一種鑑定大豆疫黴β-微管蛋白基因核苷酸點突變及其對苯醯菌胺抗藥性的方法

2023-12-09 08:47:11 4

專利名稱：一種鑑定大豆疫黴β-微管蛋白基因核苷酸點突變及其對苯醯菌胺抗藥性的方法
技術領域：
本發明涉及大豆疫黴β-微管蛋白基因的克隆及其在殺菌劑苯醯菌胺抗性監測中的應用，具體公開一種快速鑑定大豆疫黴β-微管蛋白基因核苷酸點突變及其對苯醯菌胺抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬於分子生物學技術領域。
背景技術：
大豆疫病是由大豆疫黴(Phytophthorasojae Kaufmann&Gerdemann)引起的一種具有危險性、毀滅性的卵菌病害。其在大豆各生育期均可發病，其中感病品種一般減產25% 50%，高感品種可達90%以上，甚至絕收；並且籽粒蛋白含量明顯下降，使用價值受到影響。該病害自1948年在美國印第安納州東北部首次被發現後，迅速擴展到巴西、阿根廷等20多個國家。在我國則主要發生在黑龍江、安徽、福建等省，為重要的外檢和內檢病 害。大豆疫黴為同宗配合的卵菌，自然條件下即可發生有性生殖，加速了基因的重組與交換，使得田間大豆疫黴菌株的遺傳多樣性越來越豐富；而且大豆疫黴生理小種毒性變異明顯，新小種層出不窮，許多大豆抗性基因已被新的小種所克服，抗病資源失去效用。而化學防治的快速有效，使之成為該病害防治中較為重要的措施。但目前國內外專門用於卵菌病害防治的殺菌劑種類較少，其中最具有代表性的是以甲霜靈為代表的苯醯胺類殺菌齊U，是第一代專門用於防治卵菌病害的一大類重要的內吸性殺菌劑。然而，由於該類殺菌劑的作用位點較為單一，而且大面積廣泛使用，致使病原菌對該類藥劑的抗藥性接踵而至，並且發展迅速，目前病原菌對甲霜靈的抗性問題已尤為嚴重。而苯醯菌胺(zoxamide)則是在此背景下應運而生的一種對卵菌具有特效的苯甲醯胺類殺菌劑，是目前市場上唯一一種作用於微管蛋白的殺卵劑。該類殺菌劑在2001年開始商品化，並已在歐美地區廣泛使用，在我國也已正處於登記推廣當中。儘管苯醯菌胺主要用來防治卵菌病害，它對Botrytis cinerea、Venturiainaequalis、Monilinia fructicola>Mycosphaerella fijiensis和Cercospora beticola等病原真菌也具有一定的活性。已有研究表明苯醯菌胺與苯並咪唑類殺菌劑具有類似的作用機制，均作用於靶標菌的β_微管蛋白。以多菌靈為代表的苯並咪唑類殺菌劑在田間使用後，抗藥性問題很快產生並日益嚴重，FRAC(Fungicide Resistance Action Committee)將其列為高等抗性風險的殺菌劑。已有報導表明，苯並咪唑類殺菌劑的抗性主要是由於病原菌微管蛋白第198位和200位胺基酸發生了位點突變所造成，並且已建立了相應的田間快速檢測方法，包括等位基因特異性PCR(Allele-specific polymerase chainreaction, AS-PCR)等。目前，大豆疫黴對苯醯菌胺的抗藥性分子機制還未明確，而明確其具體的抗性基因，建立抗性分子檢測方法，可以對抗性菌株進行早期檢測，了解其抗性發展的動態，制定合理的病害管理方案，以延緩抗藥性的產生。傳統生物學方法和分子生物學方法是植物病原菌抗藥性檢測或監測中常見的兩種方法。傳統生物學方法即是指測定藥劑對病原菌的EC5tl以區分敏感和抗性菌株，需要多個藥劑處理，多次重複，檢測周期長、工作量大、消耗的人力資源和材料較多；而且這種方法檢測靈敏度低，要求抗藥性菌株的突變頻率在I %以上。而分子生物學方法，從提DNA到特異性PCR或酶切分析，檢測所需時間短、檢測的靈敏度高，檢測頻率在10_5 10_4，更適用於檢測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。

發明內容
本發明旨在提供一種檢測或輔助檢測大豆疫黴中β_微管蛋白基因是否存在突變位點的方法及其專用弓I物對。本發明所提供的檢測或輔助檢測大豆疫黴中β_微管蛋白基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟以待測大豆疫黴的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為288bp的片段，則所述待測大豆疫黴中β _微管蛋白基 因存在或候選存在突變位點；所述突變位點是指大豆疫黴中β -微管蛋白基因的基因組序列自5』末端起第716位核苷酸為C。所述大豆疫黴中β-微管蛋白基因的基因組序列自5』末端起第716位核苷酸也就是SEQ ID NO :3中自5』末端起第716位核苷酸。上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為67V。本發明所提供的檢測或輔助檢測大豆疫黴中β_微管蛋白基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。本發明的另一個目的是提供大豆疫黴中β_微管蛋白基因或蛋白的突變位點，其中擴增β-微管蛋白基因全序列的引物由SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示DNA分子組成，退火溫度為63. 5°C。本發明所提供的大豆疫黴中β_微管蛋白基因的一個突變位點，為大豆疫黴中β-微管蛋白的基因組序列自5』末端起716位核苷酸為C。所述β_微管蛋白基因的基因組序列自5』末端起第716位核苷酸也就是SEQ ID NO :3中自5』末端起的第716位核苷酸。本發明所提供的大豆疫黴中微管蛋白的一個突變位點，為大豆疫黴中微管蛋白自N端起第239位胺基酸為絲氨酸。所述β -微管蛋白自N端起第239位胺基酸也就是SEQ ID NO :4中自5』末端起的第239位胺基酸。以上任一所述突變位點在鑑定大豆疫黴抗藥性中的應用也屬於本發明的保護範圍；所述抗藥性為抗苯醯菌胺。上述應用中，存在所述突變位點的大豆疫黴具有或候選具有對苯醯菌胺的抗藥性。SEQ ID NO :3所示基因或SEQ ID NO :4所示蛋白也屬於本發明的保護範圍。本發明提供的檢測大豆疫黴對苯醯菌胺產生抗藥性的點突變的方法，可以用於快速、靈敏地檢測田間大豆疫黴對苯醯菌胺的抗性發生發展動態，為抗藥性的治理提供技術支持，便於及時調整病害防治策略，以延緩和控制抗藥性的進一步發展。


圖1，圖2為對苯醯菌胺表現抗性和敏感的大豆疫黴菌株微管蛋白基因全序列和蛋白序列比對結果，發現與抗性相關的一個突變位點。其中，Ps9、Psl3、Ps52、Ps53、AH1302 和 PsJMS2 為敏感菌株，RZ2-2、RZ5-1、RZ6-2、RZ9-2、RZlO-U RZ12-1、RZ14-1 及RZ15-1為抗性菌株。圖3為採用不同AS-PCR引物進行溫度梯度PCR擴增電泳圖，表明各個引物的特異性存在差異。S :敏感菌株；R :抗性菌株；由上至下正向引物依次為RZ-FA、RZ-FT、RZ-FC及RZ-FG，反向引物均為SRZ-A。圖4為採用特異性引物RZ-FC和SRZ-A擴增對苯醯菌胺表現敏感和抗性的大豆疫黴菌株的 AS-PCR 電泳圖。Marker DNA Marker II ;RZ2_2、RZ6-2、RZ9-2、RZ10-1 及 RZ8-2 為抗性菌株；PsJMS2、Ps6、Ps4、Psl3和Ps52為敏感菌株；CK為陰性對照。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。文中「抗性菌株」均指對苯醯菌胺抗性的大豆疫黴菌株；「敏感菌株」均指對苯醯囷胺敏感的大 疫黴囷株。下述實施例中使用的大豆疫黴菌株為抗性菌株RZ2-2、RZ5-1、RZ6-2、RZ9-2、RZlO-U RZ12-1、RZ14-1 及 RZ15-1 ;敏感菌株 Ps4、Ps6、Ps9、Psl3、Ps52、Ps53、AH1302 和PsJMS2。上述菌株Ps4、Ps6、Ps9、Psl3、Ps52及Ps53均採自於中國福建地區，其中Ps4、Ps6、Ps9和Psl3由福建省農業科學院陳福如研究員饋贈，Ps52和Ps53由中國農業科學院朱振東研究員饋贈；AH1302採自於中國安徽地區，由安徽省農業科學院戚仁德研究員饋贈；PsJMS2採自於中國黑龍江地區，由中國農業科學院朱振東研究員饋贈。抗性菌株RZ2-2、RZ5-l、RZ6-2、RZ9-2、RZ10-1、RZ12-1、RZ14-1及RZ15-1均通過藥劑馴化的方法獲得，親本菌株均為PsJMS2。以上菌株均經過現有的形態學和分子生物學方法鑑定為大豆疫黴菌株。上述各個菌株均經過菌落生長速率法進行敏感性測定和抗藥性驗證。實施例I、大豆疫黴對苯醯菌胺的敏感性測定8 株敏感菌株 Ps4、Ps6、Ps9、Psl3、Ps52、Ps53、AH1302 和 PsJMS2 ；8 株抗性菌株RZ2-2、RZ5-1、RZ6-2、RZ9-2、RZ10-1、RZ12-1、RZ14-1 及 RZ15-1。胡蘿蔔培養基胡蘿蔔200g，榨汁，4層紗布過濾，蒸餾水定容至1L，121°C溼熱滅菌20分鐘。I、實驗步驟如下I)將苯醯菌胺用二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide DMS0)配成IO5 μ g/mL的母液。將苯醯菌胺逐級稀釋成 200 μ g/mL、300 μ g/mL>400 μ g/mL、500 μ g/mL、600 μ g/mL 和700 μ g/mL的濃度梯度，1%0 DMSO作為空白對照，以測定8株大豆疫黴敏感菌株的敏感性。對於8株大豆疫黴抗性菌株的敏感性測定，1%。DMSO作為空白對照，測定其在IO5 μ g/mL濃度下的抑制率。
2)按由低到高的順序，用移液槍吸取各個濃度梯度的藥液480μ L加入已滅菌的冷卻至45°C的480mL胡蘿蔔培養基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培養基倒入直徑為9cm的培養皿中，以只加480 μ L DMSO的處理為空白對照。每個濃度重複3次。3)取25°C下黑暗培養4天後的大豆疫黴菌株，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為O. 5cm的菌餅，菌絲面向下接種於步驟2)中的帶藥和對照平板中，置於25°C培養箱中黑暗培養，4d後測量菌落直徑。4)十字交叉法測量菌落直徑，根據菌落平均直徑值計算出各個濃度下對供試菌株的菌絲生長的抑制率。然後將抑制率轉化成機率值(Y)，藥劑濃度轉換成以10為底的對數值(X),在Microsoft Excel中作回歸直線,分別求出各個供試大豆疫黴菌株對苯醯菌胺的毒力回歸曲線方程Y = a+bX,以及相關係數r和有效抑制中濃度EC5tl值，
權利要求
1.一種檢測或輔助檢測大豆疫黴中β-微管蛋白基因或對應蛋白是否存在位點突變的方法，步驟如下 以待測大豆疫黴的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為288bp的片段，則所述待測大豆疫黴中β _微管蛋白基因存在或候選存在突變位點； 所述突變位點指大豆疫黴中β_微管蛋白基因的基因組序列自5』末端起第716位核苷酸為C。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增中，退火溫度為67V。
3.—種檢測或輔助檢測大豆疫黴中β_微管蛋白基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示 DNA 分子組成。
4.大豆疫黴中β_微管蛋白基因的一個突變位點，為大豆疫黴中β_微管蛋白基因的基因組序列自5』末端起第716位核苷酸為C。
5.一種擴增大豆疫黴微管蛋白基因全序列的引物對，由SEQ ID NO :5和SEQID NO 6所示DNA分子組成，PCR擴增中，退火溫度為63. 5°C。
6.大 疫黴中β_微管蛋白的Iv突變位點，為大 疫黴中β_微管蛋白的自N端起第239位胺基酸為絲氨酸(Ser，S)。
7.權利要求4或6所述突變位點在鑑定大豆疫黴抗藥性中的應用；所述抗藥性是指對苯醯菌胺的抗藥性。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於存在所述突變位點的大豆疫黴具有或候選具有對苯醯菌胺的抗藥性。
9.SEQ ID NO 3所示基因。
10.SEQ ID NO 4 所示蛋白。
全文摘要
本發明涉及大豆疫黴β-微管蛋白基因的克隆，突變位點的鑑定及其在苯醯菌胺(zoxamide)抗性監測中的應用，具體公開了一種鑑定大豆疫黴β-微管蛋白基因的716位核苷酸突變對苯醯菌胺產生抗藥性的分子檢測方法及專用引物。該引物對，由SEQID NO1和SEQ ID NO2所示DNA分子組成，PCR退火溫度為67℃。本發明提供的檢測大豆疫黴對苯醯菌胺抗藥性的分子診斷方法，具有靈敏度高、簡捷快速、穩定性好的特點，可以用於高通量地檢測田間大豆疫黴對苯醯菌胺的抗性發生發展動態，對抗藥性的早期預警以及有效控制病原菌抗藥性的發展具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102925565SQ20121039872
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者劉西莉, 蔡萌, 陳磊, 畢揚, 林東, 李波濤, 李健強, 劉鵬飛 申請人:中國農業大學