗敫生物學流行病學研 究所劍共。乳鼠顱內傳代，以細胞維持液研磨發病乳鼠腦組織帝喊10% (w/v)懸
液，5000 rpm離心15mir^取上清用作病毒液備用。
3. C6/36細胞
來自於白紋伊蚊幼蟲的傳代細胞，用DMEM培養液28-C C02 i咅養箱內傳代 培養。
4. 抗體
DEN-2單克隆抗體，羊抗鼠IgG-FITC; 0.01%PH7.4伊文氏藍PBS液。
5. 鼠腦病毒懸液製備
給出生1-3天乳鼠腦內接種DEN-2病毒液0.02ml/鼠後，逐日觀察，5-7天內 乳鼠，出現典型的神經症狀，待乳鼠瀕死期無菌取出鼠腦，研磨，用無血清 DMEM培,製成20%病毒懸液，於液氮中凍存備用。C6/36細胞測定病毒滴度 TCID50 (細胞感染病毒半數感染量)為1089~15。
6. 蚊蟲經口感染DEN-2病毒
,伊蚊、白紋伊蛟按常規室內飼養，,後3-5天轉小蚊籠內飢餓24h。將 新採肝素抗凝小鼠眼球血、用血清DMEM作10—i稀釋的DEN-2病毒鼠腦懸液和10% 蔗糖水作1:1:1混合，相當於病毒滴度1075TCID50，加於海綿上，置蚊籠內， 蟲吸食，第2天開始對飽血雌蚊進行帶毒檢測。免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒方法步驟
第一步取野外現場捕捉的駄伊蚊、白紋伊^^在-2(TC凍麻；
第二步取一隻放在解剖鏡下用手術刀將蛟頭部切下，置於載玻片上用解剖針 擠壓頭部，{ 內物質流出，塗勻；
第三步晾乾後用預冷丙酮固定10min;滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒 IgG放溼盒內；37。C孵育30min， PBGS洗滌3次；
第四部自然晾乾後滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC， 37。C孵育30min， PBS洗滌，自然晾乾；
第五步將載玻片放於螢光顯微鏡下觀察染色結果。帶有登革病毒蚊蟲會發生 特異性黃糹ffe螢光，陰性蚊蟲則無。
採用本發明戶脫免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法，可以省去病毒分 離培養這一步，直接從血液標本或媒介蛟體內檢測出登革病毒抗原，無疑可做到早 期診斷或及早發現陽性^^某，從而控制登革熱的播散。
權利要求
1、免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法，其特徵在於採用人工經口感染蚊蟲DEN-2病毒，分別用細胞培養接種及蚊頭部壓片免疫螢光法進行了檢測，確認埃及伊蚊、白紋伊蚊和C6/36細胞成功感染了病毒，用蚊頭部壓片免疫螢光技術，可直接檢測出蚊體內是否攜帶病毒，取單只飽血感染的白紋伊蚊-20℃凍麻，在解剖鏡下用手術刀將蚊頭部切下，置於玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內物質流出、塗勻；晾乾後用預冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放溼盒內；在37℃條件下孵育30min，PBGS洗滌3次，自然晾乾後滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、37℃孵育30min，PBS洗滌，於螢光顯微鏡下觀察染色結果。
全文摘要
免疫螢光技術檢測蚊蟲體內登革病毒的方法，採用人工經口感染蚊蟲DEN-2病毒，分別用細胞培養接種及蚊頭部壓片免疫螢光法進行了檢測，用蚊頭部壓片免疫螢光技術，檢測出蚊體內是否攜帶病毒。本發明取單只飽血感染的白紋伊蚊-20℃凍麻，在解剖鏡下用手術刀將蚊頭部切下，置於玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內物質流出、塗勻；晾乾後用預冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放溼盒內；在37℃條件下孵育30min，PBGS洗滌3次，自然晾乾後滴加用伊文氏藍PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、37℃孵育30min，PBS洗滌，於螢光顯微鏡下觀察染色結果。採用本發明可做到早期診斷或及早發現陽性蚊媒，從而控制登革熱的播散。
文檔編號G01N21/00GK101109751SQ200710016328
公開日2008年1月23日 申請日期2007年7月23日 優先權日2007年7月23日
發明者趙玉強 申請人:山東省寄生蟲病防治研究所