一種安來黴素a與b分離方法
2023-12-01 17:04:56 2
專利名稱：一種安來黴素a與b分離方法
技術領域：
本發明屬於分離工程技術領域，具體涉及的是一種安來黴素A與B分離方法。
背景技術：
安來黴素(Enramycin)是一種多膚類抗生素，首次由日本武田藥品工業株式會社從土壤中分離的放線菌Streptomyces fungicidious N0.B5477的發酵液中提取得到。初步發現該物質在需氧和厭氧條件下對主要的革蘭氏陽性菌產生強大的殺菌作用，因此被命名為Enramy-cin。飼料中添加微量就可以起到顯著的促進生長和改善飼料利用率的作用。同時，恩拉黴素具有穩定性高，低毒低藥物殘留，廣譜抗革蘭氏陽性菌活性以及不產生耐藥性等優點，是一種全新的飼料添加劑。安來 黴素的鹽酸鹽為白色或微黃色結晶性粉末，分子量約為2500，融點為225 240°C，在234 238°C分解，易溶於稀鹽酸、二甲基甲醯胺，可溶於甲醇、含水乙醇，難溶於丙酮，不溶於醋酸、苯、氯仿。安來黴素分子是由13種胺基酸的17個單體組成的巨大內酯環，脂肪酸側鏈通過醯胺鍵與內酯環連接。根據其末端脂肪酸種類不同，分為安來黴素A(Cltl7H138C12N26O31)和安來黴素B(Cltl8H14tlC12N26O31)。安來黴素的抗菌機理是抑制細菌細胞壁的合成，主要是通過阻止粘肽的合成，使細胞壁缺損，導致細胞內滲透壓升高，細胞外液滲入菌體，使細菌變形腫大，破裂而死亡，主要作用於細菌的裂殖階段。粘肽是原核生物所特有的組織，所以恩來黴素對真核細胞幾乎沒有作用，不會在動物人體內殘留，已成為抗菌促生長飼料添加劑的一線產品。目前安來黴素A與B的分離技術鮮有報導，中國專利CN102675427A公開了恩拉黴素標準品的高壓液相製備方法，該方法將發酵菌絲體萃取後收集上清液，控制上清濃度有2000ug/ml範圍內後過反相高壓液相色譜柱製得純度90%以上的恩拉黴素標準品。該方法使用反相高效液相色譜儀製備恩拉黴素，設備要求高，處理量小，純度相對不高。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，而公開了一種簡單易行的安來黴素A與B的分離純化方法，降低了生產成本、儀器設備的要求低，分離純度高，有利於工業化生產。本發明的技術方案為:一種安來黴素A與B的分離方法，其具體步驟如下:(I)將安來黴素發酵液抽濾，用蒸餾水衝洗濾餅，收集濾餅；(2)將濾餅加入到有機溶劑中攪拌均勻後全部轉移到珠磨機中珠磨，收集流出漿液；(3)將流出漿液通過超濾膜濃縮6 10倍體積後過濾，收集得濾液；(4)將濾液通過平衡好的大孔吸附樹脂柱進行洗脫:先用鹽溶液洗脫，再用有機溶劑A洗脫，收集得A液，當液相檢測A液在5.0 5.2min無吸收峰時換有機溶劑B洗脫，收集得B液，當液相檢測B液在7.3 7.5min無吸收峰後停止洗脫；(5)將收集的A液和B液分別濃縮乾燥，分別得到安來黴素A和B。
優選步驟(I)中加入的蒸餾水與發酵液的體積比為I 2:1。優選步驟(2)中有機溶劑為鹽酸的丙酮水溶液或者是鹽酸的乙醇水溶液，其中有機溶劑中鹽酸的摩爾濃度均為0.04 0.08mol/L,丙酮和乙醇的體積分數均為70% 95% ；有機溶劑的加入量為有機溶劑與發酵液的體積比為I 3:1 ;珠磨條件為:珠磨溫度30 500C，轉速 5000 7000rpm，珠磨時間 10 30min。優選步驟(3)中超濾膜的截留分子量為2000 2400Da ;超濾過程的壓力為
0.04 0.06Mpa ;溫度為 30 50°C ;流速為 1.0 2.0mL/s。優選步驟(4)中的大孔吸附樹脂為AB-8、HPD400或HPD500;鹽溶液為NaCl或KCl水溶液，鹽溶液為質量分數0.5%-1.0%;有機溶劑A為甲醇的NaCl水溶液，其中NaCl水溶液的質量分數為0.5%-1.0%，甲醇與NaCl溶液的體積比為5 7:3;有機溶液B為體積分數90%-98%的乙醇或者是鹽酸的甲醇水溶液，其中鹽酸水溶液的摩爾濃度為0.004
0.006mol/L,甲醇與HCl水溶液的體積比為I 3:1。優選步驟(4)中鹽溶液的用量為2 4柱體積。有益效果:(I)所用的設備均為實驗常規設備，沒有太高要求，成本低，適合放大生產。(2)製得的安來黴素A與B純度達到96%以上，國內外均處於領先水平。
具體實施方式
以下結合實例來進一步解釋本發明，但實施案例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1將150ml安來黴素發酵液抽濾，用300ml蒸餾水衝洗濾餅，收集濾餅。將濾餅加入到450ml體積分數70%的鹽酸(0.04mol/L)丙酮水溶液中攪拌均勻後全部轉移到珠磨機中於30°C，轉速5000rpm下珠磨lOmin，收集流出漿液。將流出漿液通過截留分子量為2000Da的超濾膜，於0.04Mpa,溫度為30°C，流速為1.0mL/s條件下濃縮10倍體積後過濾，收集得濾液40ml。將濾液通過平衡好的AB-8樹脂柱進行洗脫，用質量分數0.5%的NaCl水溶液洗脫2柱體積，改用V (甲醇):V (質量分數0.5%NaCl溶液)=7:3的有機溶劑A洗脫，收集得A液，液相檢測A液，當5.0 5.2min無吸收峰時換V (甲醇):V (0.006mol/L HCl溶液)=1:1的有機溶劑B洗脫，收集得B液，液相檢測B液，當7.3 7.5min無吸收峰後停止洗脫。將收集的A液和B液分別濃縮乾燥,得安來黴素A與B的純品。分別取安來黴素純品A與B溶解後經HPLC檢測，其純度分別為98.2%和97.5%。實施例2將200ml安來黴素發酵液抽濾，用300ml蒸餾水衝洗濾餅，收集濾餅。將濾餅加入到400ml體積分數85%的鹽酸(0.06mol/L)乙醇水溶液中攪拌均勻後全部轉移到珠磨機中於40°C，轉速6000rpm下珠磨20min，收集流出漿液。將流出漿液通過截留分子量為2200Da的超濾膜，於0.05Mpa,溫度為40°C，流速為1.5mL/s條件下濃縮8倍體積後過濾，收集得濾液40ml。將濾液通過平衡好的HPD400樹脂柱進行洗脫，用質量分數0.8%的KCl水溶液洗脫3柱體積，改用V (甲醇):V (質量分數1.0%NaCl溶液)=6:3的有機溶劑A洗脫，收集得A液，液相檢測A液，當5.0 5.2min無吸收峰時換體積分數90%乙醇即有機溶劑B洗脫，收集得B液，液相檢測B液，當7.3 7.5min無吸收峰後停止洗脫。將收集的A液和B液分別濃縮乾燥，得安來黴素A與B的純品。分別取安來黴素純品A與B溶解後經HPLC檢測，其純度分別為99.1%和96.4%。實施例3將250ml安來黴素發酵液抽濾，用250ml蒸餾水衝洗濾餅，收集濾餅。將濾餅加入到250ml體積分數95%的鹽酸(0.08mol/L)丙酮水溶液中攪拌均勻後全部轉移到珠磨機中於50°C，轉速7000rpm下珠磨30min，收集流出漿液；將流出漿液通過截留分子量為2400Da的超濾膜，於0.06Mpa,溫度為50°C，流速為2.0mL/s條件下濃縮6倍體積後過濾，收集得濾液35ml。將濾液通過平衡好的HPD500樹脂柱進行洗脫，用質量分數1.0%的NaCl水溶液洗脫4柱體積，改用V(甲醇):V(質量分數0.75%NaCl溶液)=5:3的有機溶劑A洗脫，收集得A液，液相檢測A液，當5.0 5.2min無吸收峰時換V(甲醇):V(0.004mol/L HCl溶液)=3:1的有機溶劑B洗脫，收集得B液，液相檢測B液，當7.3 7.5min無吸收峰後停止洗脫。將收集的A液和B液分別濃縮乾燥，得安來黴素A與B的純品。分別取安來黴素純品A與B溶解後經HPLC檢測，其純度分別為96.8%和96.5%。實施例4將IOOml安來黴素發酵液抽濾，用150ml蒸餾水衝洗濾餅，收集濾餅。將濾餅加入到250ml體積分數70%的鹽酸(0.05mol/L)乙醇水溶液中攪拌均勻後全部轉移到珠磨機中於50°C，轉速5000rpm下珠磨20min，收集流出漿液；將流出漿液通過截留分子量為2000Da的超濾膜，於0.06Mpa，溫度為50°C，流速為2.0mL/s條件下濃縮6倍體積後過濾，收集得濾液35ml。將濾液通過平衡好的AB-8樹脂柱進行洗脫，用質量分數0.5%的KCl水溶液洗脫3柱體積，改用V (甲醇):V (質量分數0.6%NaCl溶液)=5:3的有機溶劑A洗脫，收集得A液，液相檢測A液，當5.0 5.2min無吸收峰時換98%乙醇即有機溶劑B洗脫，收集得B液，液相檢測B液，當7.3 7.5min無吸收峰後停止洗脫。將收集的A液和B液分別濃縮乾燥，得安來黴素A與B的純品。分別取安來黴素純品A與B溶解後經HPLC檢測，其純度分別為96.9%和97.2%ο`
權利要求
1.一種安來黴素A與B的分離方法，其具體步驟如下: (1)將安來黴素發酵液抽濾，用蒸餾水衝洗濾餅，收集濾餅； (2)將濾餅加入到有機溶劑中攪拌均勻後全部轉移到珠磨機中珠磨，收集流出漿液； (3)將流出漿液通過超濾膜濃縮6 10倍體積後過濾，收集得濾液； (4)將濾液通過平衡好的大孔吸附樹脂柱進行洗脫:先用鹽溶液洗脫，再用有機溶劑A洗脫，收集得A液，當液相檢測A液在5.0 5.2min無吸收峰時換有機溶劑B洗脫，收集得B液，當液相檢測B液在7.3 7.5min無吸收峰後停止洗脫； (5)將收集的A液和B液分別濃縮乾燥，分別得到安來黴素A和B。
2.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於步驟(I)中加入的蒸餾水與發酵液的體積比為I 2:1。
3.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於步驟(2)中有機溶劑為鹽酸的丙酮水溶液或者是鹽酸的乙醇水溶液，其中有機溶劑中鹽酸的摩爾濃度均為0.04 0.08mol/L，丙酮和乙醇的體積分數均為70% 95% ;有機溶劑的加入量為有機溶劑與發酵液的體積比為I 3:1 ;珠磨條件為:珠磨溫度30 50°C，轉速5000 7000rpm，珠磨時間10 30mino
4.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於步驟(3)中超濾膜的截留分子量為2000 2400Da ;超濾過 程的壓力為0.04 0.06Mpa ;溫度為30 50°C ;流速為1.0 2.0mL/s。
5.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於步驟(4)中的大孔吸附樹脂為AB-8、HPD400或HPD500;鹽溶液為NaCl或KCl水溶液，鹽溶液為質量分數0.5%-1.0% ;有機溶劑A為甲醇的NaCl水溶液，其中NaCl水溶液的質量分數為0.5%-1.0%，甲醇與NaCl溶液的體積比為5 7:3 ;有機溶液B為體積分數90%-98%的乙醇或者是鹽酸的甲醇水溶液，其中鹽酸水溶液的摩爾濃度為0.004 0.006mol/L,甲醇與HCl水溶液的體積比為I 3:1。
6.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於步驟(4)中鹽溶液的用量為2 4柱體積。
全文摘要
本發明公開了一種安來黴素A與B的分離方法。主要包括菌絲體的珠磨破碎、超濾濃縮、大孔樹脂柱的吸附洗脫、濃縮乾燥等。本方法通過加入有機溶劑進行珠磨，將細胞破碎與萃取集成到一步完成，同時選擇了合適的大孔樹脂及洗脫方法，能有效的將安來黴素A與B分離，且其純度達到96%以上，該方法儀器設備要求低、工藝簡單、易操作、適合工業化生產。
文檔編號C07K7/08GK103232530SQ20131013534
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者胡永紅, 楊文革, 李佼佼, 管珺, 開玉美, 曹崢 申請人:南京工業大學