紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2及其應用的製作方法
2023-12-08 19:43:21 1
紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2及其應用。本發明應用RT-PCR和RACE技術從紫花苜蓿基因組中克隆NAC家族相關基因，命名為MsNAC2，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.11所示，並構建了含有加強型綠色螢光蛋白（EGFP）基因的融合表達載體。本發明應用螢光定量PCR技術分析了該基因在紫花苜蓿中的表達模式，以及該基因與逆境脅迫（冷害，鹽害，乾旱）之間的關係，發現該基因在菸草中過表達可提高轉基因菸草植株的抗寒、抗旱和耐鹽性，該基因可用於其他單雙子葉植物的遺傳轉化，提高其抗逆性。
【專利說明】紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，具體地說，涉及紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2及其應用。
【背景技術】
[0002]NAC轉錄因子(包括NAM、ATAFl/2和⑶C2)是植物特有的一種具有多種調控作用的轉錄因子，廣泛存在與陸生植物中，這類轉錄因子的主要結構特點是N端為保守的大約150個胺基酸殘基的NAC結構域，可以結合DNA和其他蛋白，可以分成從A~E5個保守區；C端則為高度多樣性的轉錄激活調控區，富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、穀氨酸等，研究發現有些NAC蛋白的C-端具有蛋白結合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成員在逆境應答網絡中起作用。擬南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到乾旱、高鹽以及脫落酸(ABA)的誘導表達，它們能顯著提高植株的耐旱能力(Tran et al.，2004)。擬南芥LOVl基因能增強植株的抗凍能力(Yoo et al.，2007)。來自水稻的 SNACl/2 (stress-responsive NAC2)基因受到乾旱、高鹽、低溫、傷以及ABA的誘導表達，其過表達植株耐冷、抗鹽並能抵禦乾旱(Hu et al., 2008) ?過 量表達0sNAC6基因的水稻雖然生長慢、產量低，但卻顯示出對乾旱、高鹽以及枯萎病的較強抗性(Nakashima et al.，2007)。儘管NAC基因的功能還有待深入研究，但它們在植物遺傳工程方面已展現出了巨大的應用潛力。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2及其應用。
[0004]本發明提供紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2，其具有:
[0005]I) SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或
[0006]2) SEQ ID N0.11所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或
[0007]3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0008]本發明提供了含有上述基因MsNAC2的表達載體。
[0009]在本發明的一個實施例中，得到的含有基因MsNAC2的表達載體為pBIGFP-MsNAC2。
[0010]該表達載體的構建方法為:以紫花苜蓿葉的總RNA反轉的cDNA為模板，進行PCR反應，引物序列為:
[0011]上遊引物:5'-TCTAGAATGATCAGTCGATGGAAACACTTC」3 (SEQ ID N0.13)
[0012]下遊引物:5'-GGTACCGACTTGGGCAGATACATAAAGAC-' 3 (SEQ ID N0.14)；
[0013]將RT-PCR擴增產物回收後連接在PMD18-T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α菌株，選取陽性克隆進行測序，用XbaI和KpnI將MsNAC2基因從pMD18_T上卸載下來，回收後連接到含有eGFP植物表達載體pBIGFP的XbaI和KpnI位點中，構建得到pBIGFP_MsNAC2。
[0014]含有上述表達載體的宿主細胞也屬於本發明的保護範圍。
[0015]本發明還提供了含有基因MsNAC2的轉化植物細胞。[0016]本發明提供了 MsNAC2基因在製備轉基因植物中的應用。
[0017]優選地，所述的植物為擬南芥、菸草、洋蔥、水稻或棉花。
[0018]本發明提供了 MsNAC2基因在提高植物抗逆性方面的應用。
[0019]所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐鹽性。
[0020]本發明還提供了克隆紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2的方法，包括以下步驟:
[0021](I)利用RT-PCR方法從紫花苜蓿基因組中擴增獲得NAC的保守區片段序列；
[0022](2)根據步驟(1)的保守區序列設計3' RACE引物，然後以紫花苜蓿總RNA為模板，進行3' RACE片段擴增；
[0023](3)設計Y RACE引物擴增Y RACE片段；
[0024](4)用DNAMAN5.2軟體將保守區序列，3' RACE片段和Y RACE片段拼接成完整的全基因序列。
[0025]其中，步驟(1)的RT-PCR方法中，所用引物序列為:
[0026]上遊引物序列為5' -ACCAAACGGTTCAAGGCCGAACC」3 (SEQ ID NO: 1)，下遊序列為 5' -CGATACTCGTGCATGATCCAATTG-' 3 (SEQ ID NO:2)。
[0027]步驟(1)紫花苜蓿的總RNA經反轉錄後得到cDNA，其PCR反應程序為:94°C預變性5min, (94°C 10s,55°C 20s, 72°C lmin) 30 個循環，72°C IOmin0`[0028]其中，步驟(2)的 3 ' RACE 引物序列為 5 ' -GTTCAAGGCCGAACCGGGCTG-3 ' (SEQID N0:3)。該步驟使用 3' -Full RACE Set Agarose Regular 試劑盒擴增 3' RACE 片段。
[0029]其中，步驟(3)的5'RACE引物5' -AGCCCGGTTCGGCCTTGAACC-3' (SEQ ID NO:4)。該步驟使用5' -Full RACE Set Agarose Regular試劑盒擴增5' RACE片段。
[0030]本發明具有下列優點及有益效果:
[0031]本發明提供了紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2 (核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示)及其在作物育種中的應用。該基因不僅受低溫和高鹽誘導高表達，而且還受乾旱和ABA脅迫誘導表達。洋蔥表皮亞細胞定位研究表明MsNAC2為核定位基因。先前報導的抗逆基因在功能方面多數具有單一性，而研究發現本發明MsNAC2基因在提高轉基因菸草植株的抗寒、抗旱和耐鹽性等方面均據有較明顯的功效。該基因可用於其他單雙子葉植物的遺傳轉化，顯著提高其抗逆性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為融合表達載體pBIGFP_MsNAC2結構示意圖。
[0033]圖2為表達載體pBIGFP結構示意圖。
[0034]圖3為MsNAC2在脅迫誘導後的相對表達。其中，A圖為250mM NaCl脅迫處理下MsNAC2在葉片和根中的相對表達；B圖為10%PEG6000脅迫處理下MsNAC2在葉片和根中的相對表達；C圖為100 μ M ABA誘導下MsNAC2在葉片和根中的相對表達；D圖為4°C處理下MsNAC2在葉片和根中的相對表達。
[0035]圖4為MsNAC2基因亞細胞定位照片。其中，A圖為含MsNAC2_GFP融合基因的轉基因菸草在白光下的圖片圖為含MsNAC2-GFP融合基因的轉基因菸草在紫外光下的圖片；C圖為對照組只含GFP綠色螢光蛋白基因的轉基因菸草在白光下的圖片；D圖為對照組只含GFP綠色螢光蛋白基因的轉基因菸草在紫外光下的圖片。[0036]圖5為逆境脅迫下轉MsNAC2基因菸草生長情況，250mM NaCl處理20d後，轉基因菸草長勢良好，而野生型菸草葉片幾乎全部失綠，變為淡黃色。
[0037]圖6為逆境脅迫下轉MsNAC2基因菸草生長情況，10%PEG處理20d後，轉基因菸草長勢良好，而野生型菸草葉片幾乎全部變為水潰狀。
[0038]圖7為逆境脅迫下轉MsNAC2基因菸草生長情況，4°C處理6d後再進行恢復培養IOd後，轉基因菸草植株葉片要明顯大於野生型，根系也比野生型發達。
【具體實施方式】
[0039]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
[0040]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。
[0041]實施例1紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2的獲得
[0042]首先根據豆科植物花生NAC轉錄因子基因AhNAC2和AhNAC3 (EU755023和EU755022 )序列，設計苜蓿NAC基因同源引物，上遊引物序列為5 ' -ACCAAACGGTTCAAGGCCGAACC」3 (SEQ ID N0.1)，下遊序列為 5' -CGATACTCGTGCATGATCCAATTG-' 3 (SEQ IDN0.2)。然後，利用RT-PCR技術從紫花苜蓿基因組中首先擴增獲得NAC的保守區片段序列。
[0043]1、紫花苜蓿總RNA的提取:採用TaKaRa RNAiso Plus提取總RNA。
[0044]2、cDNA第一鏈的合成:
[0045]反應體系如下:
[0046]
【權利要求】
1.一種紫花苜蓿逆境響應基因，其為MSNAC2，具有: 1)SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或 2)SEQ ID N0.11所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或 3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述基因的表達載體。
3.如權利要求2所述的表達載體，其為pBIGFP-MsNAC2。
4.含有權利要求2或3所述載體的宿主細胞。
5.權利要求1所述的基因在製備轉基因植物中的應用。
6.權利要求1所述的基因在提高植物抗逆性方面的應用。
7.克隆權利要求1所述紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)利用RT-PCR方法從紫花苜蓿基因組中擴增獲得NAC的保守區片段序列； (2)根據步驟(1)的保守區序列設計3，RACE引物，然後以紫花苜蓿總RNA為模板，進行3' RACE片段擴增； (3)設計5'RACE引物擴增5' RACE片段； (4)用軟體將保守區序列，3'RACE片段和5' RACE片段拼接成完整的全基因序列，得到紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC2。`
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，步驟(1)的RT-PCR方法中，所用引物序列中上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示,下遊序列如SEQ ID N0.2所示。
9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，步驟(2)的:TRACE引物序列如SEQ IDN0.3所示。
10.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，步驟(3)的5'RACE引物序列如SEQ IDN0.4所示。
【文檔編號】C12N15/29GK103710357SQ201310717761
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】申玉華, 徐振軍, 楊曉坡, 林景衛, 李望豐 申請人:申玉華, 徐振軍, 楊曉坡, 林景衛, 李望豐