治療或預防身體通道疾病的組合物和方法

2023-12-08 18:48:06 1

專利名稱：治療或預防身體通道疾病的組合物和方法
技術領域：
概括地講，本發明涉及治療或預防身體通道疾病的組合物和方法，更具體地說，涉及包含可釋放到身體通道外壁的治療劑的組合物。
背景技術：
在身體內有許多允許必需物質流動的通道。例如，這些通道包括動脈和靜脈，食管，胃，小腸和大腸，膽道，輸尿管，膀胱，尿道，鼻通道，氣管和其他氣道，以及男性和女性生殖道。損傷、各種外科手術或疾病都可能導致這樣的身體通道的狹窄、衰弱和/或阻塞，導致嚴重的併發症和/或甚至死亡。
例如，有多種類型的腫瘤(良性的和惡性的)可導致對身體通道壁的損害或腔的阻塞，由此減慢或阻止了物質在通道中的流動。僅1996年一年，估計在美國因食道癌死亡的人數在11,200人以上，因大腸和小腸癌死亡的人數在51,000人以上，而因直腸癌死亡的人數近17,000人。因癌症而導致的身體通道的阻塞不僅本身自然而然地會威脅生命，而且他們會限制患者的生活質量。
對於引起腫瘤性阻塞的大多數腫瘤的最初治療是手術切除和/或化學治療，放射治療或雷射治療。不幸的是，當腫瘤已導致身體通道阻塞的時候，常常已不宜手術且一般將不適合傳統治療。解決該問題的一種方法是插入腔內固定模。簡言之，固定模是置於已被腫瘤或其他組織/物質阻斷的身體通道腔中用於機械式撐開通道的設備。常用的固定模的代表實例包括Wall固定模，Stecker固定模，Gianturco固定模和Palmaz固定模(參見，例如美國專利5,102,417,5,195,984,5,176,626，5,147,370,5,141,516,4,776,337)。不過，在腫瘤性阻塞中使用固定模的一個顯著缺點是腫瘤經常能通過該固定模的小間隙生長到腔中。另外，存在於腔中的固定模可能導致反應性或炎性組織(例如血管，成纖維細胞和白細胞)向內生長到該固定模的表面上。如果這種向內生長(由腫瘤細胞和/或炎性細胞構成)到達了固定模的內表面並危及到腔，結果將使已恰當插入了固定模的身體通道重新阻塞。
儘管不是腫瘤但也涉及增殖的其他疾病同樣可阻塞身體通道。例如，因良性前列腺增生而導致的前列腺尿道狹窄是影響60％的60歲以上男性和100％80歲以上男性的一個嚴重問題。目前的藥物治療，諸如5α-還原酶抑制劑(例如非那司提)，或α-腎上腺素能阻滯劑(例如Terazozan)一般僅對有限的患者人群是有效的。
另外，也可以進行手術治療(例如經尿道前列腺切除術(TURP)；開放式前列腺切除術，或內泌尿科手術如雷射前列腺切除術，使用微波、低溫、冷凍破壞法或插入固定模)，但這些治療一般會導致多種併發症如出血，感染，失禁，陽痿和再發性疾病。
除了腫瘤或增生性疾病以外，其他疾病如血管疾病也可導致身體通道的狹窄、衰弱和/或阻塞。按照1993年的估計(來源-美國心臟及中風基本主頁(Foundation homepage))，有六千萬以上美國人患有一種或多種形式的心血管疾病。在這一年內這些疾病奪去了954,138人的生命(佔美國死亡總人數的41％)。
氣囊血管成形術(有或沒有插入固定模)是血管疾病的治療中最廣泛使用的一種方法；也可使用其他方法如雷射血管成形術。儘管這是在許多血管系統嚴重狹窄的情況下選用的療法，但仍有約三分之一進行了氣囊血管成形術的患者(來源於心臟和中風基本主頁)在最初手術後的6個月內治療過的動脈恢復狹窄狀態(再狹窄)，經常嚴重到足以需要再次手術。
產生這樣的血管疾病(包括例如再狹窄)至少有部分原因是在血管平滑肌細胞(VSMC)遷移，VSMC增生，和胞外基質沉積後繼發內膜增厚。簡單地說，血管內皮作為血液可在其上平滑流動的非形成血栓的表面和將血液成分與構成血管壁的組織分離開的屏障。內皮細胞還釋放硫酸肝素，前列環素，EDRF和其他抑制血小板及白細胞粘附、VSMC收縮、VSMC遷移和VSMC增生的因子。內皮細胞的任何損失或破壞，諸如在氣囊血管成形術、動脈粥樣硬化斑切除術或固定模插入過程中發生的那些，都可能導致血小板粘著，血小板聚集和血栓形成。活化血小板能釋放可產生血管收縮的物質(5-羥色胺和血栓烷)和/或促進VSMC遷移及增生的物質(PDGF，表皮生長因子，TGF-β，和肝素酶)。動脈釋放的組織因子刺激血塊形成，從而導致平滑肌細胞可遷移和增生到其中的血纖蛋白基質中。
這一連串的事件使得血管平滑肌細胞由收縮性的轉變為分泌表現型。血管成形術誘導的細胞溶解和基質破壞導致鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)局部釋放，這反過來通過誘導PDGF的產生而直接和間接地刺激VSMC增生。除了PDGF和bFGF以外，血小板釋放的EGF和胰島素生長因子-1也會刺激VSMC增殖。
血管平滑肌細胞還被誘導遷移到血管的中層和內膜中。這可由基質金屬蛋白酶的釋放和活化造成，基質金屬蛋白酶的釋放和活化使得VSMC通過胞外基質和血管壁的內彈性層的路徑降解。當血管平滑肌細胞遷移和增生後便沉澱含有葡萄糖胺聚糖，彈性蛋白和膠原的胞外基質，這構成了增厚內膜的最大部分。大部分的再狹窄過程可以是因血管壁的重建使得動脈的大小全面改變而造成的；至少有一些是在外膜內(除了中層以外)繼發增生的。這些過程的最終結果是復發血管壁狹窄，這經常嚴重到足以需要重新進行手術。
總而言之，實際上在血管腔中進行的任何強有力的操作都將破壞或剝露出其內皮襯層(lining)。因此，血管疾病自身的治療方法和治療性手術後的再狹窄的治療仍然是這種疾病的長期治療效果中要考慮的主要問題。
除了腫瘤性阻塞和血管疾病外，還有許多導致身體通道阻塞的急性和慢性炎性疾病。例如，這些包括脈管炎，胃腸道疾病(例如克羅恩氏症，潰瘍性結腸炎)和呼吸道疾病(例如哮喘，慢性阻塞性肺部疾病)。
上述每種疾病都可用藥劑如抗炎藥或免疫抑制劑治癒到不同程度。然而目前的治療方案在減緩疾病的發展中經常是無效的，並可導致系統毒性和不期望的副作用。也可用外科手術代替或輔助藥物治療。但是這種外科手術因形成疤痕而具有較高的局部復發率，並且在某些疾病條件下(例如通過使用氣囊導管時)可導致良性反應性增生。
可阻塞身體通道的其他疾病包括傳染病。簡單地說，有許多急性和慢性傳染病可導致身體通道阻塞，包括例如尿道炎，前列腺炎和其他男性生殖道疾病，各種女性生殖道疾病，膀胱炎和尿道炎(尿道疾病)，慢性支氣管炎，結核病和其他分支桿菌感染以及其他呼吸疾病和某些心血管疾病。
這些疾病目前是利用各種各樣不同的治療方案和/或外科手術進行治療。不過，如上所述，這些治療方案有與系統毒性相關的難題，這可導致不希望的副作用。另外，正如上文中所討論的，外科手術因會形成疤痕而可導致局部復發，並且在某些手術中(例如插入商業上可得到的固定模)可導致良性反應性增生。
現有的對於上述疾病和病情的治療方法在極大程度上有著相同的局限。使用治療劑並沒有使患者的病情得到逆轉，且每當利用手術治療這些病情時，患者總是因身體對手術的反應而存在危險。本發明提供了適於治療上文中大致討論過的病情和疾病的組合物及方法。這些組合物和方法致力於解決現行治療中存在的有關問題，當與現行療法比較時可提供顯著的優點，另外還提供了其他相關長處。
發明概述簡單地講，本發明提供了用於治療或預防與身體通道相關的疾病的方法，它包含將治療劑釋放到該身體通道的外部的步驟。在相關的方面，提供了用於治療或預防與身體通道相關的疾病的方法，它包含將治療劑經外膜釋放到所述身體通道的平滑肌細胞的步驟。通過將治療化合物局部釋放到疾病部位可避免系統性和不希望的副作用，並可能減少總劑量。治療劑扇形或環狀釋放到患病通道周圍也可避免許多腔內操作的缺點，包括組織的上皮襯層的損害。例如內皮損害可導致血栓形成，改變為層狀流動模式，和/或對腔內裝置的異物反應，任何一點都可引發再狹窄鎖鏈。對於前列腺疾病，避免尿道的器械操作可減少狹窄的可能性並保持節制力和效力。
在本發明範圍內可以使用各種治療劑，包括例如抗血管生成劑，抗增生劑，抗炎劑和抗生素。在本發明的優選實施方案中，治療劑是抗微管劑如本文中描述的「輕質d族」試劑(例如釩酸鹽或氧釩化合物)，或微管穩定劑如D2O discodermolide,epithilones和紫杉酚，或其類似物或衍生物。
在本發明的某些實施方案中，治療劑還可包含聚合物，諸如象聚(乙烯乙酸乙烯酯)(40％交聯)，乳酸和乙醇酸的共聚物，聚(己內酯)，聚(乳酸)，聚(乳酸)和聚(己內酯)的共聚物，明膠，透明質酸，膠原基質和白蛋白。也可利用其他載體(例如脂質體)來包含和/或傳送一種或多種治療劑。
治療劑可用來治療或預防各種疾病，包括例如血管疾病，腫瘤性阻塞，炎性疾病和傳染病。可用其治療的代表性身體通道包括，例如動脈，食管，胃，十二指腸，小腸，大腸，膽道，輸尿管，膀胱，尿道，前列腺，淚管，氣管，支氣管，細支氣管，鼻氣道，咽鼓管，外耳道，子宮和輸卵管。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，通過經動脈的外壁直接注射到外膜內而將治療劑釋放到動脈。
僅僅是為了舉例說明的目的，本發明的某些實施方案提供了治療血管疾病(例如狹窄)，胃腸疾病，生殖泌尿器疾病(例如良性前列腺肥大或前列腺癌)，和肺部疾病的方法(上述每種疾病的具體實施例在下文中更詳細地進行了論述)，是通過給予受到疾病影響的身體通道抗微管劑如本文中描述的「輕質d族」試劑(例如釩酸鹽或氧釩化合物)，或微管穩定劑如D2O discodermolide,epithilones或紫杉酚，或上述任何一種的類似物或衍生物而實現的。
參照下面的具體描述和附圖將會更加明確本發明的這些方面和其它方面。另外，下面列出了更細緻地描述某些方法、裝置或組合物的參考文獻，在此將其全部引入本發明作為參考。
附圖簡述

圖1顯示了聚合微球的血漿調理作用對於中性粒細胞(20mg/ml微球在0.5ml細胞中(濃度5×106細胞/ml))對PCL微球的化學發光反應的影響。
圖2顯示了預塗漬血漿+/-2％多聚醇(pluroic,或pluronic)F127對於中性粒細胞(5×106細胞/ml)對PCL微球的化學發光反應的影響。
圖3顯示了預塗漬血漿+/-2％多聚醇F127對於中性粒細胞(5×106細胞/ml)對PMMA微球的化學發光反應的影響。
圖4顯示了預塗漬血漿+/-2％多聚醇F127對於中性粒細胞(5×106細胞/ml)對PLA微球的化學發光反應的影響。
圖5顯示了預塗漬血漿+/-2％多聚醇F127對於中性粒細胞(5×106細胞/ml)對EVAPLA微球的化學發光反應的影響。
圖6顯示了預塗漬IgG(2mg/ml)，或2％多聚醇F127後再塗漬IgG(2mg/ml)對於中性粒細胞對PCL微球的化學發光反應的影響。
圖7顯示了預塗漬IgG(2mg/ml)，或2％多聚醇F127後再塗漬IgG(2mg/ml)對於中性粒細胞對PMMA微球的化學發光反應的影響。
圖8顯示了預塗漬IgG(2mg/ml)，或2％多聚醇F127後再塗漬IgG(2mg/ml)對於中性粒細胞對PVA微球的化學發光反應的影響。
圖9顯示了預塗漬IgG(2mg/ml)，或2％多聚醇F127後再塗漬IgG(2mg/ml)對於中性粒細胞對EVA∶PLA微球的化學發光反應的影響。
圖10A顯示了EVA∶PLA聚合物的混合比例對微球聚集的影響。圖10B是一張掃描電子顯微照片，它顯示了「小」微球的尺寸。圖10C(包括一張放大的插圖-標記為「10C-插圖」)是一張掃描電子顯微照片，它顯示了「大」微球的尺寸。圖10D描繪的是在37℃，紫杉酚從0.6％w/v加載了紫杉酚的50∶50 EVA∶PLA聚合物混合微球中體外釋放到磷酸鹽緩衝鹽水(pH7.4)中的時間過程。開口的圓圈是「小」號微球，閉合圓圈是「大」號微球。圖10E是CAM的照片，顯示了微球(「MS」)釋放紫杉酚的結果。圖10F是增加了放大倍數的類似於10E的照片。
圖11A顯示了在37℃下，從含有1％、2％、5％或10％紫杉酚的聚己內酯微球釋放到磷酸鹽緩衝鹽水中的釋放速率分布圖。圖11B是照片，顯示了用對照微球處理過的CAM。圖11C是照片，顯示了用加載了5％紫杉酚的微球處理過的CAM。
圖12A和12B兩張圖分別顯示了紫杉酚從EVA膜的釋放，以及在那些相同的膜中隨時間剩餘的紫杉酚的百分數。圖12C顯示了沒有紫杉酚的EVA/F127膜隨時間的溶脹情況。圖12D顯示了沒有紫杉酚的EVA/司盤80膜隨時間的溶脹情況。圖12E描繪了各種EVA/F127摻合物的張力對壓力的曲線。
圖13A和13B兩張圖顯示了PCL/MePEG共混聚合物的熔點作為製劑中％MePEG的函數(13A)，和PCL糊在60℃固化所需的時間的增長百分數作為製劑中MePEG的量的函數(13B)。圖13C描繪的是不同PCL/MePEG共混聚合物的柔軟度。圖13D顯示了各種MePEG濃度的共混聚合物隨時間的重量變化百分數。圖13E描述了紫杉酚從加載有1％紫杉酚的各種共混聚合物中隨時間的釋放速率。圖13F和13G描繪了不同數量的紫杉酚對從20％MePEG/PCL混合物釋放的紫杉酚的總量的影響。圖13H描繪了MePEG對MePEG/PCL聚合物的抗張強度的影響。
圖14顯示了紫杉酚從各種聚合物製劑中的釋放。
圖15描繪了在37℃下，紫杉酚從PCL糊釋放到PBS中的時間過程。該PCL糊含有利用140號篩製備的紫杉酚和各種添加劑的微球。誤差條代表3份樣品的標準偏差。
圖16描繪了在37℃下，紫杉酚從紫杉酚-明膠-PCL糊釋放到PBS中的時間過程。該圖顯示了明膠濃度(140目)和利用140號篩或60號篩製備的紫杉酚-明膠(1∶1)微球的大小的影響。誤差條代表3份樣品的標準偏差。
圖17A和17B描繪了添加劑(17A；140號篩)和微粒大小(17B；140號篩或60號篩)以及添加劑(140號篩)的比例對含有20％紫杉酚的PCL糊在37℃下懸浮於蒸餾水中後的溶脹性能的影響。測量是針對用在紫杉酚-明膠中的270μm微粒製成的糊和含有30％明膠的糊進行的，4小時後因基質分解而停止測量。誤差條代表3份樣品的標準偏差。
圖18A,18B,18C和18D是紫杉酚-明膠-PCL(20∶20∶60)糊在37℃下懸浮於蒸餾水中之前(18A)和之後6小時(18B)的代表性掃描電子顯微照片。顯微照片18C和18D是放大更多倍的18B，顯示了紫杉酚(棒狀)與明膠基質的緊密聯繫。
圖19A和19B是用明膠-PCL(19A)和紫杉酚-明膠-PCL(20∶20∶60,19B)糊處理的CAM的顯微照片，顯示了紫杉酚處理的CAM中的無血管分布區。
圖20是一張表，顯示了紫杉酚-明膠-PCL糊劑腫瘤周圍注射到有確定腫瘤的小鼠體內的作用。
圖21是一張表，顯示了PDLLA-PEG-PDLLA組合物的熔解溫度，熱函，分子量，多分散性和特性粘度。
圖22描繪了PDLLA-PEG-PDLLA和PEG的DSC差示熱分析圖。加熱速率為10℃/分鐘。參見圖21的熔解溫度和熱函。
圖23描繪了在37℃下，紫杉酚從加載了20％紫杉酚的PDLLA-PEG-PDLLA圓柱體(cylinder)向PBS白蛋白緩衝劑中的累積釋放。誤差條代表4份樣品的標準偏差。40％PEG的圓柱體在第4天時因分解而停止。
圖24A,24B和24C描繪了加載20％紫杉酚的PDLLA-PEG-PDLLA圓柱體在37℃下紫杉酚的體外釋放過程中的尺寸，長度(A)，直徑(B)和溼重(C)的變化。
圖25顯示了加載20％紫杉酚的PDLLA-PEG-PDLLA圓柱體(20％PEG,1mm直徑)在37℃下在PBS白蛋白緩衝劑中釋放過程中的凝膠滲透色譜。
圖26是一張表，顯示了PDLLA-PEG-PDLLA圓柱體(加載20％紫杉酚)在37℃下向PBS白蛋白緩衝劑中釋放過程中的質量損耗和聚合物組分變化。
圖27A,27B,27C和27D是乾燥PDLLA-PEG-PDLLA圓柱體(加載20％紫杉酚，直徑1mm)在紫杉酚釋放前和釋放過程中的SEM。A:20％PEG,0天；B:30％PEG,0天；C:20％PEG,69天；D:30％PEG,69天。
圖28描繪了在37℃下，紫杉酚從加載了20％紫杉酚的PDLLA∶PCL摻合物和PCL向PBS白蛋白緩衝劑中的累積釋放。誤差條代表4份樣品的標準偏差。
圖29是一張表，顯示了加載了紫杉酚的外科用糊劑局部用於小鼠的皮下腫瘤後的效能。
圖30顯示了輻射對紫杉酚釋放的影響。
圖31描繪了對照微球(PLLA∶GA-85∶15)的顆粒大小的範圍。
圖32描繪了加載20％紫杉酚的微球(PLLA∶GA-85∶15)的顆粒大小的範圍。
圖33描繪了對照微球(PLLA∶GA-85∶15)的顆粒大小的範圍。
圖34描繪了加載20％紫杉酚的微球(PLLA∶GA-85∶15)的顆粒大小的範圍。
圖35A,35B和35C描繪了不同比例的PLLA和GA的顆粒大小的範圍。
圖36A和36B描繪了不同比例的PLLA和GA的顆粒大小的範圍。
圖37A,37B和37C描繪了不同比例的PLLA和GA的顆粒大小的範圍。
圖38A和38B描繪了不同比例的PLLA和GA的顆粒大小的範圍。
圖39是一張表，顯示了選定的二嵌段共聚物的分子量，CMC和紫杉酚最大加載量。
圖40A和40B描繪了共聚物和克列莫佛乳化劑(Cremophor)EL對紫杉酚結晶在水中(37％)的增溶溶解作用。40A共聚物濃度對克列莫佛乳化劑的影響(溫育20小時)；40B時間的影響(共聚物或克列莫佛乳化劑濃度0.5％)。
圖41A和41B描繪了紫杉酚微粒溶液在室溫(22℃)下的混濁度(在450nm處的紫外可見光吸收)。紫杉酚在水中的濃度為2mg/ml。除了MePEG 5000-30/70加載5％紫杉酚外，其餘加載10％紫杉酚。
圖42描繪了紫杉酚從紫杉酚-尼龍微膠囊中的釋放。
圖43A顯示了紫杉酚/PCL對腫瘤生長的影響。圖43B和43C是兩張照片，顯示了對照、加載10％紫杉酚和加載20％紫杉酚的熱糊劑(thermopaste)對腫瘤生長的影響。
圖44是條形圖，描繪了微球數量大小分布(含有10mg蘇拉明鈉的5％聚(乙烯乙酸乙烯酯)向5％PVA中)。
圖45是條形圖，描繪了微球重量大小分布(含有10mg蘇拉明鈉的5％聚(乙烯乙酸乙烯酯)向5％PVA中)。
圖46描繪了蘇拉明鈉封裝於50mg聚(乙烯乙酸乙烯酯)中的膠囊的重量。
圖47描繪了蘇拉明鈉封裝於50mg聚(乙烯乙酸乙烯酯)中的膠囊的百分數。
圖48是條形圖，描繪了用含有10％NaCl的5％PVA製成的含有10mg蘇拉明鈉的5％ELVAX微球的重量大小分布。
圖49是條形圖，描繪了用含有10％NaCl的5％PVA製成的含有10mg蘇拉明鈉的5％微球的重量大小分布。
圖50是條形圖，描繪了用含有10％NaCl的5％PVA製成的含有10mg蘇拉明鈉的5％微球的數量大小分布。
圖51A是CAM中蘇拉明和醋酸可的松的照片(放大倍數=8 ×)。簡言之，該圖像顯示了用在0.5％甲基纖維素中的20μg蘇拉明和70μg醋酸可的松處理的無血管區域。注意位於無血管區周圍的血管是改變方向而遠離藥物源的。圖51B是照片，它以更高的放大倍數(20×)顯示了受影響區域的血管的詳細情形。注意無血管區和無血管區周圍的血管的典型「肘推」(elbowing)作用。
圖52A,B,C,D和E顯示了MTX隨時間從PCL釋放的作用。
圖53是用PLA∶GA(50∶50)製成的加載了10％甲氨蝶呤的微球的照片；特性粘度「Ⅳ」=0.78。
圖54描繪了加載的10％硫酸氧釩從PCL的釋放。
圖55是含有硫酸釩的透明質酸微球的照片。
圖56A描繪了有機釩酸鹽從PCL的釋放。圖56B描繪了隨時間過程而剩餘的有機釩酸鹽的百分數。
圖57是一張照片，顯示了含有有機釩酸鹽的聚D,L，乳酸微球。
圖58A和58B顯示了BMOV從PCL(150mg的藥柱)釋放的時間過程。(A)釋放的μg藥物或(B)藥柱中剩餘的藥物％。BMOV在PCL中的最初加載量是(O),5％；(·),10％；(Δ),15％；(▲)，20％；,30％和(),35％。
圖59A和59B顯示了BMOV從150mgPCL∶MEPEG(80∶20,w∶w)的藥柱中釋放的時間過程，表示為(A)釋放的μg藥物或(B)藥柱中剩餘的藥物％。BMOV在PCL:MEPEG中的最初加載量是(O),5％；(·),10％；(Δ),15％；(▲),20％。
圖60A,60B和60C是在藥物釋放實驗開始時含有20％BMOV的PCL藥柱的(60A上部)，BMOV結晶；(60B中部)表面形態學的掃描電子顯微照片，和在藥物釋放實驗結束時(72天在PBS中)含有20％BMOV的PCL藥柱的(60C底部)表面形態學的掃描電子顯微照片。
圖61A和61B兩張圖顯示了升高BMOV的濃度對細胞存活的影響，是利用細胞與BMOV接觸1小時(61A)，或繼續接觸BMOC(61B)進行觀測的。所用細胞為(O),HT-29結腸細胞；(·),MCF-7乳腺細胞；(Δ),Skmes-1非肺小細胞和(▲)，正常骨髓細胞。
圖62是一張表，顯示了加載了BMOV的糊劑對小鼠的MDAY-D2腫瘤生長的重量的影響。簡言之，含有25％、30％或35％BMOV的PCL糊劑(150mg)皮下注射到有MDAY-2腫瘤的小鼠體內。處理過10天後測定腫瘤的重量。該表顯示了利用25％BMOV(上表)和30％或35％BMOV(下表)進行的2個獨立實驗的結果。對照數據描述的是用不含BMOV的PCL處理的小鼠。
圖63的表闡明了加載了BMOV的PCL:MePEG糊對小鼠的RIF-1腫瘤生長的重量的影響。簡言之，讓RIF-1腫瘤在小鼠體內生長5天，此時手術切除90％腫瘤並用不含BMOV(對照)或含有5％BMOV的150mg PCL∶MePEG(80∶20,w∶w)糊處理切除部位。進行完該操作後第4、5和6天時測定腫瘤的再生長。
圖64A和64B是兩張圖。圖64A顯示了增加BEMOV在PCL熱糊(150mg小丸)中的加載量對BEMOV釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。圖64B也顯示了增加BEMOV在PCL熱糊(150mg小丸)中的加載量對BEMOV釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。藥物的釋放表示為BEMOV在小丸中的剩餘百分數。
圖65A和65B是兩張圖。圖65A顯示了增加V5在PCL熱糊(150mg小丸)中的加載量對V5釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。圖65B也顯示了增加V5在PCL熱糊(150mg小丸)中的加載量對V5釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。藥物的釋放表示為V5在小丸中的剩餘百分數。
圖66A和66B是兩張圖。圖66A顯示了增加PRC-V在PCL熱糊(150mg小丸)中的加載量對PRC-V釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。圖66B也顯示了增加PRC-V在PCL熱糊(150mg小丸)中的加載量對PRC-V釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。藥物的釋放表示為PRC-V在小丸中的剩餘百分數。
圖67A,67B,67C和67D這一連串圖顯示了在含有5％BMOV(67A),10％BMOV(67B),15％BMOV(67C)和20％BMOV(67D)的PCL熱糊(150mg小丸)中加載不同濃度的MePEG對BMOV釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。
圖68A,68B,68C和68D這一連串圖顯示了在含有0％MePEG(68A),5％MePEG(68B),10％MePEG(68C)和15％MePEG(68D)的PCL熱糊(150mg小丸)中加載不同濃度的MePEG對BMOV釋放到15mL PBS/ALB中的時間過程的影響。藥物的釋放表示為BMOV在小丸中的剩餘百分數。
圖69A和69B是膀胱組織上塗敷有纖連蛋白的PLLA微球的照片(69A)，和膀胱組織上聚(L-賴氨酸)微球的照片。
圖70A和70B是兩張帶有用對照(未加載的)微球處理過的腫瘤的CAM的照片。簡言之，圖70A中的中心白色團是腫瘤組織。注意有大量血管由各個方向從CAM進入腫瘤。腫瘤通過產生「血管生成因子」而誘導宿主脈管系統的向內生長。該腫瘤組織沿著包容它的血管向末端擴展。圖70B是70A中顯示的CAM的內面圖。簡言之，該圖表明了進入腫瘤的血管象輪子的輻條一樣放射狀出現。注意腫瘤附近的血管密度大於正常CAM組織周圍的血管密度。圖70C和70D是兩張具有用加載了20％紫杉酚的熱糊處理過的腫瘤的CAM的照片。簡言之，圖70C中的中心白色團塊是腫瘤組織。注意在腫瘤組織附近只有極少量血管。血管生成抑制劑的持續釋放能對抗腫瘤產生的血管生成刺激物。腫瘤自身形成血管很少且大小日益減小。圖70D是70C中所示的CAM的內面圖，它表明了當與對照腫瘤組織比較時，流到腫瘤中的血液中斷了。注意腫瘤附近的血管密度降低了，並且比正常CAM組織周圍的血管少。
發明詳述在陳述本發明之前，列出下文中將要使用的某些術語的定義對於理解本發明是有幫助的。
本文中所用的「身體通道」是指身體內具有內腔並允許物質流動的許多通道、導管、輸送管、道、溝管、竇道或管道。身體通道的代表性實例包括動脈和靜脈，淚管，氣管，支氣管，細支氣管，鼻通道(包括竇)和其他氣道，咽鼓管，外耳道，口腔，食管，胃，十二指腸，小腸，大腸，膽道，輸尿管，膀胱，尿道，輸卵管，子宮，陰道和其他女性生殖道的通道，輸精管和其他男性生殖道的通道，腦和脊髓的室系統(腦脊髓液)。
本文中所用的「治療劑」是指能減輕、治療、治癒或預防所給疾病或病情的那些試劑。下文中更詳細地論述了治療劑的代表性實例，它們包括，例如抗血管生成劑，抗增生劑，抗炎劑和抗生素。
如上所述，本發明提供了治療或預防與身體通道相關的疾病的方法，它包含將含有治療劑的組合物釋放到身體通道的外部(即非腔表面)的步驟，在優選的實施方案中，組合物包含治療劑和聚合載體。簡單地說，將治療劑釋放到身體通道的外部(例如扇形或環狀釋放)避免了涉及腔內操作的傳統方法的許多缺點。另外，如本文中所述的治療劑的釋放允許更大量的治療劑給藥，而對於傳送的體積的約束較小。
下面的詳細描述進行了討論，許多治療劑可被傳送到身體通道的外部，可以有或沒有載體(如聚合物)，從而治療或預防與身體通道相關的疾病。下面對這些方面進行更詳細的闡述。
治療劑如上所述，本發明提供了應用各種各樣治療劑的方法和組合物。在本發明的一個方面，治療劑是抗血管生成因子。簡言之，在本發明的上下文中，抗血管生成因子應理解為包括任何蛋白質，肽，化學藥品或其他用來抑制血管生長的分子。可容易地使用許多方法來測定所給因子的抗血管生成活性，包括例如雞尿囊絨膜(「CAM」)試驗。簡言之，將剛受精的雞蛋的一部分殼除去，將要進行測試的含有抗血管生成因子樣品的甲基纖維素皿置於膜上。幾天後(例如48小時後)，通過測定甲基纖維素皿周圍區域中的看得見的雞尿囊絨膜可容易地測定樣品對血管生長的抑制。也可定量測定血管生長的抑制，例如，通過測定甲基纖維素皿周圍的血管的數目和大小，與對照甲基纖維素皿進行對比。儘管如果與對照相比本文中所述的抗血管生成因子僅僅以統計學上顯著的方式起作用時被認為是抑制新血管的形成，但在本發明的優選方面，這樣的抗血管生成因子不僅完全抑制新血管的形成，而且減少了以前存在的血管的大小和數量。
除了上述CAM試驗以外，還有許多其他試驗也可用來測定體內抗血管生成因子的效能，包括例如，為此目的而研製的小鼠模型(參見Roberston等人，癌症研究51:1339-1344,1991)。
在本發明的上下文中可以容易地使用各種各樣的抗血管生成因子。代表性實例包括抗侵襲因子，視黃酸及其衍生物，蘇拉明，金屬蛋白酶-1的組織抑制劑，金屬蛋白酶-2的組織抑制劑，纖溶酶原激活物抑制劑-1，纖溶酶原激活物抑制劑-2，破壞微管功能的化合物，以及各種形式的輕質「d族」過渡金屬。下文中將更詳細地討論這些以及其他抗血管生成因子。
簡單地說，抗侵襲因子或「AIF」是用軟骨的提取物製備的，它含有能抑制新血管生長的成分。這些成分包含一類7種低分子量蛋白質(＜50,000道爾頓)(Kuettner和Pauli，「軟骨因子對新血管形成的抑制」，血管系統的研究進展，Pitman Books(CIBA基金會專題論文集100),163-173頁，1983)，包括許多對大量蛋白酶有抑制作用的蛋白質(Eisentein等人，美國病理學雜誌81:337-346，1975；Langer等人，科學193:70-72,1976；和Horton等人，科學199:1342-1345,1978)。適合在本發明中使用的AIF可容易地利用本領域中的已知技術進行製備(例如Eisentein等人，出處同上；Kuettner和Pauli，出處同上；和Langer等人，出處同上)。AIF的純成分如軟骨衍生抑制劑(「CDI」)(參見Moses等人，科學248:1408-1410,1990)也可容易地製得並用於本發明的上下文中。
視黃酸改變胞外基質成分的代謝，從而抑制血管生成。為了協同增加反式視黃酸的抗血管生成作用可加入脯氨酸類似物，血管抑制類固醇，或肝素。視黃酸，及其也可用於本發明上下文中的衍生物可以容易地從商業來源得到，包括例如Sigma化學公司，(#R2625)。
蘇拉明是一種多磺化萘脲化合物，一般用作殺錐蟲劑。簡言之，蘇拉明阻斷了各種生長因子的特異性細胞表面結合，諸如血小板衍生生長因子(「PDGF」)，表皮生長因子(「EGF」)，轉化生長因子(「TGF-β」)，胰島素樣生長因子(「IGF-1」)，和成纖維細胞生長因子(「βFGF」)。蘇拉明可以按照已知技術製備，或容易地從許多商業來源得到，包括例如Mobay化學公司，紐約，(參見Gagliardi等人，癌症研究52:5073-5075,1992；和Coffey.Jr.等人，細胞生理學雜誌132:143-148,1987)。
金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(「TIMP」)是由內皮細胞分泌的，它也分泌MMP酶。TIMP是糖基化的，分子量為28.5kDa。TIMP-1通過結合到活性金屬蛋白酶上來調節血管生成，由此抑制血管向胞外基質中的侵襲。也可用金屬蛋白酶-2的組織抑制劑(「TIMP-2」)來抑制血管生成。簡言之，TIMP-2是一種21 kDa的非糖基化蛋白，它以活性酶和潛在酶、酶原形式結合金屬蛋白酶。TIMP-1和TIMP-2都可從商業來源得到，諸如Synergen,Boulder,Colorado。
纖溶酶原激活物抑制劑-1(PA)是存在於血小板中的一種50kDa的糖蛋白，也可由內皮細胞和肌細胞合成。PAI-1抑制內皮基底外側部位的t-PA和尿激酶纖溶酶原激活物，並調控纖維細胞溶解過程。纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI-2)一般僅在某些情況諸如在妊娠期，和在腫瘤存在下的血液中發現。簡單地說，PAI-2是單核細胞和巨噬細胞分泌的一種56kDa的蛋白。相信其能調節纖維蛋白溶解活性，特別是抑制尿激酶纖溶酶原激活物和組織纖溶酶原激活物，由此防止纖維蛋白溶解。
本發明的治療劑還包括破壞微管功能的化合物。這樣的化合物的代表性實例包括雌氮芥(可從Sigma,Wang和Stearns得到，癌症研究48:6262-6271,1988),epothilone,curacin-A，秋水仙鹼，甲氨蝶呤，和紫杉酚，長春鹼，長春新鹼，D2O和4-叔丁基-[3-(2-氯乙基)脲基]苯(「tBCEU」)。簡言之，這樣的化合物可以數種不同方式起作用。例如，諸如秋水仙鹼和長春鹼的化合物通過解聚微管而起作用。
在本發明的一個優選的實施方案中，治療劑是紫杉酚，一種通過結合到微管蛋白上形成異常有絲分裂紡錘體而破壞微管形成的化合物。簡單地講，紫杉酚是一種高度衍生的二萜化合物(Wani等人，美國化學會會志93:2325,1971)，它已從短葉紫杉(Pacific Yew.)和Taxomyces Andreanae的收穫物及幹皮和短葉紫杉的植物內真菌中得到(Stierle等人，科學60:214-216,1993)。「紫杉酚」(本文中應將其理解為包括藥物前體，類似物和衍生物，諸如象TAXOL，TAXOTERE，紫杉酚的10-去乙醯類似物和紫杉酚的3'N-去苯甲醯基-3'N-叔丁氧基羰基類似物)可以用本領域技術人員已知的技術容易地製備(參見WO94/07882,WO94/07881,WO94/07880,WO94/07876，WO93/23555,WO93/10076,WO94/00156,WO93/24476,EP590267,WO94/20089；美國專利No.5,294,637,5,283,253,5,279,949,5,274,137,5,202,448,5,200,534,5,229,529,5,254,580,5,412,092,5,395,850,5,380,751,5,350,866,4,857,653,5,272,171,5,411,984,5,248,796,5,422,364,5,300,638,5,294,637,5,362,831,5,440,056,4,814,470,5,278,324,5,352,805,5,411,984,5,059,699,4,942,184；四面體快報35(52):9709-9712,1994；醫藥化學雜誌35:4230-4237,1992；醫藥化學雜誌34:992-998,1991；天然產物雜誌57(10):1404-1410,1994；天然產物雜誌57(11):1580-1583,1994；美國化學會會志110:6558-6560,1988)，或者從許多商業來源得到，包括例如Sigma化學公司，St.Louis,Missouri(T7402-來自短葉紫杉)。
這樣的紫杉酚衍生物或類似物的代表性實例包括7-脫氧-docetaxol,7,8-環丙紫杉烷(7,8-Cyclopropataxanes),N-取代2-氮雜環丁二酮，6,7-環氧紫杉酚，6,7-改性紫杉酚，10-去乙酸紫杉醇，10-去乙醯紫杉醇(來自10-去乙醯漿果赤黴素Ⅲ)，紫杉醇的膦醯氧基和碳酸酯衍生物，2』,7-二(1,2-苯二羧酸鈉)紫杉醇，10-去乙酸基-11,12-二氫紫杉醇-10,12(18)-二烯衍生物，10-去乙酸基紫杉醇，紫杉醇前體(Protaxol)(2』-和/或7-O-酯衍生物)，(2』-和/或7-O-碳酸酯衍生物)，紫杉醇側鏈的不對稱合成，氟代紫杉醇，9-脫氧紫杉烷，(13-乙醯基-9-脫氧漿果赤黴素Ⅲ,9-脫氧紫杉醇，7-脫氧-9-脫氧紫杉醇，10-去乙酸基-7-脫氧-9-脫氧紫杉醇，含有氫或乙醯基和羥基與叔丁氧羰基氨基的衍生物，磺化2』-丙烯醯紫杉醇和磺化2』-O-醯基酸性紫杉醇衍生物，琥珀醯紫杉醇，2』-γ-氨基丁醯紫杉醇甲酸酯，2』-乙醯紫杉醇，7-乙醯紫杉醇，7-甘氨酸氨基甲酸紫杉醇酯，2』-OH-7-PEG(5000)氨基甲酸紫杉醇酯，2』-苯甲醯基和2',7-二苯甲醯基紫杉醇衍生物，藥物前體(2』-乙醯紫杉醇；2',7-二乙醯紫杉醇；2』-琥珀醯紫杉醇；2』-(β-丙氨醯)-紫杉醇)；2』γ-氨基丁醯紫杉醇甲酸酯；2』-琥珀醯紫杉醇的乙二醇衍生物；2』-戊二醯基紫杉醇；2』-(N,N-二甲基甘氨醯)紫杉醇；2』-[2-(N,N-二甲氨基)丙醯]紫杉醇；2』鄰羧基苯甲醯紫杉醇；紫杉醇的2』脂族羧酸衍生物；藥物前體{2』(N,N-二乙氨基丙醯)紫杉醇，2』(N,N-二甲基甘氨醯)紫杉醇，7(N,N-二甲基甘氨醯)紫杉醇，2',7-二(N,N-二甲基甘氨醯)紫杉醇，7(N,N-二乙氨基丙醯)紫杉醇，2』,7-二(N,N-二乙氨基丙醯)紫杉醇，2』-(L-甘氨醯)紫杉醇，7-(L-甘氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-甘氨醯)紫杉醇，2』-(L-丙氨醯)紫杉醇，7-(L-丙氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-丙氨醯)紫杉醇，2』-(L-亮氨醯)紫杉醇，7-(L-亮氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-亮氨醯)紫杉醇，2』-(L-異亮氨醯)紫杉醇，7-(L-異亮氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-異亮氨醯)紫杉醇，2』-(L-纈氨醯)紫杉醇，7-(L-纈氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-纈氨醯)紫杉醇，2』-(L-苯基丙氨醯)紫杉醇，7-(L-苯基丙氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-苯基丙氨醯)紫杉醇，2』-(L-脯氨醯)紫杉醇，7-(L-脯氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-脯氨醯)紫杉醇，2』-(L-賴氨醯)紫杉醇，7-(L-賴氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-賴氨醯)紫杉醇，2』-(L-穀氨醯)紫杉醇，7-(L-穀氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-穀氨醯)紫杉醇，2』-(L-精氨醯)紫杉醇，7-(L-精氨醯)紫杉醇，2』,7-二(L-精氨醯)紫杉醇}，帶有改性苯基異絲氨酸側鏈的紫杉醇類似物，taxotere,(N-去苯甲醯基-N-叔-(丁氧羰基)-10-去乙醯紫杉醇，和紫杉烷(例如漿果赤黴素Ⅲ，頭孢曼寧(cephalomannine),10-去乙醯漿果赤黴素Ⅲ，短葉蘇木醇，雲南紫杉素(yunantaxusin)和紫杉素)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括輕質「d族」過渡金屬，諸如象釩，鉬，鎢，鈦，鈮和鉭。這樣的過渡金屬可形成過渡金屬配合物。上述過渡金屬的合適的配合物包括氧過渡金屬配合物。
釩配合物的代表性實例包括氧釩配合物，諸如釩酸鹽和氧釩配合物，合適的釩酸鹽配合物包括偏釩酸鹽(即VO3-)和原釩酸鹽(即VO43-)配合物，諸如象偏釩酸銨(即NH4VO3)，偏釩酸鈉(即NaVO3)，和原釩酸鈉(即Na3VO4)。合適的氧釩(即VO2+)配合物包括，例如乙醯丙酮酸氧釩和硫酸氧釩包括硫酸氧釩水合物諸如硫酸氧釩一水和三水合物，雙[麥芽酚酸(氧釩)](Ⅳ)(Bis[麥芽酚酸(maltolato)(氧釩)](Ⅳ)]](「BMOV」)，雙[(乙基麥芽酚酸)氧釩](Ⅳ)(「BEOV」)，和雙(半胱氨酸，醯胺N-辛基)氧釩(Ⅳ)(「naglivan」)。
鎢和鉬配合物的代表性實例也包括氧配合物。合適的氧鎢配合物包括鎢酸鹽和氧化鎢配合物。合適的鎢酸鹽(即WO42-)配合物包括鎢酸銨(即(NH4)2WO4)，鎢酸鈣(即CaWO4)，二水合鎢酸鈉(即Na2WO4·2H2O)，和鎢酸(即H2WO4)。合適的氧化鎢包括二氧化鎢(Ⅳ)(即WO2)和三氧化鎢(Ⅵ)(即WO3)。合適的氧鉬配合物包括鉬酸鹽，氧化鉬，和氧鉬配合物。合適的鉬酸鹽(即MoO42-)配合物包括鉬酸銨(即(NH4)2MoO4)及其水合物，鉬酸鈉(即Na2MoO4)及其水合物，和鉬酸鉀(即K2MoO4)及其水合物。合適的氧化鉬包括二氧化鉬(Ⅵ)(即MoO2)，三氧化鉬(Ⅵ)(即MoO3)和鉬酸。合適的氧鉬(即MoO22-)配合物包括，例如乙醯丙酮酸氧鉬。其他合適的鎢和鉬配合物包括從例如甘油、酒石酸和糖衍生的羥基衍生物。
在本發明的上下文中還可使用各種其他抗血管生成因子。代表性的實例包括血小板因子4(Sigma化學公司，#F1385)；魚精蛋白硫酸鹽(鯡精蛋白)(Sigma化學公司，#P4505)；硫酸化殼多糖衍生物(用母蟹殼製備)，(Sigma化學公司，#C3641；Murate等人，癌症研究51:22-26,1991)；硫酸化多糖肽聚糖複合物(SP-PG)(類固醇如雌激素，和枸櫞酸他莫昔芬的存在可增強該化合物的功能)；星形孢菌素(Sigma化學公司，#S4400)；基質代謝的調節劑，包括例如脯氨酸類似物{[(L-氮雜環丁烷-2-羧酸(LACA)(Sigma化學公司，#A0760))；順式羥基脯氨酸，d,L-3,4-去氫脯氨酸(Sigma化學公司，#D0625)，硫代脯氨酸(Sigma化學公司，#T0631)]，α,α-聯吡啶(Sigma化學公司，#D7505),β-氨基丙腈富馬酸鹽(Sigma化學公司，#A3134)]}；MDL 27032(4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-噁唑酮；Merion Merrel Dow研究所)；甲氨蝶呤(Sigma化學公司，#A6770；Hirata等人，關節炎與風溼病32:1065-1073,1989)；米託蒽醌(Polverini和Novak，生物化學與生物物理學研究通訊140901-907)；肝素(Folkman，生化藥學34:905-909,1985；Sigma化學公司，#P8754)；幹擾素(例如，Sigma化學公司，#13265)；2巨球蛋白-血清(Sigma化學公司，##M7151)；ChIMP-3(Pavloff等人，生物化學雜誌267:17321-17326,1992)；抑糜蛋白酶素(Sigma化學公司，#C7268；Tomkinson等人，生物化學雜誌286475-480,1992)；β-環糊精十四烷硫酸鹽(Sigma化學公司，#C4767)；Eponemycin；喜樹鹼；煙麴黴素和衍生物(Sigma化學公司，#F6771；加拿大專利No.2,024,306；Ingber等人，自然348555-557,1990)；金硫丁二鈉(「GST」；Sigma:G4022；Matsubara和Ziff，臨床檢查雜誌79:1440-1446,1987)；(D-青黴胺(「CDPT」；Sigma化學公司，#P4875或P5000(HCl))；β-1-抗膠原酶-血清；α2-抗纖溶酶(Sigma化學公司A0914；Holmes等人，生物化學雜誌262(4):1659-1664,1987)；比生群(國際癌症協會)；氯苯扎利二鈉(N-(2)-羧基苯基-4-氯anthronilic acid二鈉或「CCA」；Takeuchi等人，試劑作用(Agents Actions)36:312-316,1992)；沙利度胺；Angostatic類固醇；AGM-1470；carboxynaminolmidazole；以及金屬蛋白酶抑制劑如BB94，雌激素和雌激素類似物，抗雌激素藥，抗氧化劑，生物類黃酮(Pycnogenol)；醚類脂(s-磷酸酯，ET-18-OCH3)，酪氨酸激酶抑制劑(金雀異黃素，制表菌素，草黴素A，灰薰草菌素-c，羥基桂皮酸酯)，α趨化因子[人幹擾素誘導蛋白10(IP-10)],-C-X-C-趨化因子(Gro-beta)，氧化氮，抗真菌劑(根赤殼菌素)，15-脫氧精胍菌素，金屬配合物(二氯環戊二烯鈦-環戊二烯基二氯化鈦)，三苯基甲烷衍生物(金精三羧酸)，Linomide，沙利度胺，IL-12，肝素酶，制管張素，抗微生物劑(米諾環素)，血漿蛋白(載脂蛋白E),anthracyclines(TAN-1120)，增殖蛋白相關蛋白，FR-111142，人參皂甙(人參皂甙Rb2)，多硫酸五聚糖。
本發明的組合物還可含有多種其他治療劑，包括例如α-腎上腺素能阻滯劑，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和組胺、5-羥色胺、內皮素的受體拮抗劑，鈉/氫反向轉運蛋白的抑制劑(例如阿米洛利及其衍生物)；調節胞內鈣離子轉運的試劑如L型(例如地爾硫，硝苯地平，維拉帕米)或T型鈣離子通道阻滯劑(例如阿米洛利)，鈣調蛋白拮抗劑(例如H7)和鈉/鈣轉運蛋白的抑制劑(例如阿米洛利)，ap-1抑制劑(針對酪氨酸激酶，蛋白激酶C，肌球蛋白輕鏈激酶，Ca2+/鈣調蛋白激酶Ⅱ，酪蛋白激酶Ⅱ)；抗抑鬱劑(例如amytriptyline，氟西汀，LUVOX和PAXIL)；細胞因子和/或生長因子，以及它們各自的受體，(例如白細胞介素，α,β，或γ-IFN,GM-CSF,G-CSF，表皮生長因子，轉化生長因子α和β,TNF，和血管上皮生長因子的拮抗劑，內皮生長因子，酸性或鹼性成纖維細胞生長因子，和血小板衍生生長因子)；IP3受體的抑制劑(例如肝素)；蛋白酶和膠原酶抑制劑(例如上文中討論過的TIMPs)；硝基血管舒張劑(例如硝酸異山梨醇酯)；抗有絲分裂劑(例如秋水仙鹼，anthracyclines和其他抗生素，葉酸拮抗劑和其他抗代謝物劑，長春花生物鹼，亞硝基脲，DNA烷基化劑，拓撲異構酶抑制劑，嘌呤拮抗劑和類似物，嘧啶拮抗劑和類似物，磺酸烷基酯)；免疫抑制劑(例如腎上腺皮質類固醇，環孢菌素)；有義或反義寡核苷酸(例如DNA,RNA，核酸類似物(例如肽核酸)或它們的任意結合物)；以及轉錄因子活性的抑制劑(例如輕質d族過渡金屬)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括各種抗生素，包括抗細菌劑，抗微生物劑，抗病毒劑，抗原蟲劑和抗真菌劑。這些藥劑的代表性實例包括系統性抗菌素如氨基糖苷類(例如鏈黴素，阿米卡星，慶大黴素，奈替米星，妥布黴素)；第一、第二和第三代頭孢菌素類(例如頭孢噻吩，頭孢唑林，頭孢匹林，頭孢拉定，頭孢氨苄，頭孢羥氨苄，頭孢克洛，頭孢孟多，頭孢呋辛，頭孢呋辛酯，頭孢尼西，頭孢雷特，頭孢西丁，頭孢噻肟，頭孢替坦，頭孢唑肟，頭孢哌酮，頭孢他啶，頭孢曲松，拉氧頭孢，其他半合成頭孢菌素如頭孢克肟和頭孢泊肟酯)；青黴素類(例如青黴素G(苄星青黴素和普魯卡因鹽)，鄰氯青黴素，雙氯青黴素，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，青黴素類，氨苄西林，阿莫西林，巴氨西林，環青黴素，羥苄西林，替卡西林，美洛西林，哌拉西林，阿洛西林，氮脒青黴素，和與棒酸結合的青黴素類)；喹諾酮類(例如西諾沙星，環丙氟哌酸，萘啶酸，諾氟沙星，吡哌酸，perloxacin，氟羅沙星，依諾沙星，氧氟沙星，託磺沙星，洛美沙星，喹諾酮的立體異構體)；磺胺類(例如磺胺西汀，磺胺甲二唑，磺胺甲基噁唑，磺胺異噁唑，柳氮磺胺吡啶，和甲氧苄啶加磺胺甲基噁唑結合物)；四環素類(例如強力黴素，地美環素，美他環素，米諾環素，土黴素，四環素)；大環內酯類(例如紅黴素，其他半合成大環內酯如阿齊紅黴素和克紅黴素)；單菌黴素類(新合成類)(例如氨曲南，洛拉卡比)；和混雜藥劑如放線菌素D，阿黴素，絲裂黴素C，新生黴素，光輝黴素，利福平，博來黴素，氯黴素，克林黴素，竹桃黴素，卡那黴素，林可黴素，新黴素，巴龍黴素，大觀黴素，醋竹桃黴素，兩性黴素B，多粘菌素E，制黴素，多粘菌素B，灰黃黴素，氨曲南，環絲氨酸，克林黴素，多粘菌素E甲磺酸鹽，亞胺培南-西司他丁，烏洛託品，甲硝唑，呋喃妥因，利福布坦，大觀黴素，甲氧苄啶，桿菌肽，萬古黴素，其他β-內醯胺抗菌素。
可在本發明中使用的其他治療劑包括局部用抗菌素如桿菌肽，鋅，新黴素，莫匹羅星，克林黴素；抗病原物質的多肽如cecropionins，mangainins；和抗結核劑如磺胺地索辛，磺胺異噁唑，磺胺素嘧啶，鹽酸乙胺丁醇，異煙肼，對氨基水楊酸鈣。
可在本發明中使用的其他治療劑包括抗菌素如碘，聚維酮碘，硼酸，硼酸鈉，oxydale，高錳酸鉀，乙醇，異丙醇，福馬林，甲酚，地馬唑，西卡寧，碘代十一碳炔酸苯基酯，六氯酚，間苯二酚，苄索氯銨，十二烷基硫酸鈉，氯化汞，汞溴紅，磺胺嘧啶銀和其他無機和有機銀和鋅鹽，一價和二價陽離子的鹽，葡萄糖酸洗必太，鹽酸烷基聚氨基乙基甘氨酸，苯扎氯銨，呋喃西林，制黴素，乙醯氨苯磺胺，克黴唑，磺胺甲二唑，磺胺醋醯，二乙醇胺，託萘酯，吡咯尼群，十一碳烯酸，microazole，宛氏菌素，滷普羅近，和地馬唑，(甲氯環素，曲古黴素和噴他黴素)，青黴素類。抗真菌劑包括氟胞嘧啶，氟康唑，灰黃黴素，酮康唑，和咪康唑。抗病毒和AIDS劑包括阿昔洛韋，金剛烷胺，二脫氧肌苷(以前為ddI)，灰黃黴素，氟胞嘧啶，膦甲酸，更昔洛韋，碘苷，咪康唑，克黴唑，乙胺嘧啶，利巴韋林，金剛乙胺，雙脫氧胸苷(以前為d4T)，曲氟尿苷，三磺嘧啶，valacyclovir，阿糖腺苷，扎西他賓(以前為ddC)和齊多夫定(以前為AZT)。AIDS的輔助治療劑(例如促紅細胞生成素；氟康唑(抗真菌)；幹擾素α-2a和-2b(卡波西肉瘤)；阿託喹酮，噴他脒和三甲曲沙(抗原蟲)；醋酸甲地孕酮(食慾增強劑)；利福布丁(抗分支桿菌的)。抗原蟲劑的代表性實例包括羥乙磺酸噴他脒，喹尼丁，氯喹和甲氟喹。
可在本發明中使用的其他治療劑包括抗增殖劑，抗腫瘤劑或化學治療劑。這種藥劑的代表性實例包括雄激素抑制劑，抗雌激素劑和激素，如氟他胺，亮丙瑞林，他莫昔芬，雌二醇，雌莫司汀，甲地孕酮，己烯雌酚，睪內酯，戈舍瑞林，甲羥孕酮；細胞毒性試劑如六甲蜜胺，博來黴素，白消安，卡鉑，卡莫司汀(BiCNU)，順鉑，克拉立平，達卡巴嗪，放線菌素D，柔紅黴素，阿黴素，雌莫司汀，依託泊甙，洛莫司汀，環磷醯胺，阿糖胞苷，羥基脲，伊達比星，幹擾素α-2a和-2b，異環磷醯胺，米託蒽醌，絲裂黴素，paclitaxel，鏈佐昌，替尼泊甙，噻替沠長春鹼，長春新鹼，長春瑞賓，抗代謝劑和抗有絲分裂劑，如氟尿苷，5-氟尿嘧啶，fiuarabine，幹擾素α-2a和-2b，亞葉酸，巰嘌呤，甲氨蝶呤，米託坦，光輝黴素，硫鳥嘌呤，秋水仙鹼，anthracyclines和其他抗菌素，葉酸拮抗劑和其他抗代謝物劑，長春花生物鹼，亞硝基脲，DNA烷化劑，嘌呤拮抗劑和類似物，嘧啶拮抗劑和類似物，磺酸烷基酯；酶如天冬醯胺酶，培加帕酶；放射性試劑(例如Cu-64,Ga-67，Ga-68,Zr-89,Ru-97,Tc-99m,Rh-105,Pd-109,In-111,I-123,I-125,I-131,Re-186,Re-188,Au-198,Au-199,Pd-203,At-211,Pd-212和Bi-212)，毒素(例如蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，白喉毒素，霍亂毒素，gelonin，商陸抗病毒蛋白，tritin，志賀毒素，和假單胞桿菌外毒素A)，輔助治療劑如格蘭西龍和奧丹亞龍(止噁心藥，止吐藥)，地拉佐生(心肌病)，硝酸鎵(高鈣血)，GCSF和GMSCF(化學治療和BMT),IL-1α,IL-2,IL-3,IL-4，左旋米唑，毛果芸香鹼(產生於放射治療時的唾液中)，鍶89(骨瘤)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括心血管試劑；抗高血壓劑；腎上腺素能阻滯劑和刺激素(例如多沙唑嗪，胍那決爾，胍乙啶，酚苄明，哌唑嗪加泊利噻嗪，特拉唑嗪，甲基多巴，可樂定，胍那苄，胍法辛)；α-/β-腎上腺素能阻滯劑(例如拉貝洛爾)；血管緊張肽轉化酶(ACE)抑制劑(例如貝那普利，catopril，依那普利，依那普利拉，福辛普利，賴諾普利，莫西普利，喹那普利，雷米普利，和與鈣通道阻滯劑及利尿劑的結合物；ACE-受體拮抗劑(例如losartan)；β阻滯劑(例如醋丁洛爾，阿替洛爾，倍他洛爾，比索洛爾，卡替洛爾，艾司洛爾，fimolol，吲哚洛爾，普萘洛爾，噴巴洛爾，美託洛爾，納多洛爾，索他洛爾)；鈣通道阻滯劑(例如阿米洛利，氨氯地平，苄普地爾，地爾硫，伊拉地平，硝苯地平，維拉帕米，非洛地平，尼卡地平，尼莫地平)；抗心律失常藥，Ⅰ-Ⅳ族(例如溴苄銨，丙吡胺，恩卡尼，氟卡尼，利多卡因，美西律，莫立昔嗪，普羅帕酮，普魯卡因醯胺，喹尼丁，妥卡尼，艾司洛爾，普萘洛爾，醋丁洛爾，胺碘酮，索他洛爾，維拉帕米，地爾硫，吲哚洛爾，鹽酸布拉洛爾，三氯噻嗪，呋塞米，鹽酸哌唑嗪，美託洛爾酒石酸鹽，鹽酸卡替洛爾，鹽酸氧烯洛爾，和鹽酸普萘洛爾)；和混雜抗心律失常藥及強心劑(例如腺苷，地高辛，甲地高辛，咖啡因，鹽酸多巴胺，鹽酸多巴酚丁胺，鹽酸酚乙醇胺，二羥丙茶鹼，泛癸利酮，洋地黃)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括利尿劑(例如乙醯唑胺，阿米洛利，氨苯蝶啶加氫氯噻嗪結合物，螺內酯加氫氯噻嗪結合物，託塞米，呋塞米，利尿酸，布美他尼，氨苯蝶啶，甲氯噻嗪，氫氯噻嗪，metdazone，氯噻酮，氫氟噻嗪，美扎拉宗，甲氯噻嗪，泊利噻嗪，quinithazone，三氯噻嗪，benrofiumethizaide，苯噻嗪)；低血壓利尿藥(例如美夫西特，戊氟噻嗪，bumetamide，雙氫噻嗪，bentroflumethiazide，利血平)；肌收縮劑(例如地高辛，洋地黃毒甙，多巴酚丁胺，氨力農，米力農)；血管舒張藥(例如罌粟鹼，單硝酸異山梨酯和硝酸異山梨酯，硝酸甘油，dizoxide，肼屈嗪，米諾地爾，nitroprusside，哌唑嗪，特拉唑嗪，1,2,3-丙三醇一硝酸，1,2,3-丙三醇硝酸和它們的酯衍生物，戊四硝酯，癸煙酯，嗎多明，尼可莫爾，雙貝特，鹽酸地爾硫，桂利嗪，雙嘧達莫，曲匹地爾，鹽酸曲美他嗪，卡波羅孟，乳酸普尼拉明，二鹽酸地拉)；血管加壓藥(例如間羥胺，異丙腎上腺素，苯福林，methaxamine)；抗凝劑和溶栓劑(例如組織纖溶酶原激活物(TPA)，尿激酶，鏈激酶，尿激酶原，肝素，華法林)；鈣調蛋白拮抗劑(例如H7)；鈉/鈣反向轉運物的抑制劑(例如阿米洛利)；和ryanodine受體的抑制劑(例如Ryanodine)；IP3受體拮抗劑(例如肝素)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括抗炎劑。這種藥劑的代表性實例包括非甾類試劑(「NSAIDS」)如水楊酸鹽類(例如雙水楊酯，美沙拉胺，二氟尼柳，膽鹼三水楊酸鎂)，雙氯芬酸，二氟尼柳，依託度酸，非諾洛芬，氯比洛芬，布洛芬，吲哚美辛，甲芬那酸，萘丁美酮，萘普生，吡羅昔康，保泰松，酮洛芬，S-酮洛芬，酮咯酸，氨丁三醇，舒林酸，託美丁)。其他抗炎藥包括甾類試劑如倍氯米松，倍他米松，可的松，地塞米松，膚輕鬆，氟尼縮松，丙酸氟替卡松，氟化類皮質激素，二醋酸曲安西龍，氫化可的松，氫化潑尼松，甲基氫化潑尼松和潑尼松。免疫抑制劑(例如adenocarticosteroids，環孢菌素)；和抗組胺藥和減充血劑(例如阿司咪唑(組胺H1-受體拮抗劑)，azatidine，溴苯那敏，氯馬斯汀，氯苯那敏，色甘酸，塞庚啶，雙苯咪唑，苯海拉明，氫氯化物，羥嗪，甘草次酸，高氯環嗪，氫氯化物，酮替芬，氯雷他定，萘甲唑林，苯茚胺，非尼拉敏，異丙嗪，特非那丁，阿利馬嗪，曲吡那敏，曲尼司特，和減充血劑苯丙醇胺和偽麻黃鹼。
可在本發明中使用的其他治療劑包括中樞神經系統藥劑。這種藥劑的代表性實例包括抗抑鬱藥(例如氟西汀，帕羅西丁，Luvox,Mannerex和Effexor)；CNS刺激劑(例如匹莫林，去氧麻黃鹼，右旋苯丙胺)；催眠劑(例如戊巴比妥，艾司唑侖，乙氯維諾，氟西泮，普魯泊福，司可巴比妥，替馬西泮，三唑侖，誇西泮，酒石酸唑吡坦)；抗躁狂藥(例如鋰)；鎮靜藥和抗驚厥藥巴比妥類(例如戊巴比妥，苯巴比妥，司可巴比妥，甲巴比妥，仲丁巴比妥撲米酮，異戊巴比妥)；非巴比妥類鎮靜藥(例如苯海拉明，多西拉敏，咪達唑侖，地西泮，異丙嗪，蘿拉西泮，替馬西泮)；和其他混雜催眠藥和鎮靜藥(例如甲喹唑酮，格魯米特，氟西泮，溴異戊醯脲，氟西泮，氫氯化物，滷噁唑侖，三唑侖，苯巴比妥，水合氯醛，硝甲西泮，艾司侖唑)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括阿爾茨海默試劑如他克林(可逆膽鹼酯酶抑制劑)；帕金森氏症用藥劑如金剛烷胺，甲磺酸溴麥角環肽，比哌立登，甲磺酸苯扎託品，卡比多巴-左旋多巴，苯海拉明，莨菪鹼，左旋多巴，培高利特甲磺酸酯，丙環定，司來吉蘭HCl，苯海索HCl；和其他混雜CNS藥劑如氟奮乃靜，氟他唑侖，苯巴比妥，甲基苯巴比妥，硫利達嗪，地西泮，苯溴馬隆，鹽酸氯卡帕明，氯噻西泮，氯丙嗪，氟哌啶醇，碳酸鋰。
可在本發明中使用的其他治療劑包括抗偏頭痛劑(例如麥角胺，methylsergide，普萘洛爾，雙氫麥角胺，舍曲林和Immitrex)；腦後栓塞藥劑(例如鹽酸尼卡地平，馬來桂哌齊特，己酮可可鹼，酒石酸艾芬地爾)；局麻藥(例如利多卡因，苯佐卡因，氨基苯甲酸乙酯，鹽酸普魯卡因，辛古柯鹼，普魯卡因)；抗潰瘍/抗反流劑(例如洛塞克(奧美拉唑)，醋谷胺鋁，鹽酸西曲酸酯，鹽酸哌侖西平，西咪替丁，法莫替丁，甲氧氯普胺，雷尼替丁，左旋谷醯胺，吉法酯，和這些化合物的任何立體異構體，以及這些化合物的藥學上可接受的鹽，這樣的化合物可單獨使用或一種以上化合物結合使用，根據情況合適選擇)；蛋白酶抑制劑(例如絲氨酸蛋白酶，金屬內切蛋白酶和天冬氨醯蛋白酶(諸如HIV蛋白酶，腎素和組織蛋白酶)和巰基蛋白酶抑制劑(例如苄氧基羰基-亮氨酸-正亮氨酸(calpeptin)和乙醯-亮氨酸-亮氨酸-正亮氨酸)；磷酸二酯酶抑制劑(例如異丁基甲基黃嘌呤)；酚噻嗪類；生長因子受體拮抗劑(例如血小板衍生生長因子(PDGF)，表皮生長因子，白細胞介素，轉化生長因子α和β，以及酸性或鹼性成纖維細胞生長因子)；反義寡核苷酸(例如與對DPGF或其他生長因子編碼的mRNA部分互補的序列)；和蛋白激酶抑制劑(例如抑制酪氨酸激酶，蛋白激酶C，肌球蛋白輕鏈激酶，Ca2+/鈣調蛋白激酶Ⅱ，酪蛋白激酶Ⅱ)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括抗組織損傷劑。這種試劑的代表性實例包括超氧化物歧化酶；免疫調製劑(例如淋巴因子，單核因子，幹擾素α,β,τ-1b,α-n3,α-2b,α-2b；生長調節劑(例如IL-2,腫瘤壞死因子，表皮生長因子，人蛋氨生長素，纖維結合素，GM-CSF,CSF，血小板衍生生長因子，生長激素，rG-CSF，表皮生長因子，IGF-1)。
可在本發明中使用的其他治療劑包括單克隆和多克隆抗體(例如針對毒液、毒素、腫瘤壞死因子、細菌的那些)；激素(例如雌激素，孕酮，睪酮，人生長激素，腎上腺素，去甲腎上腺素，甲狀腺素，甲狀腺球蛋白，催產素，加壓素，ACTH，生長激素，促甲狀腺素，胰島素，甲狀旁腺素，降鈣素)；維生素類(例如維生素A,B及其次維生素，C,D,E,F,G,J,K,N,P,PP,T,U及它們的亞種)；胺基酸如精氨酸，組氨酸，脯氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，穀氨酸，穀氨醯胺，蘇氨酸，色氨酸，甘氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，纈氨酸；前列腺素(例如E1,E2,F2a,I2)；酶如胃蛋白酶，胰酶製劑，凝乳酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胰脂肪酶，木瓜凝乳蛋白酶，菠蘿蛋白酶，糜蛋白酶，鏈激酶，尿激酶，組織纖溶酶原激活物，纖維蛋白溶酶，脫氧核糖核酸酶，蛋白水解酶，膠原酶，天冬醯胺酶，肝素酶；緩衝劑和鹽(例如NaCl，陽離子包括Na+,K+,Ca++,Mg++,Zn++,NH4+，三乙醇胺，陰離子包括磷酸根，硫酸根，Cl-，枸櫞酸根，抗壞血酸根，乙酸根，硼酸根，碳酸根離子)；防腐劑(例如苯扎氯銨，亞硫酸氫鈉或鉀，硫代硫酸鈉或鉀，尼泊金酯類)；抗痛風劑(例如別嘌醇，cochicine，丙磺舒，磺吡酮)；抗抑鬱劑如阿米替林，阿莫沙平，地昔帕明，多塞平，米帕明，去甲替林，普羅替林，曲米帕明；避孕藥(例如炔諾酮結合物，例如與炔雌醇或與美雌醇結合)；和止噁心藥/止吐藥(例如茶苯海明，羥嗪，美克洛嗪，甲氧氯普胺，丙氯拉嗪，異丙嗪，東莨菪鹼，硫乙拉嗪，triethobenzamide)。
其他可在本發明中使用的治療劑包括鎮喘藥，精神抑制藥，支氣管擴張藥，金化合物，降血糖藥，降血脂藥，麻醉劑，疫苗，影響骨代謝的藥劑，抗腹瀉藥，致育藥，肌肉鬆弛藥，食慾抑制劑，激素如甲狀腺激素，雌激素，孕酮，可的松和/或生長激素，其他生物活性分子如胰島素，以及TH1(例如白介素-2,-12和-15，γ幹擾素)或TH2(例如白介素-4和-10)細胞因子。
儘管為了闡述本發明而列出了上述治療劑，但應理解本發明並不局限於此。例如，儘管具體提到了上述藥劑，但本發明應理解為還包括這些藥劑的類似物，衍生物和軛合物。比如，紫杉酚應理解為不僅指通常化學上可得到的紫杉酚形式，而且還包括類似物(例如上文中所述的taxotere)和紫杉酚軛合物(例如紫杉酚-PEG，紫杉酚-聚糖，或紫杉酚-木糖)。另外，對於本領域技術人員來說很顯然，儘管上文中提到的藥劑被歸於某一類中，但事實上所列出的許多藥劑具有多種生物學活性。而且，每次可使用一種以上的治療劑(即結合使用)，或順序釋放。
聚合物如上所述，本發明的治療組合物還可包含聚合物。有各種各樣的聚合物可用來包含和/或釋放一種或多種上文中所述的治療劑，包括例如可生物降解的和不可生物降解的組合物。可生物降解的組合物的代表性實例包括白蛋白，膠原，明膠，澱粉，纖維素(甲基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙甲基纖維素，羧甲基纖維素，乙酸鄰苯二甲酸纖維素，乙酸琥珀酸纖維素，鄰苯二甲酸羥丙甲基纖維素)，酪蛋白，葡聚糖，多糖，纖維蛋白原，聚(D,L-丙交酯)，聚(D,L-丙交酯-共聚-乙交酯(英glycolide))，聚(乙交酯)，聚(羥基丁酸酯)，聚(碳酸烷基酯)和聚(原酸酯)，聚酯，聚(羥基戊酸)，聚二噁酮，聚(對苯二甲酸乙烯酯)，聚(蘋果酸)，聚(酒石酸)，聚酐，聚磷腈，聚(胺基酸)和它們的共聚物(一般參見Illum,L.,Davida,S.S.(eds.)「受控藥物釋放中的聚合物」,Wright,Bristol,1987；Arshady，可控釋放雜誌17:1-22,1991；Pitt，國際藥學雜誌59:173-196,1990；Holland等人，可控釋放雜誌4:155-180,1986)。不可生物降解的聚合物的代表性實例包括EVA共聚物，矽酮橡膠，丙烯酸聚合物(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯，聚氰基丙烯酸烷基酯，聚乙烯，聚丙烯，聚醯胺(尼龍6,6)，聚氨酯，聚(酯氨酯)，聚(醚氨酯)，聚(酯-脲)，聚醚(聚(氧化乙烯)，聚(氧化丙烯)，pluronic非離子型表面活性劑，聚(四甲二醇))，矽酮橡膠和乙烯聚合物[聚乙烯吡咯烷酮，聚(乙烯醇，聚(乙酸鄰苯二甲酸乙烯酯。還可利用或者是陰離子的聚合物(例如海藻酸鹽，角叉菜膠，羧甲基纖維素和聚(丙烯酸)，或者是陽離子的(例如脫乙醯殼多糖，聚-1-賴氨酸，聚氮丙啶，和聚(烯丙胺))(一般參見，Dunn等人，應用聚合物科學雜誌50:353-365,1993；Cascone等人，材料科學雜誌醫用材料5:770-774,1994；Shiraishi等人，生物藥學通報16(11):1164-1168,1993；Thacharodi和Rao，國際藥學雜誌120:115-118,1995；Miyazaki等人，國際藥學雜誌118:257-263，1995)。特別優選的聚合載體包括聚(乙烯-乙酸乙烯酯)(40％交聯)，聚(D,L-乳酸)低聚物和聚合物，聚(L-乳酸)低聚物和聚合物，聚(乙醇酸)，乳酸和乙醇酸的共聚物，聚(己內酯)，聚(戊內酯)，聚酐，聚(己內酯)或聚(乳酸)與聚乙二醇的共聚物及其摻合物。
可以各種形式製成具有所需釋放性能和/或具有特定所需性能的聚合物載體。例如，聚合物載體可以製成隨接觸特定引發因素如pH而釋放治療劑(參見，例如Heller等人，「化學自調節藥物釋放系統」，醫用聚合物Ⅲ,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,1988，175-188頁；Kang等人，應用聚合物科學雜誌48:343-354，1993；Dong等人，可控釋放雜誌19:171-178,1992；Dong和Hoffman，可控釋放雜誌15:141-152,1991；Kim等人，可控釋放雜誌28:143-152,1994；Cornejo-Bravo等人，可控釋放雜誌33:223-229,1995；Wu和Lee，藥學研究10(10):1544-1547,1993；Serres等人，藥學研究13(2):196-201,1996；Peppas,「pH-和溫度敏感釋放系統的基礎」，Gurny等人(編)，脈衝式藥物釋放，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH，Stuttgart,1993,41-55頁；Doelker，「纖維素衍生物」，1993,Peppas和Langer(編)，生物聚合物Ⅰ,Springer-Verlag,Berlin)。pH-敏感聚合物的代表性實例包括聚(丙烯酸)及其衍生物(包括例如，均聚物如聚(氨基羧酸)；聚(丙烯酸)；聚(甲基丙烯酸))，這種均聚物的共聚物，以及聚(丙烯酸)和丙烯醯基單體的共聚物如上文中討論的那些。其他pH敏感聚合物包括多糖如乙酸鄰苯二甲酸纖維素；鄰苯二甲酸羥丙甲基纖維素；乙酸琥珀酸羥丙甲基纖維素；乙酸偏苯三酸纖維素；和脫乙醯殼多糖。其他pH敏感聚合物還包括任何pH敏感聚合物與水溶性聚合物的混合物。
同樣，聚合物載體可製成溫度敏感型(參見，例如Chen等人，「新的用於陰道藥物釋放的移植到生物粘著聚丙烯酸骨架上的溫度敏感型多聚醇的水凝膠」，控釋生物活性物質的研究進展國際專題集22:167-168，控釋協會公司(Controlled Release Society,Ine.),1995；Okano，「用於暫時性可控藥物釋放的刺激應答性水凝膠的分子設計」，控釋生物活性物質的研究進展國際專題集22:111-112，Controlled Release Society,Inc.,1995；Johnston等人，藥學研究9(3):425-433,1992；Tung，國際藥學雜誌107:85-90,1994；Harsh和Gehrke，可控釋放雜誌17:175-186,1991；Bae等人，藥學研究8(4):531-537,1991；Dinarvand和D'Emanuele，可控釋放雜誌36:221-227,1995；Yu和Grainger，「新的熱敏兩親凝膠聚N-異丙基丙烯醯胺-共聚-丙烯酸鈉-共聚-正-N-烷基丙烯醯胺網絡合成及生化特性」，化學與生物科學部，Oregon科學與技術研究生院，Beaverton,OR,820-821頁；Zhou和Smid，「相關星形高聚物的物理水凝膠」，聚合物研究協會，化學部，環境科學與林學院，紐約州立大學，Syracuse,NY,822-823頁；Hoffman等人，「刺激應答性水凝膠的特徵孔徑和水『結構』」，生物工程中心，華盛頓大學，Seattle,WA,828頁；Yu和Grainger，「交聯N-異丙基丙烯醯胺網絡中的熱敏溶脹性能陽離子、陰離子和兩性水凝膠」，化學與生物科學部，Oregon科學與技術研究生院，Beaverton，OR,829-830頁；Kim等人，藥學研究9(30):283-290,1992；Bae等人，藥學研究8(5):624-628,1991；Kono等人，可控釋放雜誌30:69-75,1994；Yoshida等人，可控釋放雜誌32:97-102,1994；Okano等人，可控釋放雜誌36:125-133,1955；Chun和Kim，可控釋放雜誌38:39-47,1996；D』Emanuele和Dinarvand，國際藥學雜誌118:237-242,1995；Katono等人，可控釋放雜誌16:215-228,1991；Hoffman，「含有生物活性組分的熱逆變水凝膠」，Migliaresi等人(編)，醫用聚合物Ⅲ,ElsevierScience Publishers B.V.,Amsterdam,1988,161-167頁；Hoffman，「熱逆變聚合物和水凝膠在治療和診斷中的應用」，關於藥物釋放系統的最新進展的第三次國際研討會，鹽湖城，UT,1987年2月24-27日，297-305頁；Gutowska等人，可控釋放雜誌22:95-104,1992；Palasis和Gehrke，可控釋放雜誌18:1-12,1992；Paavola等人，藥物究12(12):1997-2002,1995)。
熱膠凝聚合物的代表性實例以及它們的凝膠溫度(LCST(℃))包括均聚物如聚(N-甲基-N-正丙基丙烯醯胺)，19.8；聚(N-正丙基丙烯醯胺)，21.5；聚(N-甲基-N-異丙基丙烯醯胺)，22.3；聚(N-正丙基甲基丙烯醯胺)，28.0；聚(N-異丙基丙烯醯胺)，30.9；聚(N,N-二乙基丙烯醯胺)，32.0；聚(N-異丙基甲基丙烯醯胺)，44.0；聚(N-環丙基丙烯醯胺)，45.5；聚(N-乙基甲基丙烯醯胺)，50.0；聚(N-甲基-N-乙基丙烯醯胺)，56.0；聚(N-環丙基甲基丙烯醯胺)，59.0；聚(N-乙基丙烯醯胺)，72.0。另外也可通過製備上述物質的單體間的共聚物，或通過將這樣的均聚物與其他水溶性聚合物如丙烯醯基單體結合而製成熱膠凝聚合物(例如丙烯酸及其衍生物如甲基丙烯酸，丙烯酸酯及其衍生物如甲基丙烯酸丁酯，丙烯醯胺，和N-正丁基丙烯醯胺。
熱膠凝聚合物的其他代表性實例包括纖維素醚衍生物如羥丙基纖維素，41℃；甲基纖維素，55℃；羥丙甲基纖維素，66℃；和乙基羥乙基纖維素，和多聚醇如F-127,10-15℃；L-122,19℃；L-92,26℃；L-81,20℃；和L-61,24℃。
利用本發明的聚合物載體可以製成各種劑型，包括例如棒形設備，小丸，片塊，或膠囊(參見，例如Goodell等人，美國醫院藥學雜誌43:1454-1461,1986；Langer等人，「大分子從聚合物中的控制釋散」，生物醫學中使用的生物醫學聚合物，聚合材料和藥物，Goldberg,E.P.,Nakagim,A.(編)Academic Press,113-137頁，1980；Rhine等人，藥物科學雜誌69:265-270,1980；Brown等人，藥物科學雜誌72:1181-1185,1983；和Bawa等人，可控釋放雜誌1:259-267,1985)。各種治療劑可以封閉連接於聚合物基質中，通過共價鍵結合，或封裝於微囊中。在本發明的某些優選實施方案中，提供了非膠囊製劑形式的治療組合物如微球(大小範圍從納米到微米)，糊劑，各種尺寸的線劑，膜劑和噴霧劑。
本發明的治療組合物優選以合適的方式配製成適合預期用途的。在本發明的某些方面，治療劑應是生物相容的，並在數天到數月內釋放一種或多種治療劑。例如，「快速釋放」或「爆發釋放」治療組合物在7-10天內釋放10％、20％或25％(w/v)以上治療劑(例如紫杉酚)。在某些實施方案中，這些「快速釋放」的組合物應當能夠釋放化學治療濃度的預期藥劑(當可應用時)。在另一些實施方案中，「慢速釋放」的治療組合物在7-10天內釋放小於1％(w/v)的治療劑。另外，本發明的治療組合物應優選在數月內是穩定的並能在無菌條件下製備和儲存。
在本發明的某些方面中，治療組合物可以根據特定用途配製成50nm到500μm範圍內的任何大小。另一方面，這樣的組合物也可容易地作為「噴霧劑」應用，其固化為膜或塗層。這種噴霧劑可用各種大小的微球製備，包括例如從0.1μm到3μm，從10μm到30μm，和從30μm到100μm的微球。
本發明的治療組合物也可製成各種「糊劑」或凝膠形式。例如，在本發明的一個實施方案中，治療組合物在某一溫度下(例如在大於37℃的溫度下，如40℃,45℃,50℃,55℃或60℃)是液體，而在另一溫度下(例如正常室溫，或任何低於37℃的溫度下)是固體或半固體。這樣的「熱糊劑」可容易地用本文中公開的方法製備。
在本發明的另一方面，可將本發明的治療組合物製成膜劑。這種膜劑一般優選厚度小於5、4、3、2或1mm，更優選小於0.75mm或0.5mm厚，最優選厚度小於500μm到100μm。這樣的膜劑優選是可伸縮的，具有良好的抗張強度(例如大於50，優選大於100，更優選大於150或200M/cm2)，良好的粘附性能(即容易粘附到潮溼或溼潤表面)，並具有可控的滲透性。
在本發明的某些實施方案中，該治療組合物還可包含其他成分如表面活性劑(例如pluronics諸如F-127,L-122,L-92,L-81,和L-61)。
在本發明的另一方面，所提供的聚合載體適於包含和釋放疏水性化合物，含有與碳水化合物、蛋白質或多肽結合的疏水性化合物的載體。在某些實施方案中，該聚合物載體含有或包含一個或多個疏水性化合物的片段、包裝或顆粒。例如，在本發明的一個實施方案中，疏水性化合物可以摻入含有疏水性化合物的基質中，然後該基質摻入聚合物載體中。此時可使用各種基質，包括例如碳水化合物和多糖如澱粉，纖維素，葡聚糖，甲基纖維素，和透明質酸，蛋白質或多肽如白蛋白，膠原和明膠。在另一些實施方案中，可將疏水性化合物包含在疏水芯中，而該芯包含在親水性外殼中。例如，如實施例中所述，紫杉酚可摻入具有親水性外殼的疏水芯中(例如聚D,L乳糖-PEG或MePEG填充劑)。
各種疏水性化合物均可從上述聚合物載體中釋放，包括例如能破壞微管功能的某些疏水性化合物如紫杉酚和雌氮芥；疏水性蛋白質如髓鞘鹼性蛋白，CNS髓鞘的蛋白脂質蛋白，疏水性細胞壁蛋白，外膜蛋白，膜蛋白(歐洲分子生物學組織雜誌12(9):3409-3415,1993)，髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(「MOG」)(國際生物化學及分子生物學30(5):945-958,1993,27頁，癌症研究53(17):4096-4101,1913，細菌視蛋白，人表面活性蛋白(「HBS」，生物化學雜誌268(15):11160-11166,1993)，和SP-B或SP-C(生物化學與生物物理學學報1105(1):161-169,1992)。
在下文中用實施例更詳細地描述了將如上所述的那些治療劑摻入聚合物載體中以形成治療組合物的代表性實例。
其他載體同樣可用於包含和/或傳送本文中所述的治療劑的其他載體包括羥丙基β環糊精(Cserhati和Hollo，國際藥學雜誌108:69-75，1994)，脂質體(參見，例如Sharma等人，癌症研究53:5877-5881,1993；Sharma和Straubinger，藥學研究11(60):889-896,1994；WO93/18751；美國專利No.5,242,073)，脂質體/凝膠(WO94/26254)，毫微型膠囊(Bartoli等人，微型膠囊雜誌7(2):191-197,1990)，微胞(Alkan-Onyuksel等人，藥學研究11(2):206-212,1994)，植入體(Jampel等人，眼科學研究與視覺科學34(11):3076-3083,1993；Walter等人，癌症研究54:22017-2212,1994)，毫微型顆粒(Violante和LanzafamePAACR)，毫微型顆粒-改進型(美國專利No.5,145,684)，毫微型顆粒(表面改進型)(美國專利No.5,399,363),taxol乳劑/溶液(美國專利No.5,407,683)，微胞(表面活性劑)(美國專利No.5,403,858)，合成磷脂化合物(美國專利No.4,534,899)，氣攜式分散劑(美國專利No.5,301,644)，液體乳劑，泡沫噴霧劑，凝膠洗液霜劑，油膏，分散氣泡，顆粒或液滴固體-或液體-氣溶膠，微乳狀液(美國專利No.5,330,756)，聚合物外殼(毫微型-和微-膠囊)(美國專利No.5,439,686)，在表面活性劑中的taxoid基組合物(美國專利No.5,438,072)，乳劑(Tarr等人，藥學研究4:62-165,1987)，毫微型球(Hagan等人，控釋生物活性物質的研究進展國際專題集22,1995；Kwon等人，藥學研究12(2):192-195；Kwon等人，藥學研究10(7):970-974；Yokoyama等人，可控釋放雜誌32269-277,1994；Gref等人，科學263:1600-1603,1994；Bazile等人，藥物科學雜誌84:493-498,1994)和植入體(美國專利No.4,882,168)。
如下文中更詳細的論述，本發明的治療劑，可任意地摻入一種本文中所描述的載體中形成治療組合物，它可製備並用於治療或預防各種疾病。
疾病的治療或預防如上所述，本發明提供了治療或預防與身體通道的阻塞有關的各種疾病的方法，包括例如血管疾病，腫瘤性阻塞，炎性疾病，和傳染病。
例如，在本發明的一個方面，本文中所述的各種治療組合物可用來治療引起血管系統阻塞的血管病。這種疾病的代表性實例包括所有血管(任何動脈、靜脈或移植物周圍)的粥樣硬化，這些血管包括但不限於冠狀動脈，主動脈，髂動脈，頸動脈，股總動脈，股表動脈，膕動脈，和在移植吻合術部位；血管痙攣(例如冠狀血管痙攣和雷諾病)；再狹窄(在以前的手術如氣囊血管成形術、分流術、固定模插入術和移植物插入手術部位的血管的狹窄)；炎性及自身免疫疾病(例如顳動脈炎，脈管炎)。
簡單地說，在血管病如動脈粥樣硬化中，白細胞，特別是單核細胞和T淋巴細胞粘附到內皮細胞上，特別是在動脈分支部位。當粘附到內皮上後，白細胞相應化學恆定刺激而通過內皮細胞裡層遷移，並累積在動脈壁的內膜和平滑肌細胞上。這種動脈粥樣硬化產生的內膜損傷稱作「脂肪條」，該脂肪條中的單核細胞分化為巨噬細胞；該巨噬細胞和平滑肌細胞越來越多地吸收脂質和脂蛋白而成為泡沫細胞。
隨著巨噬細胞的累積，覆在上面的內皮逐漸被機械損壞並被巨噬細胞釋放的氧化脂質、氧衍生游離基和蛋白酶化學改變。泡沫細胞侵蝕內皮表面導致血管壁微潰瘍。可能形成血栓的內皮下組織(例如膠原和其他蛋白質)與血流成分接觸導致血小板附著到被損傷的內皮區域。血小板附著以及其他因素引發了生長因子的合成並釋放到該環境中，包括血小板衍生生長因子(PDGF)，血小板活化因子(PAF)，和白細胞介素1和6(IL-1,IL-6)。這些旁分泌因子被認為刺激血管平滑肌細胞(VSMC)遷移和增殖。
在正常(未染病的)血管壁中，血管平滑肌細胞具有收縮表現型和較低的有絲分裂活性指數。然而，在血小板、巨噬細胞和內皮細胞釋放的細胞因子和生長因子的影響下，VSMC的表現型發生變化，從成熟的收縮細胞變為未成熟的分泌細胞。轉化後的VSMC在血管壁的中層增殖，遷移到內膜中，繼續在內膜中增殖並產生大量胞內基質。這使進行中的血管損傷轉化為纖維斑。由分泌型VSMC合成的胞內基質包括膠原，彈性蛋白，糖蛋白和糖胺聚糖，膠原包含動脈粥樣硬化斑的主要胞內基質成分。彈性蛋白和糖胺聚糖結合脂蛋白並也促使損傷生長。纖維斑由含有平滑肌細胞和覆在上面的巨噬細胞、T細胞和胞內基質的不同厚度的緊密連接的組織的纖維頂部組成。
除了PDGF,IL-1和IL-6以外，滲透到血管壁中的由細胞產生的其他促分裂因子包括轉化生長因子β(TGF-β)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板反應蛋白，5-羥色胺，血栓烷A2，去甲腎上腺素，和血管緊張肽Ⅱ。這使得補充更多的細胞，更多的胞內基質合成和更多的脂質累積。這逐漸加大了動脈粥樣硬化的損傷直到其顯著侵佔了血管腔。開始，當需要加快流動時，流過血管的血液阻塞僅使得遠離動脈粥樣硬化斑的組織局部缺血，而後來當損傷進一步阻塞了動脈後，在其餘部位也發生局部缺血。
在增大的動脈粥樣硬化斑中的巨噬細胞釋放氧化脂質，游離基，彈性蛋白酶和膠原酶，這導致細胞損傷和鄰近組織的壞死。損傷產生了壞死核心並轉化為複合斑。複合斑是不穩定的損傷，它能脫落導致栓塞形成；局部出血(繼發於支持斑的滋養血管的破裂，因損傷迅速擴大而導致腔阻塞)；或潰瘍和裂紋形成(這使血栓生成壞死核心與血流接觸產生局部血栓形成或末梢栓塞形成)。即使上述後遺症無一發生，粘著性血栓也可有機化並加入斑中，由此加速其生長。另外，隨著纖維蛋白原和凝血酶的局部濃度升高，血管平滑肌細胞在中層內增殖並刺激內膜；該過程最終也導致另外的血管狹窄。
正常動脈的中層和內膜從動脈腔中或從外膜中的滋養血管中得到氧氣和提供的營養。隨著動脈粥樣硬化斑的形成，由外膜滋養血管產生的微脈管延伸到增厚的內膜和中層中。當斑更糟且斑的退化減少時這種血管網絡變得更加廣泛。
這些微脈管的出血可突然沉澱溶脹並使與動脈解剖、潰瘍或血栓形成相關的斑破裂。也可假設為從這些微脈管中滲漏的血漿蛋白可吸引炎性細胞滲透到該區域，而這些炎性細胞可促進動脈粥樣硬化斑的迅速生長和相關的併發症(通過局部水腫和炎症)。
為了治療諸如上文中討論的那些血管病，可將各種治療劑(有或沒有載體)釋放到身體通道的外部，或經身體通道的外膜釋放到平滑肌細胞。在該情況下特別優選的治療劑包括抗血管生成因子，血小板粘附/聚集的抑制劑(例如阿斯匹林，潘生丁，血栓烷合成抑制劑，導致血栓烷AE產生而不是更有效力的血栓烷A2產生的魚油，結合纖維蛋白原和前列腺素的血小板Ⅱb/Ⅲa受體的抗體)，血管擴張劑(例如鈣進入阻滯劑，和氧化氮供體硝化甘油，硝普鹽和嗎多明)和抗血栓形成藥與凝血酶拮抗劑(例如肝素(低分子量肝素，華法林andudin)。可使用的其他治療劑包括抗炎劑(例如糖皮質激素，地塞米松和甲潑尼龍)，生長因子抑制劑(例如PDGF拮抗劑如曲匹地爾)；受體抑制劑(例如FGF、VEGF、PDGF和TNF的受體的抑制劑)，包括酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的啟動子的抑制劑；抑生長素類似物，包括angiopeptin；血管緊張肽轉化酶抑制劑；和5HT2血清能受體拮抗劑如酮色林)。其他治療劑包括抗增殖劑(例如秋水仙鹼，肝素，β(例如P-32)或γ發射體(例如Ir-192)，鈣進入阻滯劑例如維拉帕米，地爾硫和硝苯地平，降低膽甾醇的HMB Co-A還原酶抑制劑如洛伐他汀，破壞微管功能的化合物如紫杉酚和上述氧化氮供體)，和內皮重新癒合的啟動子(例如bFGF和血管內皮細胞生長因子)。
在本發明的另一方面，本文中所述的治療劑或組合物可用於治療腫瘤性阻塞。簡單地說，如本文中所用的，「腫瘤性阻塞」應理解為包括身體管道的任何腫瘤(良性或惡性的)阻塞，而不管腫瘤所存在的部位或組織學類型。代表性的實例包括胃腸道疾病(例如口咽癌(腺癌)，食管癌(鱗狀細胞，腺癌，淋巴瘤，黑素瘤)，胃癌(腺癌，硬變性胃炎，淋巴瘤，平滑肌肉瘤)，小腸腫瘤(腺瘤，平滑肌瘤，脂瘤，腺癌，淋巴瘤，類癌腫瘤)，結腸癌(腺癌)和肛門直腸癌)；膽道疾病(例如導致膽囊阻塞的腫瘤如胰管癌(管腺癌，島細胞腫瘤，囊腺癌)，膽管癌和肝細胞癌)；肺部疾病(例如肺和/或氣管/支氣管通道的癌(小細胞肺癌，非小細胞肺癌)；女性生殖道疾病(例如輸卵管的惡性腫瘤，子宮癌，宮頸癌，陰道癌)；男性生殖道疾病(例如睪丸癌，附睪癌，輸精管腫瘤，前列腺癌，良性前列腺肥大)；和尿道疾病(例如腎細胞癌，腎盂的腫瘤，尿收集系統的腫瘤如過渡細胞癌，膀胱癌，和因良性狹窄或惡性腫瘤導致的尿道阻塞)。
例如，良性前列腺增生(BPH)是前列腺增大，特別是尿道周圍的腺體的中部，它是在雄激素刺激延長時發生的。50歲以上的男人有80％以上受其影響。這種增大可導致通過前列腺的尿道部分受到壓迫，從而使膀胱流出通道阻塞，即產生尿流需要異常的高膀胱壓力。在1980年，在美國有367,000例為治療BPH而進行了前列腺經尿道切除術。其他治療包括藥物，經尿道括約肌切開術，經尿道雷射或微波治療，經尿道高熱治療，經尿道超聲波治療，經直腸微波治療，經直腸高熱治療，經直腸超聲波治療和手術切除。所有療法都有缺點，包括阻斷了括約肌機制而導致失禁和狹窄形成。
為了治療如上文討論的那些腫瘤疾病，可將各種治療劑(有或沒有聚合物載體)釋放到身體通過的外部，或經身體通道的外膜釋放到平滑肌細胞。在這方面特別優選的治療劑包括上文所述的抗血管生成劑，抗增殖劑或抗腫瘤劑，包括例如可破壞微管功能的化合物，諸如紫杉酚及其衍生物或類似物。
例如，在一個優選的實施方案中，針或導管在超聲波導引下通過經直腸途徑(或經會陰)導引到鄰近尿道的前列腺中並通過其釋放治療劑，優選在數扇腺體中，特別是在尿道周圍。該針或導管也可在直接觸診或在內窺鏡、螢光鏡、CT或MRI導引下放入，並間隔給藥。另一方面，也可經導管或套針完成小丸的放入。上述過程可單獨進行或與將固定模置於前列腺尿道中聯合進行。因為避免了尿道器械操作法或損傷尿道，括約肌機製得以保持完整，避免了失禁，狹窄的可能性也減小了。
在本發明的另一方面，提供了預防或治療會影響或導致身體通道阻塞的炎性疾病的方法。炎性疾病包括使得各種身體管道阻塞的急性和慢性炎症。代表性的實例包括脈管炎(例如顳動脈炎(顳動脈炎，Takayasu's動脈炎)，結節性多動脈炎，變應性血管炎和肉芽腫病(Churg-Strauss疾病)，多血管炎交錯症候群，過敏性脈管炎(Henoch-Schonlein紫癜)，血清病，藥物所致脈管炎，傳染性脈管炎，腫瘤性脈管炎，與相鄰組織疾病有關的脈管炎，與補體系統先天性缺陷有關的脈管炎)，韋格納肉芽腫病，川崎病，中樞神經系統的脈管炎，血栓閉塞性脈管炎和系統性硬化症)；胃腸道疾病(例如胰炎，局限性迴腸炎，潰瘍性結腸炎，潰瘍性直腸炎，原發性硬化性膽管炎，任何原因的良性狹窄包括意想性的(例如膽管、食管、十二指腸、小腸或結腸的狹窄))；呼吸道疾病(例如哮喘，過敏性肺炎，石棉肺，矽肺和其他形式的塵肺，慢性支氣管炎和慢性阻塞性氣道疾病)；鼻淚管疾病(例如所有原因的狹窄包括意想性的)；和咽鼓管病(例如所有原因的狹窄包括意想性的)。
為了治療如上文討論的那些炎性疾病，可將各種治療劑(有或沒有載體)釋放到身體通過的外部，或經身體通道的外膜釋放到平滑肌細胞。在這方面特別優選的治療劑包括非甾類製劑(「NSAIDS」)和甾類製劑，以及上述抗血管生成因子。可使用的其他製劑包括各種抗血管生成因子，包括例如破壞微管功能的化合物，諸如紫杉酚和輕質「d」族過渡金屬。
在本發明的另一方面，提供了治療或預防與身體通道的阻塞有關或是其成因的傳染病的方法。簡單地說，傳染病包括幾種可導致身體通道阻塞的急性和慢性傳染病，包括例如男性生殖道的阻塞(例如因尿道炎、附睪炎、前列腺炎導致的狹窄)；女性生殖道的阻塞(例如陰道炎，宮頸炎，骨盆炎性疾病(例如結核病，淋球菌感染，衣原體感染，腸球菌感染和梅毒)；尿道阻塞(例如膀胱炎，尿道炎)；呼吸道疾病(例如慢性支氣管炎，結核病，其他分支桿菌感染(MAI等)，厭氧菌感染，真菌感染和寄生物感染)和心血管阻塞(例如細菌性動脈瘤和傳染性心內膜炎)。
為了治療如上文討論的那些傳染病，可將各種治療劑(有或沒有載體)釋放到身體通道的外部，或經身體通道的外膜釋放到平滑肌細胞。在這方面特別優選的治療劑包括上文中所述的各種抗生素。
製劑和給藥如上所述，本發明的治療組合物可配製成各種形式(例如微球，糊劑，膜劑或噴霧劑)。另外本發明的組合物可配製成含有一種以上治療劑，含有多種其他化合物，具有一定物理性能(如彈性，特定熔點，或規定釋放速率)。在本發明的某些實施方案中，為了達到預期效果可將多種組合物結合(例如為了實現一種或多種抗血管生成因子的快速和緩慢釋放或延遲釋放可將數種微球製劑結合)。
本發明的治療劑和組合物可單獨給藥，或與藥學上或生理學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結合給藥。一般說來，這樣的載體在所用的劑量和濃度下對於接受者應是無毒的。通常，這樣的組合物的製備必需要讓治療劑與緩衝劑，抗氧劑如抗壞血酸，低分子量(少於約10個殘基)多糖，蛋白質，胺基酸，碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精，螯合劑如EDTA，穀胱甘膚和其他穩定劑和賦形劑相結合。中性緩衝鹽水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是合適的稀釋劑。
如上所述，本文中提供的治療劑，治療組合物，或藥物組合物可製備成用於多種不同途徑給藥的，包括例如在直接視線下(例如在手術時或經內窺鏡治療時)直接釋放到身體通道，或通過經皮藥物釋放途徑而傳送到身體通道的外部(外膜)表面(例如血管周釋放)。其他代表性的給藥途徑包括胃鏡檢查，ECRP和結腸鏡檢查，它們不需要全部手術過程和住院治療，但可能需要醫務人員在場操作。
簡言之，血管周藥物釋放涉及局部化治療劑的經皮給藥(經常是緩釋的)，是利用針或導管經超聲波、CT、螢光鏡、MRI或內窺鏡導引直接給藥到疾病部位。另外該過程也可在直接可視條件下或在其他顯像導引下在手術中進行。這樣的操作也可與血管內操作如血管成形術、粥樣硬化斑切除術或插入固定模結合進行，或與動脈手術過程如動脈內膜剝除術、血管或移植物修復或移植物插入聯合進行。
例如，在一個實施方案中，可將聚合紫杉酚製劑注射到血管壁中或應用於外膜表面使藥物濃度在最需要生物活性的區域保持最高。這有可能減少在血管內藥物釋放設備(如加載藥物的固定模)的表面上可被連續血流增強的藥物的局部「清洗」。將有效的治療劑給藥到血管的外表面可減少該血管的阻塞和降低與血管內操作有關的併發症的危險(諸如再狹窄，栓塞形成，血栓形成，斑破裂，和系統性藥物毒性)。
例如，對於股淺表動脈狹窄的患者，將用常規方式進行氣囊血管成形術(即，氣囊血管成形術導管沿動脈經導引線傳下來並使穿過損傷部位的氣囊充氣)。在進行血管成形術之前，之中，或之後，將針在超聲波、螢光鏡或CT導引下通過皮膚插入，而治療劑(例如灌入緩釋聚合物中的紫杉酚)通過針或導管以圓周的方式直接滲透在動脈中的狹窄處周圍。這可在任何動脈、靜脈或移植物周圍進行，但該手術的理想狀況包括頸動脈、冠狀動脈、髂動脈、股總動脈、股淺表動脈和膕動脈疾病和在移植吻合術部位。邏輯上的靜脈部位包括在靜脈周圍滲透，其中插入了內置導管。
本文中提供的治療劑，治療組合物和藥物組合物可置於容器中，同時包裝材料提供了有關的使用說明書。一般說來，這樣的說明書包括描述試劑濃度的確實表述，以及在某些實施方案中，提供了重新構成抗血管生成因子、抗血管生成組合物或藥物組合物需要的賦形劑成分或稀釋劑(例如水，鹽水或PBS)的相對用量。
以下實施例是為了闡述本發明，而不起限制作用。
實施例實施例1「糊劑」的製備如上所述，本發明提供了多種可在各種臨床情況中使用的含有聚合物的藥物組合物。例如，組合物可以製成(1)作為流體應用到預期部位的「熱糊劑」，其在特定溫度(例如體溫)下凝固為預期形狀的固體；(2)可直接或通過特型設備(例如內窺鏡)而釋放到預期部位的噴霧劑(即「毫微型霧滴」(nanospray))，其隨後硬化為固體粘附到其應用的組織上；(3)可直接或通過特型設備應用到預期部位的粘著的、柔韌的、有彈性的、載藥聚合物膜，它優選粘附到其應用的部位上；和(4)由微球在合適的載體基質中的懸液組成的液體，將其直接或經特型設備應用到預期部位，並在應用部位形成一層微球。下面更詳細地列出上述各實施方案的代表性實例。
A。製備熱糊劑的方法在以下實驗中使用的試劑和設備包括無菌玻璃注射器(1ml),Corning加熱板/攪拌器，20ml玻璃閃爍管，模子(例如50μlDSC盤或50ml蓋住內部的離心管)，解剖刀和鑷子，聚己內酯(「PCL」-摩爾重量10,000-20,000；Polysciences,Warrington,PennsylvaniaUSA)，和紫杉酚(Sigma級別95％最小純度)。
將重5.00g的聚己內酯直接加入20ml玻璃閃爍管中。將管置於含有50ml水的600ml燒杯中。將該燒杯溫和加熱到65℃並在該溫度下保持20分鐘。這將使聚合物熔解。在65℃下將已知重量的紫杉酚，或其他血管形成抑制劑充分混合到熔解的聚合物中。將該熔化的聚合物倒入預熱(60℃烘箱)的模子中。利用刮勺幫助該傾倒過程。使模子冷卻，則聚合物固化。將聚合物切割或打碎成小塊(約2mm×2mm大小)。這些小塊必須能裝入1ml玻璃注射器中。將1ml玻璃注射器的栓塞拿掉(不拿走頂部的蓋子)並將其置於天平上。將天平調零。
將重0.5g的小塊直接加入該注射器的開口端。將該玻璃注射器豎直(加蓋端向下)放入65℃(Corning加熱板)下的含有蒸餾水的500ml玻璃燒杯中以使水不能進入注射器的外管中。聚合物在該設備中在10分鐘內完全熔解。當聚合物小塊已熔解後，從水浴中取出注射器外管，將其保持水平並除去蓋子。將栓塞插入外管中並將熔解的聚合物在外管的頂端壓成粘著的團。將該注射器蓋上並使其冷卻至室溫。
應用時，可以將該注射器重新加熱到60℃並作為液體給藥，當其冷卻至體溫時固化。
B．製備毫微型霧滴的方法毫微型霧滴是小微球在鹽水中的懸液。如果微球非常小(即直徑在1μm以下)，它們將形成膠體，則該懸液將無法在重力作用下沉降。按照下文中的詳細描述，可製成適於通過指泵式(finger pumped)氣溶膠而沉積到組織上的0.1μm到1μm微粒的懸液。用來製備毫微型霧滴的設備和材料包括200ml水套層燒杯(Kimax或Pyrex)，Haake循環水浴，直徑2英寸的頂部攪拌器和調節器(4葉片，螺旋槳式不鏽鋼攪拌器；Fisher牌)，500ml玻璃燒杯，加熱板/攪拌器(Corning牌)，4×50ml聚丙烯離心管(Nalgene)，有塑料插入蓋的玻璃閃爍管，臺式離心機(Beckman)，高速離心機-落地型(JS 21 Beckman)，Mettler分析天平(AJ 100,0.1mg),Mettler數字上皿式天平(AE163,0.01mg)，自動移液管操縱器(Gilson)，無菌移液管尖，泵推式氣溶膠(Pfeiffer pharmaceuticals)20ml，層流通風櫥，聚己內酯(「PCL」-摩爾重量10,000-20,000；Polysciences,Warrington,Pennsylvania USA)，「洗過的」(參見上文)乙烯乙酸乙烯酯(「EVA」)，聚(DL)乳酸(「PLA」-摩爾重量15,000-25,000；Polysciences)，聚乙烯醇(「PVA」-摩爾重量124,000-186,000；99％水解；Aldrich Chemical Co.,Milwaukee WI USA)，二氯甲烷(「DCM」或「methylene chloride」；HPLC級，Fisherscientific)，蒸餾水，無菌鹽水(Becton和Dickenson or等同物)。
1．製備5％(w/v)聚合物溶液根據所製備的聚合物溶液，將重1.00g的PCL或PLA或各0.50g的PLA和洗過的EVA直接加入20ml玻璃閃爍管中。用量筒加入20ml二氯甲烷並將該閃爍管緊緊蓋上。將該管在室溫(25℃)中放置1小時或直到所有的聚合物均已溶解(可偶爾用手振搖)。聚合物的溶解可以通過視力檢查來測定，該溶液應是澄清的。給該閃爍管貼上標籤標出溶液的名字和其產生的日期。將該溶液儲存於室溫下並在兩周內使用。
2．製備3.5％(w/v)PVA儲液該溶液可按照下文中給出的方法製備，或者用為了生產微球而製備的5％(w/v)PVA儲液(參見實施例2)稀釋而成。簡單地說，稱取17.5gPVA直接加入600ml玻璃燒杯中，並加入500ml蒸餾水。在該燒杯中放置3英寸塗覆特氟隆的攪拌棒。用玻璃蓋將該燒杯蓋上以減少蒸發損失。將該燒杯置於含有300ml水的2000ml玻璃燒杯中。這將用作水浴。在85℃下以300rpm攪拌該PVA(Corning加熱板/攪拌器)2小時或直到完全溶解。PVA的溶解可以通過視力檢查來測定，該溶液應是澄清的。用移液管將該溶液轉移到玻璃螺旋蓋儲存容器中並在4℃下儲存最多兩個月。使用或稀釋前應將該溶液加熱到室溫。
3．製備毫微型霧滴的方法將攪拌裝置置於通風櫥中。將100ml 3.5％PVA溶液置於200ml水套層燒杯中。將Haake水浴與該燒杯連結並使內容物在27℃(+/-1℃)平衡10分鐘。設定頂部攪拌器的開始速率為3000rpm(+/-200rpm)。將頂部攪拌器的葉片浸入PVA溶液一半並開始攪拌。用5ml自動移液管操縱器將10ml聚合物溶液(所用的聚合物溶液根據所製備的毫微型霧滴類型而定)在2分鐘內滴入攪拌的PVA中。3分鐘後將攪拌速率調節到2500rpm(+/-200rpm)並保持2.5小時。2.5小時後，從毫微型霧滴製劑中除去攪拌葉片並用10ml蒸餾水衝洗。將衝洗溶液併入毫微型霧滴製劑中。
將微球製劑倒入500ml燒杯中。用70ml蒸餾水洗滌該套層水浴。將70ml衝洗溶液併入微球製劑中。用玻璃棒攪拌180ml微球製劑並將其等量地倒入4個聚丙烯50ml離心管中。將各管蓋上蓋子。蓋好的離心管在10000g(+/-1000g)離心10分鐘。利用5ml自動移液管操縱器或通過真空吸取，從各丸狀微球的PVA溶液中吸出45ml並丟棄。向各離心管中加入5ml蒸餾水並利用渦流使各管中的微球再次懸浮。用20ml蒸餾水將4份微球懸液匯集到1個離心管中。為了洗滌微球，將該毫微型霧滴製劑在10000g(+/-1000g)離心10分鐘。吸出丸狀微球的上清液。加入40ml蒸餾水並利用渦流使微球再次懸浮。再重複該過程兩次，共洗滌三次。第四次洗滌中當再次懸浮微球時僅使用10ml(不是40ml)蒸餾水。洗滌完四次後，將該微球製劑轉移到預稱重的玻璃閃爍管中。
將該閃爍管蓋上並讓其在室溫(25℃)下放置1小時以使直徑2μm和3μm的微球在重力下沉降出來。1小時後，用5ml自動移液管操縱器吸出上部9ml懸液。將該9ml懸液加入無菌加蓋的50ml離心管中。在10000g(+/-1000g)下離心該懸液10分鐘。除去上清液並將該小丸再次懸浮於20ml無菌鹽水中。該懸液在10000g(+/-1000g)下離心10分鐘。除去上清液並將該小丸再次懸浮於無菌鹽水中。所用的鹽水的量根據所需的懸液終濃度而定(通常為10％w/v)。用無菌鹽水徹底衝洗氣溶膠設備並將該毫微型霧滴懸液加入氣溶膠中。
C．製備加載紫杉酚的毫微型霧滴為了製備含有紫杉酚的毫微型霧滴，使用紫杉酚(Sigma級95％純度)。為了製備聚合物藥物儲液，稱取合適量的紫杉酚直接加入20ml玻璃閃爍管中。合適的量根據紫杉酚在毫微型霧滴中將佔的百分數而定。例如，如果需要含有5％紫杉酚的毫微型霧滴，則應稱取25mg紫杉酚，因為所加入的聚合物的量是10ml5％聚合物的二氯甲烷溶液(參見下一步驟)。
將10ml合適的5％聚合物溶液加入含有紫杉酚的閃爍管中。將該管蓋上蓋並用渦流或手動攪動使紫杉酚溶解(視力檢測以確保紫杉酚溶解)。給該管貼上標籤標出其產生的日期。這將在其生成當天使用。
繼續進行上文中描述的過程，只是用聚合物/藥物(例如紫杉酚)儲液代替聚合物溶液。
D．製備膜的方法術語膜是指形成多種幾何形狀之一的聚合物。該膜可以是薄的彈性聚合物片或2mm厚的聚合物圓片。該膜設計為將置於暴露的組織上以使任何被封裝的藥物在組織部位在較長的時間內從聚合物中釋放。膜可以用多種方法製備，包括例如通過澆鑄或通過噴霧。
在澆鑄技術中，將聚合物熔解並倒入定型模中或將其溶於二氯甲烷並倒入定型模中。然後該聚合物或當其冷卻時固化或當溶劑蒸發時固化。在噴霧技術中，將聚合物溶於溶劑中並噴灑到玻璃上，當溶劑蒸發時聚合物在玻璃上固化。反覆噴灑可使聚合物形成可從玻璃上剝落下來的膜。
在這些實驗中使用的試劑和設備包括小燒杯，Corning加熱板攪拌器，澆鑄模(例如50ml加蓋離心管)和模支撐設備，帶蓋的20ml玻璃閃爍管(塑料插入型)，TLC霧化器，氮氣罐，聚己內酯(「PLC」-摩爾重量10,000-20,000；Polysciences)，紫杉酚(Sigma95％純度)，乙醇，「洗過的」(參見上文)乙烯乙酸乙烯酯(「EVA」)，聚(DL)乳酸(「PLA」-摩爾重量15,000-25,000；Polysciences)，二氯甲烷(HPLC級Fisher Scientific)。
1．製備膜的方法-熔解澆鑄稱取已知重量的PCL直接加入小玻璃燒杯中。將該燒杯置於含有水的大燒杯(用作水浴)中並將其放在70℃加熱板上15分鐘或直到聚合物已完全熔解。將已知重量的藥物加入熔解後的聚合物中並充分攪拌該混合物。為了幫助藥物在熔解的PCL中分散，可將藥物懸浮/溶解於少量(＜10％體積的熔解PCL)100％乙醇中。然後將該乙醇懸液混合到熔解聚合物中。將該已熔解聚合物倒入模子裡並使其冷卻。冷卻後，將該膜儲存於容器中。
2．製備膜的方法-溶劑澆鑄稱取已知重量的PCL直接加入20ml玻璃閃爍管中並加入足量二氯甲烷以形成10％w/v溶液。將該管蓋上蓋並將溶液混合。向該溶液中加入足量紫杉酚以達到紫杉酚的預期終濃度。用手振搖或利用渦流使紫杉酚溶於溶液中。讓該溶液放置1小時(以清除存在的氣泡)然後將其緩慢倒入模子裡。所用的模子根據需要的形狀而定。將該模子置於通風櫥中過夜。這將使二氯甲烷蒸發。或讓膜留在模子裡儲藏或將其剝離出來並在密閉容器中儲藏。
3．製備膜的方法-噴霧法稱取足量的聚合物直接加入20ml玻璃閃爍管中並加入足量二氯甲烷使達到2％w/v溶液。將該閃爍管蓋上蓋並混合該溶液使聚合物溶解(手振搖)。用合適的模子支撐設備將模子以垂直方向裝配在通風櫥中。將該模子支撐設備放在合適的支持物(例如倒置的2000ml玻璃燒杯)上使其距離通風櫥底板6-12英寸以使水平噴霧。用自動移液管將合適體積(最小5ml)的2％聚合物溶液轉移到分離的20ml玻璃閃爍管中。向該溶液中加入足量紫杉酚並通過用手振搖加蓋的閃爍管使其溶解。為了準備噴霧，將該閃爍管的蓋子拿開並(僅)將TLC霧化器的外管浸入聚合物溶液中。注意在該過程中並不使用霧化器的儲存器-20ml玻璃管用作儲存器。
將氮氣罐與霧化器的氣體入口連接。逐漸升高壓力直到霧化和噴霧開始。注意壓力並在整個過程中使用該壓力。用5秒振蕩噴霧噴灑模子，在噴霧之間有15秒乾燥時間。在乾燥期間，用手指將氣體管道捲起來以避免破壞噴霧。繼續噴灑直到合適厚度的聚合物沉積在模子上。厚度根據需要而定。讓噴好的膜附著在模子上並儲藏於密閉容器中。
E．製備毫微型糊劑(nanonaste)的方法毫微型糊劑是微球懸浮於親水性凝膠中的懸液。在本發明的一個方面中，凝膠或糊劑可按照使加載了藥物的微球位於靶組織附近的方法而塗抹在組織上。因為是水基的，糊劑將很快被體液稀釋使糊劑的粘著性下降且微球傾向沉積在組織附近。由此封裝了藥物的微球集中定位在靶組織周圍。
在這些實驗中使用的試劑和設備包括玻璃燒杯，卡波泊爾(Carbopol)925(藥用級，Goodyear Chemical Co.)，蒸餾水，氫氧化鈉水溶液(1M)，氫氧化鈉水溶液(5M)，以20％w/v懸浮於水中的0.1 μm-3μm大小的微球(參見上文)。
1．製備5％w/v Carbopol凝膠向1M氫氧化鈉中加入足量carbopol得到5％w/v溶液。為了將carbopol溶於1M氫氧化鈉中，使該混合物放置約1小時。在這段時間裡，用玻璃棒攪拌該混合物。1小時後，測定混合物的pH。pH低表明carbopol未完全溶解。希望pH達到7.4。用5M氫氧化鈉調節pH。這是通過將5M氫氧化鈉緩慢滴加到該混合物中進行的，攪拌該混合物並測定其pH。通常花費約1小時將pH調節到7.4。一旦pH達到7.4，將該凝膠蓋住並放置2到3小時。之後，檢查pH確保其仍為7.4。如果有變化，則利用5M氫氧化鈉將其調回到pH7.4。使該凝膠放置數小時以確保pH穩定在7.4。重複該過程直到達到預期的pH值並且是穩定的。給該容器貼上標籤標出凝膠的名稱及日期。在下周內用該凝膠製備毫微型糊劑。
2．製備毫微型糊劑的方法將足量0.1μm到3μm微球加入水中製得微球的20％懸液。將8ml5％w/v carbopol凝膠加入玻璃燒杯中，向該燒杯中加入2ml20％微球懸液。用玻璃棒或混合刮勺攪拌該混合物以使微球充分分散到整個凝膠中。這通常需要30分鐘。一旦微球已分散到凝膠中，就將該混合物置於儲存瓶中。該瓶儲存於4℃下。它必須在1個月內使用。
實施例2微球的製備下面描述優選用於製備微球的設備，包括200ml水套層燒杯(Kimax或Pyrex)，Haake循環水浴，直徑2英寸的頂部攪拌器和調節器(4葉片，螺旋槳式不鏽鋼攪拌器；Fisher牌)，500ml玻璃燒杯，加熱板/攪拌器(Corning牌)，4×50ml聚丙烯離心管(Nalgene)，有塑料插入蓋的玻璃閃爍管，臺式離心機(GPRBeckman)，高速離心機-落地型(JS 21 Beckman),Mettler分析天平(AJ 100,0.1mg),Mettler數字上皿天平(AE 163,0.01mg)，自動移液管操縱器(Gilson)，試劑包括聚己內酯(「PCL」-摩爾重量1 0,000-20,000；Polysciences,Warrington,PennsylvaniaUSA)，「洗過的」(參見後面的「洗滌」方法)乙烯乙酸乙烯酯(「EVA」)，聚(DL)乳酸(「PLA」-摩爾重量15,000-25,000；Polysciences)，聚乙烯醇(「PVA」-摩爾重量124,000-186,000；99％水解；Aldrich Chemical Co.,Milwaukee WI USA)，二氯甲烷(「DCM」或「methylene chloride」；HPLC級Fisher scientific)，和蒸餾水。
A．製備5％(w/v)聚合物溶液根據所製備的聚合物溶液，將1.00gPCL或PLA，或各0.50g的PLA和洗過的EVA直接稱取到20ml玻璃閃爍管中。然後加入20ml二氯甲烷，並將該管蓋緊。將該管在室溫(25℃)下儲存1小時(偶爾用手振搖)，或直到所有的聚合物均已溶解(溶液應是澄清的)。該溶液可在室溫下儲存至少兩周。
B．製備5％(w/v)PVA儲液將25g PVA直接稱取到600ml玻璃燒杯中，加入500ml蒸餾水，同時加入3英寸塗覆特氟隆的攪拌棒。用玻璃蓋將該燒杯蓋上以減少蒸發損失並將其置於含有300ml水的2000ml玻璃燒杯中(用作水浴)。在85℃下以300rpm攪拌該PVA(Corning加熱板/攪拌器)2小時或直到完全溶解。PVA的溶解可以通過視力檢查來測定，該溶液應是澄清的。然後將該溶液轉移到玻璃螺旋蓋儲存容器中並在4℃下儲存最多兩個月。不過該溶液在使用或稀釋前應加熱到室溫。
C．製備微球的方法根據所製備的微球的大小(參見表1)，將100ml PVA溶液(表1中給出的濃度)置於200ml水套層燒杯中。將Haake循環水浴與該燒杯連結並使內容物在27℃(+/-1℃)平衡10分鐘。根據所製備的微球的大小(參見表1)，設定頂部攪拌器的開始速率，將頂部攪拌器的葉片浸入PVA溶液一半。然後開始攪拌，然後用5ml自動移液管操縱器將10ml聚合物溶液(所用的聚合物溶液根據所製備的微球的類型而定)在2分鐘內滴入攪拌的PVA中。3分鐘後調節攪拌速率(參見表1)並將該溶液再攪拌2.5小時。然後從微球製劑中取出攪拌葉片並用10ml蒸餾水衝洗使衝洗溶液流入微球製劑中。然後將該微球製劑倒入500ml燒杯中，用70ml蒸餾水洗滌該套層水浴，該衝洗溶液也流入微球製劑中。用玻璃棒攪拌該180ml微球製劑並將其等量地倒入4個聚丙烯50ml離心管中。將各管蓋上蓋子並離心10分鐘(表1中給出了離心力)。利用5ml自動移液管操縱器或通過真空吸取從各丸狀微球的PVA溶液中吸出45ml。
表1各直徑範圍的微球所需的PVA濃度，攪拌速率，和離心力


>向各離心管中加入5ml蒸餾水並利用渦流使微球再次懸浮。用20ml蒸餾水將4份微球懸液匯集到1個離心管中並再離心10分鐘(表1中給出的離心力)。該過程再重複兩次，共洗滌三次。然後該微球離心最後一次，並再次懸浮於10ml蒸餾水中。洗滌完最後一次後，將該微球製劑轉移到預稱重的玻璃閃爍管中。將該閃爍管蓋上蓋並讓其在室溫(25℃)下放置過夜以使微球在重力下沉降出來。大小在0.1μm到3μm範圍內的微球沒有在重力作用下沉降出來，因此它們留在10ml懸液中。
D．將10μm到30μm或30μm到100μm直徑的微球乾燥當微球在室溫下放置過夜後，用5ml自動移液管操縱器或通過真空吸取將沉降後的微球的上清液吸出。讓微球在櫥櫃中在未蓋蓋的閃爍管中乾燥1周或直到它們完全乾燥(閃爍管達到恆重)。可將未蓋蓋的閃爍管置於通風櫥中在緩慢的氮氣流下(流速約10ml/分鐘)快速乾燥。當已完全乾燥(閃爍管達到恆重)時將該管稱重並蓋上蓋。將貼上標籤的蓋上蓋的閃爍管在室溫下儲存於櫥櫃中。一般微球儲存不超過3個月。
E.0.1μm到3μm直徑微球的乾燥該大小範圍的微球未沉降出來，因此它們留在4℃下的懸液中最多4周。為了測定微球在10ml懸液中的濃度，將200μl懸液樣品吸取到1.5ml預稱重的微量離心管中。然後該管在10000g下離心(Eppendorf臺式微量離心機)。除去上清液，然後該管在50℃下乾燥過夜。再次將該管稱重以測定管中乾燥後的微球的重量。
F．製備加載紫杉酚的微球為了製備含有紫杉酚的微球，稱取合適量的(根據要封裝的紫杉酚的百分數而定)紫杉酚直接加入20ml玻璃閃爍管中。然後將10ml合適的聚合物溶液加入含有紫杉酚的閃爍管中，用渦流直到紫杉酚溶解。
然後可基本按照上述步驟(C)到(E)製備含有紫杉酚的微球。
實施例3塗敷表面活性劑的微球A．材料與方法基本如實施例2中所述用聚(DL)乳酸(PLA)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚己內酯(PCL)和50∶50乙烯乙酸乙烯酯(EVA)PLA製備微球。大小範圍從10到100um，平均直徑45um。
從健康志願者身上採得人血。利用葡聚糖沉降和Ficoll Hypaque離心技術從該血液中分離出中性粒細胞(白細胞)。將中性粒細胞以5百萬細胞/ml的密度懸浮於Hanks緩衝鹽溶液(「HBSS」)中。
利用化學發光測定活性氧組分的產生，從而測定中性粒細胞活化水平。具體地說，利用帶有1uM魯米諾增強子的LKB發光計測定化學發光。通過將10mg微球懸浮於0.5ml血漿中並在37℃轉動30分鐘而完成微球的血漿預塗漬(或調理)。
然後微球用1mlHBSS洗滌並在37℃下在時間t=0時將離心後的丸狀微球加到中性粒細胞的懸液中。利用叫做多聚醇F127(BASF)的表面活性劑，通過在37℃將10mg微球懸浮於0.5ml2％w/wF127的HBSS溶液中30分鐘來修飾微球表面。然後微球用1mlHBSS洗滌兩次，再加入中性粒細胞或血漿中進一步預塗漬。
B．結果圖1顯示未處理過的微球給出的化學發光值小於50mV。這些值代表中性粒細胞的活化水平低。通過對比，炎性微晶給出的值接近1000mV，可溶性化學激活物給出的值接近5000mV。但是，當微球用血漿預塗漬後，所有化學發光值都增大到100到300mV的範圍(參見圖1)。這些中性粒細胞反應或活化水平可被認為是中度炎症。PMMA給出了最大反應並可看作是重度炎症。PLA和PCL在用血漿預處理(或調理)後活化中性粒細胞的效力均增大了3到4倍，但這兩種聚合物在這方面幾乎沒有不同。由於微球難以乾燥並再懸浮於含水緩衝液中，因此EVA∶PLA不太可能用於血管形成製劑中。這種血漿作用稱作調理作用並由抗體或補體分子吸附到表面上而產生。這些吸附的組分與白細胞上的受體相互作用並使細胞活化增強。
圖2-5分別描述了PCL,PMMA,PLA和EVA∶PLA的血漿預塗漬的影響，並顯示了在微球的血漿預塗漬之前預塗漬多聚醇F127的作用。這些圖均顯示了相同的作用結果(1)血漿預塗漬使反應增強了；(2)預塗漬多聚醇F127對其自身特性沒有影響；(3)通過用2％多聚醇F127預處理微球的表面可強烈抑制由血漿預塗漬而導致的增強的中性粒細胞反應。
還通過電泳研究了從血漿吸附的蛋白質組分的性質。利用此方法，結果顯示用多聚醇F127預處理聚合物表面抑制了抗體吸附到聚合物表面。
圖6-9同樣顯示了用IgG(2mg/ml)或先用2％多聚醇F127後再用IgG(2mg/m1)(分別)預塗漬PCL,PMMA,PLA或EVA∶PLA微球的作用。從這些圖中可看出，通過用多聚醇F127處理可抑制由用IgG預塗漬微球而導致的增強的反應。
這些結果表明所有四種類型的微球的聚合物表面通過用多聚醇F127預處理可抑制中性粒細胞對微球的「炎症」反應。
實施例4紫杉酚包膠囊將500mg紫杉酚或漿果赤黴素(紫杉酚類似物，可從InflazymePharmaceuticals Inc.,Vancouver,British Columbia,加拿大得到)溶於1ml在二氯甲烷中的50∶50 ELVAX聚-1-乳酸混合物中。然後用溶解機(六錠溶解測定器，VanderKanp,Van Kell Industries Inc.，美國)以42℃,200rpm,3小時的條件製備微球一式三份。如此製得的微球用水洗滌兩次並用顯微鏡測定大小。
紫杉酚包膠囊的測定是用紫外/可見光試驗進行的(紫外/可見光λmax237nm，螢光測試在237激發，在325nm發射；螢光結果在方括號[]中表示)。用上述方法，可以從總重500μg的起始物包膠58μg(+/-12μg)[75μg(+/-25μg)]紫杉酚。這代表初始重量的12％(+/-2.4％)[15％(+/-5％)]，或聚合物重量的1.2％(+/-0.25％)[1.5％(+/-0.5％)]。在37℃下烘箱中轉動18小時後，從該微球中釋放了紫杉酚總量的10.3％(+/-10％)[6％(+/-5.6％)]。
至於漿果赤黴素，從500μg起始物可包膠100+/-15μg[83+/-23μg]漿果赤黴素。這代表漿果赤黴素初始重量的20％(+/-3％)[17％(+/-5％)]，和聚合物重量的2％(+/-0.3％)[1.7％(+/-0.5％)]。在37℃下烘箱中轉動18小時後，從該微球中釋放了漿果赤黴素的55％(+/-13％)[60％(+/-23％)]。
實施例5紫杉酚從含有乙烯乙酸乙烯酯共聚物和聚(D,L-乳酸)的混合物的微球中的控制釋放微球的CAM體內試驗該實施例記載了含有可生物降解的聚(d,1-乳酸)(PLA)聚合物和不可降解的乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物的混合物的負載紫杉酚微球的製備。另外，證明了體外條件下紫杉酚從置於CAM上的微球中釋放的釋放速率和抗血管形成活性。
在此實驗中使用的試劑包括紫杉酚，購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)；PLA(分子量15,000-25,000)和EVA(60％乙烯乙酸酯)(購自Polyscience)(Warrington,PA)；聚乙烯醇(PVA)(分子量124,000-186,000,99％水解，購自Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,WI))，二氯甲烷(DCM)(HPLC純度級，購自FisherScientific Co.)，從始至終使用蒸餾水。
A．製備微球基本按照實施例2使用溶劑蒸發法製備微球。概括地說，用EVA∶PLA35∶65-90∶10的混合物製備5％w/v溶於20mlDCM的聚合物溶液。將1ml聚合物溶液攪拌滴加到盛有5ml2.5％w/vPVA水溶液的20ml的玻璃瓶中。在上部攪拌溶解測試裝置(Vanderkamp)的6個位置安裝6個相似的小瓶，並在200rpm攪拌。將小瓶的溫度在15分鐘內從室溫增加到40℃，在40℃保溫2小時。在500xg將小瓶離心，將微球在水中清洗3次。某些EVA∶PLA聚合物混合物，微球樣品在清洗過程中由於除去分散劑或乳化劑PVA而聚集。可以半定量地分析此聚集效應，因為聚集的微球溶化，溶化的聚合物團塊浮在清洗用水的表面。在清洗處理過程中棄去表面的聚合物層，將剩餘的丸狀微球稱重。
用下式計算聚集百分率

將紫杉酚溶解在5％w/v聚合物DCM溶液中，製備含有紫杉酚的微球(0.6％w/w紫杉酚)。所用的混合聚合物為50∶50EVA∶PLA。將紫杉酚/聚合物溶液分別滴加到2.5％w/vPVA和5％W/VPVA中製備「大」號和「小」號微球。在40℃，以200rpm轉速將分散相攪拌2小時，離心，如上所述在水中清洗3次。將微球空氣乾燥，用安有目鏡測微器的光學顯微鏡測定樣品體積。每個樣品測定300個微球。如上所述製備對照微球(無紫杉酚)並測定其體積。
B．包封效率將已知重量的加載紫杉酚的微球溶解在1mlDCM中，加入20ml50℃的40％乙腈水溶液，旋轉至將DCM蒸發。通過HPLC法測定紫杉酚在40％乙腈中的濃度，流動相為水∶甲醇∶乙腈(37；5∶58)，流速1ml/分鐘(Beckman isocratic泵)，C18反相柱(Beckman)，UV檢測器在232nm測定。為測定此提取過程的回收率，將100-1000μg已知重量的紫杉酚溶解在1mlDCM中，如上所述製備同樣的三份提取物。回收率均大於85％，適當地校正包封效率。
C．藥物釋放研究在15ml玻璃器中，在有螺旋帽的試管中加入10ml10mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH7.4，和35mg加載紫杉酚的微球，將試管在37℃於給定時間間隔振搖，於1500xg離心5分鐘，保留上清液用於分析。將微球沉澱再次懸浮於新鮮PBS(10ml)中，37℃再保溫。以1mlDCM提取紫杉酚，在氮氣流下蒸發至幹，以1ml40％乙腈水溶液重新溶解，如上所述用高效液相法測定紫杉酚濃度。
D．掃描電子顯微鏡(SEM)將微球置於樣品架上，在其表面噴金，在15kV條件下，用Philips501B SEM觀察所得顯微圖像。
E．CAM研究將受精的家雞的胚胎在脫殼培養前孵育4天。卵的內含物在90％相對溼度和3％CO2條件下保溫2天。在保溫的第6天，將每份1mg含有0.6％紫杉酚的微球或對照微球(無紫杉酚)的樣品直接置於CAM表面。接觸2天後，用接有攝像機的立體顯微鏡觀察其血管系統，圖像信號顯示在計算機上，並列印出來。
F．結果用100％EVA製備的微球在PVA溶液中自然懸浮，隨後以水清洗，使之徹底聚集或融熔以除去PVA。使EVA與PLA混合時，PLA的比例增加，製得的微球在用水清洗時，其聚集或凝結的趨勢降低，如圖10A所示。以EVA∶PLA的比例為50∶50混合生成的微球有好的物理穩定性，即這些微球保持分離並較好地懸浮，其聚集或凝結可以忽略不計。
「小」體積微球的體積範圍定義為＞95％的微球樣品體積(以重量計)在10-30mm，而對於「大」體積微球，應為＞95％樣品(以重量計)在30-100mm。含有紫杉酚的50∶50EVA∶PLA微球的「大」體積和「小」體積微球的典型的掃描電子顯微照片分別示於圖10B和10C。微球為具有光滑表面的球形，沒有跡象顯示固體藥物在微球的表面。在紫杉酚的初始濃度介於100-1000mg紫杉酚每50mg聚合物的範圍內，50∶50 EVA∶PLA微球對於紫杉酚的載藥效率為95-100％。「大」、「小」微球的包封效率之間沒有顯著差異(學生t-試驗p＜0.05)．載藥量為0.6％w/v的50∶50EVA∶PLA的「小」體積(開環)和「大」體積(閉環)微球中紫杉酚的釋放過程示於圖10D。每個樣品一式三份分別進行實驗以研究釋放速率。釋放曲線為兩階段，紫杉酚的初始快速釋放或「爆發」階段發生在從兩種體積的微球釋放出來的前4天。後隨一非常緩慢釋放的階段，「大」、「小」微球的釋放速率之間沒有顯著性差異。微球中總紫杉酚含量的10-13％在50天內釋放。
用CAM測定法對載有紫杉酚的微球(載藥量0.6％)進行實驗，結果示於圖10E。紫杉酚微球釋放足夠的藥物在周圍組織產生一無血管區(圖10F)。注意非常鄰近微球的區域(圖10E、10F中的「MS」)為一完全無血管區(區域1)，稍遠為一斷裂、無功能的毛細血管區(區域2)，只在距微球約6mm處毛細血管恢復正常。在用對照微球(無紫杉酚)處理的CAMs，有正常的毛細血管網結構(未示出)。討論小管周圍用藥是一種損害輕微的外科技術。因此，理想地，抗增生藥物如紫杉酚的血管周圍劑型將在腫瘤或病變部位釋放足夠濃度的藥物以使藥效具有延長的時間周期，一般長達幾個月。EVA為一組織相容的不可降解的聚合物，它被廣泛地用於在較長時間周期內(＞100天)控制釋放大分子。
初始選擇EVA作為聚合的生物材料，將紫杉酚分散在此聚合物基質中製備微球。然而用100％EVA製備的微球在清洗過程中幾乎完全聚集和凝結。
基於乳酸和乙醇酸的聚合物和共聚物具有生理學惰性和生物相容性，並能水解降解成毒理學能接受的產物。乳酸和乙醇酸共聚物的降解速率快於PLA，用這些共聚物製備的含藥微球不適於長達幾個月的延長的控制釋放。
圖10A顯示在EVA∶PLA混合物中增加PLA的比例，會降低微球懸浮液的聚集程度。在EVA∶PLA基質中混入50％或更少的EVA產生在水或PBS中具有物理穩定性的微球懸浮液。此後的研究選擇50∶50EVA∶PLA混合物。
可以改變水相中乳化劑PVA的濃度製備不同體積範圍的微球。在5％w/v的高PVA濃度製備「小」微球，而在2.5％w/v的PVA濃度製備「大」微球。對於兩種體積的微球，其它製備條件相同。乳化劑濃度越高，水分散介質的粘性越大，在水相中產生的聚合物/紫杉酚/DCM的乳化液滴越小，從而產生較「小」微球。負載紫杉酚的微球含有紫杉酚的初始濃度為95-100％，將紫杉酚加入有機相，使其被包封在固體微球中的。紫杉酚的低水溶性使其易於被分隔進入含有聚合物的有機相。
紫杉酚從50∶50EVA；PLA的微球中的釋放速率很慢，在50天內所含紫杉酚的釋放量少於15％。可以由於藥物從微球表面區域(接近微球表面)的擴散導致藥物釋放的初始爆發相。
藥物從不可降解的聚合基質，如EVA中的釋放機制被認為包括水經聚合物中的藥物分散相擴散，藥物溶解和溶質經一系列互聯的、充滿流動相的孔擴散。當PLA中EVA的範圍為30-70％時，EVA與PLA的混合物是不混溶或雙連續的。在37℃PBS中進行的降解研究中，在一誘導期或滯後期之後，PLA從EVA∶PLA聚合物混合基質中被水解降解和被浸蝕，剩下非活性的海綿狀骨架。雖然誘導期、PLA降解速率和混合基質的浸蝕速率取決於PLA在基質中的比例和此過程的時間關係函數，在40-50天後，PLA均不再或很少降低。
雖然PLA從50∶50EVA∶PLA微球中的某些浸蝕發生在體外釋放研究的50天內(圖10C)，藥物在聚合物混合物中的主要釋放機制為溶質經聚合物基質中小孔網狀結構的擴散。
釋放速率研究結論為，從微球中剩餘藥物數量分析微球的釋放速率。在保溫50天的微球樣品中，「大」體積和「小」體積微球中剩餘紫杉酚的百分率分別為94％+/-9％和89％+/-12％。
每mg聚合物含有6mg紫杉酚的微球(0.6％)，將其置於雞胚的CAM上時產生廣泛的血管生成抑制作用(圖10E和10F)。
實施例6
用聚(E-己內酯)微球包封的治療劑含有紫杉酚的微球在CAM測定中的血管生成抑制作用該實施例測定了紫杉酚從聚(ε-己內酯)生物降解微球中的體外釋放曲線，並證實了當置於CAM上時，從這些微球中釋放的紫杉酚的體內抗血管生成活性。
在這些實驗中使用的試劑包括聚(ε-己內酯)(「PCL」)(分子量35,000-45,000)；購自Polysciences(Warrington,PA)；二氯甲烷(「DCM」),Fisher Scientific Co.加拿大；聚乙烯醇(PVP)(分子量12,000-18,000,99％水解〕，Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,Wis.)，和紫杉酚，得自Sigma化學公司(St.Louis,MO)。除非另有說明，所有化學藥品和試劑均如上所述。始終使用蒸餾水。
A．製備微球基本按照實施例2使用溶劑蒸發法製備微球。概括地說，將10mg紫杉酚和190mgPCL溶於2mlDCM中，加入100ml1％PVP水溶液中，並在25℃1000rpm轉速的條件下攪拌2小時，製備含有5％w/w紫杉酚的微球。將微球懸浮液離心，1000xg,10分鐘(BeckmanGPR)，棄去上清液，將微球以水清洗3次。清洗後的微球空氣乾燥過夜，保存在室溫。如上製備對照微球(無紫杉酚)。也製備含有1％和2％紫杉酚的微球。用安有目鏡測微器的光學顯微鏡測定樣微球體積。
B．包封效率將已知重量的含藥微球(約5mg)溶解在8ml乙腈中，加入2ml蒸餾水，促使聚合物沉澱。在1000g將混合物離心10分鐘，用UV分光光度計(Hewlett-Packard 8452A Diode Array分光光度計)在232nm測定上清液的吸收，計算紫杉酚的包封量。
C．藥物釋放研究在具螺旋帽的試管中，將約10mg含有紫杉酚的微球懸浮在20mlpH7.4的10mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。將試管在37℃顛倒翻轉，在給定的時間間隔，取上清液19.5ml(使微球降落到管底後)，經過0.45um濾膜過濾，留作分析紫杉酚。在每管中代替以等體積的PBS以在實驗過程中保持滲透條件。以3×1mlDCM提取濾液，DCM提取物在氮氣流下蒸發至幹，再溶於1ml乙腈中，以HPLC法測定。流動相∶水∶甲醇∶乙腈(37∶5∶58)，流速1ml/分鐘，(BeckmanIsocratic泵)，C8反相柱(Beckman)，紫外檢測器(Shimadzu SPDA),232nm。
D．CAM研究將受精的家雞的胚胎在脫殼培養前孵育4天。在保溫的第6天，將每份1mg含有0.5％紫杉酚的微球或對照微球(無紫杉酚)直接置於CAM表面。在接觸2天後，用接有攝像機的立體顯微鏡觀察其血管系統，圖像信號顯示在計算機上，並列印圖像。
E．掃描電子顯微鏡(SEM)將微球置於樣品架上，在其表面噴金，在15kV條件下，用Philips501B SEM觀察所得的微球。
F．結果微球樣品的體積範圍在30-100um，雖然在含紫杉酚的微球和對照微球所有批次的產物中，一些微球的體積落在此範圍之外。對於所有載藥實驗，有紫杉酚的PCL微球的荷載能力總大於95％。掃描電鏡證明微球均為球形，許多顯示粗糙或凹陷的表面，沒有跡象顯示固體藥物在微球的表面。
紫杉酚從載藥量為1％、2％、5％的PCL微球中釋放的時間過程曲線示於圖11F。釋放曲線為兩階段的。所有藥物負載量均有紫杉酚的初始快速釋放或「爆發」價段。在紫杉酚含量為1％和2％時，「爆發」階段發生在1-2天，對於含藥量為5％的微球，「爆發」階段發生在第3-4天。快速釋放的初始階段後隨一顯著變慢的藥物釋放階段，對於含有1％或2％紫杉酚的微球，在21天後便不再進一步釋放藥物。在紫杉酚含量為5％時，在21天後，微球釋放了約20％總藥量。
圖11B顯示用對照PCL微球處理的CAMs，圖11C顯示用含有5％紫杉酚的微球處理的CAMs。每個樣品一式三份分別進行實驗以研究釋放速率。用對照PCL微球處理的CAM顯示正常的毛細管網狀結構。用紫杉酚-PCL微球處理的CAM顯示顯著的血管退化和毛細血管網缺損區。
G．討論製備含紫杉酚微球的溶劑蒸發法產生很高的紫杉酚包封效率，介於95-100％之間。這是由於紫杉酚的低水溶性和其疏水性適於在含有聚合物的有機溶劑相中被分隔。
紫杉酚的兩階段釋放曲線為許多藥物從能生物降解的聚合物基質中釋放的典型釋放方式。聚(ε-己內酯)為脂族聚酯，可以在生理條件下被水解降解，並且是無毒和組織相容性的。PCL的降解顯著慢於已被廣泛研究的乳酸和乙醇酸的聚合物和共聚物，因此適於設計長效小管周圍藥物釋放系統。紫杉酚釋放的初始快速或爆發段被認為是由於藥物從微球表層區域(接近微球表面)的擴散釋放。紫杉酚在釋放曲線第二階段(慢)的釋放不象是由於PCL的降解或浸蝕，因為研究顯示在體外條件下，在7.5周的期間內，在水中PCL沒有顯著的重量降低和表面浸蝕。紫杉酚釋放的慢段可能是由於藥物在聚合物基質中充滿流動相的孔中的溶解作用以及在孔中的擴散。高紫杉酚負載量具有更大的釋放速率，可能由於在聚合物基質中具有更廣泛的網孔結構。
具有5％負載量的紫杉酚微球，在將其置於CAM上時，已顯示釋放足夠的藥物產生廣泛的血管生成抑制作用。血管生長的抑制作用導致一無血管區，如圖11C所示。
實施例7由EVA和表面活性劑組成的加載治療劑的小管周圍聚合物膜在該實施例中研究了兩類膜含有紫杉酚的純EVA膜和含有紫杉酚的EVA/表面活性劑混合膜。
試驗所用的表面活性劑為兩種疏水性表面活性劑(Span80和多聚醇L 101)和一種親水性表面活性劑(多聚醇F127)。多聚醇表面活性劑自身為聚合物，由於它們能與EVA混合以使藥物釋放性能達到最優化，因此這是一個具有吸引力的性能。Span 80是一小分子，以某些方式分散在聚合物基質中，而不形成混合物。
表面活性劑用於調整紫杉酚從膜中的釋放速率，並使膜的物理參數達到最優化。混合有表面活性劑的膜表明可以控制藥物釋放速率，這能夠改變化合物在水中溶脹的速率和程度。水擴散進入聚合物-藥物基質是藥物從載體釋放的限速步驟。圖12C和12D顯示了當改變混合物中表面活性劑的用量時膜的溶脹程度。純EVA膜在兩個月內不發生任何程度的顯著溶脹。然而通過提高加入EVA中的表面活性劑的水平，可能會增加化合物的溶脹程度，並通過增加親水性，也能增加溶脹。
這些膜的實驗結果示於圖12A-E。簡要地說，圖12A顯示了紫杉酚在一段時間內從純EVA膜中的釋放(以mg計)。圖12B顯示了同一膜中藥物的剩餘百分率。從此二圖可以看出，當紫杉酚負載量增加時(如紫杉酚的重量百分數增加)，藥物釋放速率增加，顯示預期的濃度依賴性。當增加紫杉酚負載置時，剩餘在膜中的紫杉酚百分率也增加，顯示高載藥量對於長期釋放配方可能是有吸引力的。
在圖12E中評價了膜的物理強度和彈性。概括地說，圖12E顯示了純EVA和EVA-表面活性劑混合膜的應力/應變曲線。此應力測量曲線證明膜的彈性隨多聚醇F127的加入而增加，抗拉強度(斷裂時的應力)隨多聚醇F127的加入以濃度相關方式增加。在設計膜時，可以根據特定的周圍小管臨床應用調節，而不導致化合物的永久變形，彈性和強度是重要的考慮因素。
以上資料論證了某些表面活性添加劑控制藥物釋放速率和改變載體的物理特性的能力。
實施例8在聚(E-己內酯)中加入甲氧基聚乙二醇350(MePEG)製成從糊劑中控制釋放治療劑的劑型用於此實驗中的試劑和儀器包括甲氧基聚乙二醇350(「MePEG」-Union Carbide,Danbury,CT).MePEG在室溫為液體，冰點為10℃至-5℃。
A．製備含有紫杉酚的MePEG/PCL糊劑先將一定量紫杉酚溶解在MePEG中，將其加入熔融的PLC中，製備MePEG/PCL糊劑。此方法的優點是不需要DCM。
B．熔點分析可以用差示掃描熱量測定法測定PCL/MePEG聚合物混合物的熔點，從30℃至70℃，升溫速率為2.5℃/分鐘。實驗結果示於圖13A和13B。概括地說，如圖13A所示，聚合物的混合物熔點(熱分析法測得的)隨MePEG以濃度相關方式降低。聚合物的混合物的熔點作為MePEG濃度的函數示於圖13A。此低熔點意味著聚合物的混合物從熔融至固化所需的時間增加，如圖13B所示。-30:70 MePEG:PCL混合物從熔融的液態至固化，所需時間為單獨的PCL固化時間的兩倍還多。
C．脆性測定MePEG加入PCL中，與單獨的PCL相比產生一低脆性固體。一「粗放」的定量測定脆性的方法是，使一稱定重量的針從等高處墜入聚合物的混合物中，MePEG在PCL中的含量為0％至30％，測定針扎入固體中的距離。結果曲線示於圖13C。每個數據點為4次測定結果的平均值+/-1S.D。
為進行比較，也測定了一石蠟樣品，針扎入其中的距離為7.25mm+/-0.3mm。
D．紫杉酚釋放的測定將聚合物丸劑(PCL中含有0％、5％、10％、20％MePEG)在37℃磷酸鹽緩衝鹽水(PBS pH7.4)中保溫，並在此過程中測定聚合物的重量變化百分率。如從圖13D可見的，重量的損失隨MePEG在混合物中的初始含量而增加。重量損失可能是由於MePEG從聚合物基質中釋放進入保溫液。這顯示紫杉酚易於從MePEG/PCL混合物中釋放，因為紫杉酚先溶於MePEG，然後混入PCL中。
E．改變MePEG重量對紫杉酚釋放的影響在PCL中含有0.8％至20％MePEG製備熱糊劑。其中紫杉酚的負載量為1％。用HPLC法測定在37℃PBS緩衝液中紫杉酚從10mg丸劑中的釋放。如圖13E所示，配方中MePEG的含量不影響紫杉酚釋放的量。
F．改變紫杉酚重量對紫杉酚從20％MePEG/PCL混合物中釋放總量的影響用含有20％MePEG的PCL製備熱糊劑，其中紫杉酚加載量為0.2％-10％。如上測定紫杉酚隨時間的釋放。如圖13F所示，紫杉酚的釋放量隨紫杉酚加載量的增加而增加。然而當按紫杉酚總釋放百分量繪製曲線時，圖的順序是反的(圖13G)。此圖給出了存在於糊劑中的紫杉酚的剩餘量的信息，並便於推測紫杉酚可以從20％MePEG熱糊劑中釋放的時間周期。
G．不同比例的MePEG/PCL混合物的強度分析用CT-40機械強度測定儀測定直徑為0.88cm，平均厚度為0.560cm的固體聚合物片劑的強度。聚合物片劑為在PCL中含有0％、5％、10％、20％MePEG的混合物。
此實驗的結果示於圖13H，其中將抗拉強度和破裂時間作為混合物中MePEG百分含量的函數作出曲線。可單獨變化的ANOVA顯示每組中的片厚相同。如圖13H所示，在PCL中加入MePEG會降低所得固體的硬度。
H．γ-輻射對紫杉酚釋放的影響以γ射線照射基質為PCL∶MePEG(80∶20)，加載20％紫杉酚的糊劑，並分析紫杉酚隨時間的釋放。結果示於圖30。
概括地，基於以上實驗，可以得出結論，加入MePEG使聚合物脆性降低而更象蠟，降低其熔點並增加聚合物的固化時間。所有這些因素均會促進糊劑的適用性。低濃度MePEG(20％)對於紫杉酚從PCL中的釋放沒有影響。γ-輻射顯示對紫杉酚釋放幾乎沒有影響。
實施例9使用低分子量聚(D,L-乳酸)改變治療劑從熱糊劑中的釋放如上所討論的，根據所需的療效，可以確定快速釋放或慢速釋放聚合物載體。例如，PCL和PCL與PEG的混合物產生在幾個月內釋放紫杉酚的組合物。尤其，由於紫杉酚具有大的分子體積和極大的疏水性，其在聚合物中的擴散很慢。
另一方面，低分子量聚(D,L-乳酸)(PDLLA)會快速降解，根據其初始分子量降解時間從1天至幾個月。在這種情況下，聚合物的降解決定紫杉酚的釋放。低分子量PDLLA的另一特點是其低熔融溫度(如40℃-60℃)，使其成為適於製備熱糊劑的材料。如下進一步詳細記載的，可以使用一些不同的方法控制聚合物降解速率，例如包括改變PDLLA的分子量，和/或將其與高分子量PCL、PDLLA，或聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)混合。
A．實驗材料D,L-乳酸購自Sigma化學公司，St.Louis,MO.PCL(分子量10-20,000)來自Polysciences,Warrington,PA.，高分子量PDLLA(自身粘度為0.60dl/g)和PLGA(組成為50∶50，粘度為0.58dl/g)來自Birmingham聚合物。
B．低分子量PDLLA的合成從D,L-乳酸經縮聚合成低分子量PDLLA。概括地說，在200℃將D,L-乳酸在玻璃燒杯中加熱預定時間，伴以氮氣驅氣和磁力攪拌。在聚合過程中，由於分子量的增加導致粘度增加。得到具有不同聚合時間，即40分鐘(分子量800)、120分鐘、160分鐘的3批產物。
C．紫杉酚熱糊劑的配方在約60℃用手動將20％紫杉酚混入以下材料中。
1．低分子量PDLLA，聚合時間40分鐘。
2．低分子量PDLLA，聚合時間120分鐘。
3．低分子量PDLLA，聚合時間160分鐘。
4.50∶50高分子量PDLLA與低分子量PDLLA的混合物，聚合時間40分鐘。
5.50∶50高分子量PLGA與低分子量PDLLA的混合物，聚合時間40分鐘。
6．高分子量PCL與低分子量PDLLA的混合物，聚合時間40分鐘，PCL∶PDLLA為10∶90,20∶80,40∶60,60∶40,80∶20。
將這些材料溶於丙酮後乾燥，得到高分子量PDLLA或PLGA與低分子量PDLLA的混合物。
D．釋放研究如上所述，用HPLC法測定不同時間於37℃紫杉酚釋放進入PBS白蛋白緩衝液的程度。
E．結果低分子量PDLLA 40分鐘為淡黃色的柔軟材料。其顏色可能由於縮聚過程中的氧化引起。低分子量PDLLA120分鐘(黃色)和160分鐘(棕色)在室溫為脆性固體。它們在60℃開始熔化。50∶50高分子量PDLLA或PLGA與低分子量PDLLA 40分鐘的混合物也在約60℃熔化。
在釋放過程中，低分子量PDLLA 40分鐘和120分鐘在一天內斷裂成碎片，其它材料在此記錄期間內(3天)無損壞。
紫杉酚從配方2-5中的釋放示於圖14。低分子量PDLLA 40分鐘和120分鐘由於糊劑的斷裂而產生最快的釋放。此釋放可能受限於溶解度。低分子量PDLLA160分鐘也產生快速釋放，但保持一無損的小丸。如，所含的紫杉酚1天釋放10％。高分子量PDLLA或PLGA與低分子量PDLLA40分鐘的50∶50的混合物，釋放速率較慢，如在1天內釋放3.4％和2.2％。
雖然上文未特別列出，可以製備多種其它聚合載體，包括，例如(1)低分子量(500-10,000)聚(D,L-乳酸)，聚(L-乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(6-羥基己酸)，聚(5-羥基戊酸)，聚(4-羥基丁酸)和其共聚物；(2)上述(#1)的混合物；(3)上述(#1)與高分子量聚(D,L-乳酸)，聚(L-乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(6-羥基己酸)，聚(5-羥基戊酸)，聚(4-羥基丁酸)及其共聚物的混合物；和(4)聚乙二醇和聚多醇與聚(D,L-乳酸)，聚(L-乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(6-羥基己酸)，聚(5-羥基戊酸)，聚(4-羥基丁酸)的共聚物，及其共聚物。
實施例10
製備含有水溶性添加劑和紫杉酚的聚合組合物A．製備聚合組合物製備紫杉酚/添加劑的共沉澱微粒，隨後加入PCL中以形成糊劑。概括地說，將紫杉酚(100mg)溶於0.5ml乙醇(95％)，並與預先溶解或分散於1.0ml蒸餾水中的添加劑(100mg)混合。研磨此混合物直至形成均勻的糊劑。將糊劑鋪在培養皿中，並在37℃空氣乾燥過夜。用乳缽和研杵將乾燥的塊狀物粉碎，過#140篩(106μm)(Endecotts Test Sieves Ltd，英國，倫敦)。在65℃將微粒(40％)混入熔融的PCL中(60％)，對應於20％的紫杉酚加載量。本研究中的添加劑為明膠(Type B,100 bloom,Fisher Scientific)，甲基纖維素(British Drug House)，葡聚糖，T500(Pharmacia,Sweden)，白蛋白(Fisher Scientific)，氯化鈉(Fisher Scientific)。如上製備含紫杉酚和明膠或白蛋白的微球，但過#60篩(270μm)(EndecottsTest Sieves Ltd，英國，倫敦)以測定微球體積對紫杉酚從糊劑中釋放的影響。還製備了在PCL中含10、20或30％明膠和20％紫杉酚的糊劑以研究添加劑的比例對藥物釋放的影響。除非另有說明，製備在PCL中含有20％紫杉酚的糊劑作為研究藥物釋放速率的對照物。
B．藥物釋放研究將大約2.5mg由加載紫杉酚的糊劑製備的丸懸浮在50mlpH7.4的10mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，置於具螺旋帽的試管中。將試管在37℃上下翻轉，在給定的時間，從中移取49.5ml上層液，過濾通過0.45μm膜的濾器，留作紫杉酚的分析。在每個試管中代替以等體積的PBS液，以在實驗過程中保持沉浸狀態。為進行分析，用3×1ml二氯甲烷(DCM)提取濾液，將DCM提取物在氮氣流下蒸發至於，重新溶解在1ml乙腈中。以HPLC法分析，流動相為水∶甲醇∶乙腈(37∶5∶58)，流速1ml/min(Beckman isocratic泵)，C18反相柱(Beckman),UV檢測器(Shimaolzu SPDA)在232nm測定。
C．溶脹研究用具有#140(或明膠用#60)篩孔大小的紫杉酚-添加劑微粒製備紫杉酚/添加劑/PCL糊劑，將其擠出形成圓柱，切割成片，稱重，用千分尺(Mitutoyo Digimatic)測量每片的長度和直徑。將此片懸浮在37℃蒸餾水中(10ml)，在預定時間除去水，測定圓柱片的直徑和長度，及樣品重量。用掃描電子顯微鏡(SEM)(Hitachi F-2300)觀察樣品形態(懸浮在水中前、後)．用Hummer裝置(Technics,USA)將樣品表面鍍以60％金和40％鈀(厚度10-15nm)。
D．雞胚絨毛尿膜(CAM)實驗將受精的家雞的胚胎在脫殼培養前孵育4天。卵的內含物在90％相對溼度和3％CO2的條件下保溫，在保溫的第6天，將每份1mg含有6％紫杉酚、24％明膠和70％PCL的糊劑或對照糊劑(PCL中含30％明膠)的樣品直接置於CAM表面。接觸2天後，用接有攝像機的立體顯微鏡觀察其血管系統，圖像信號顯示在計算機上，並列印出來。
E．體內抗腫瘤活性如上製備含有20％紫杉酚、20％明膠和60％PCL的糊劑(用體積為140篩孔大小的紫杉酚-明膠微粒)，將其注入8×1ml注射器(BD胰島素注射器，1/2cc)，每個注射器含有150mg糊劑(相當於30mg紫杉酚)。10周大的DBA/2j雌性小鼠(16)，體重18-20克，使之到達後適應環境4天，於第1天在每隻鼠的後側脅腹部注射MDAY-D2腫瘤細胞，劑量為在100μl磷酸鹽緩衝鹽水中含有(10×106ml-1)個細胞。在第6天，將鼠分為兩組，每組8隻，在麻醉下打開腫瘤部位，將預先加熱到60℃的150mg糊劑擠壓在腫瘤部位，關閉傷口。一組植入含有紫杉酚的糊劑，另一組植入只含有明膠和PCL的對照糊劑。在第16天，將鼠處死，測量鼠的重量和切除的腫瘤的重量。
F．結果和討論紫杉酚和明膠或白蛋白共沉澱的微球硬而脆，較易被混入PCL，而其它添加劑產生柔軟微粒，在製備糊劑的過程中有碎裂趨勢。
圖15顯示紫杉酚從含有20％紫杉酚的PCL糊劑或20％紫杉酚、20％添加劑和60％PCL的糊劑中釋放的時間過程。紫杉酚從含有或不含添加劑的PCL糊劑中釋放的方式為兩階段釋放；開始，為較快的藥物釋放速率，隨之以一較慢的藥物釋放。紫杉酚從糊劑中快速釋放的初始階段被認為是由於位於表面的紫杉酚的溶解或紫杉酚從糊劑表層區域中擴散所致。隨後的紫杉酚釋放曲線的慢速釋放階段可歸因於藥物顆粒與溶劑接觸的有效表面積的降低，溶劑緩慢浸入聚合物基質中，或藥物通過聚合物基質的中等擴散通道的增加。
在有親水性添加劑和明膠、白蛋白、甲基纖維素等能導致藥物釋放速率最大地增加的物質存在時，紫杉酚從PCL中釋放的曲線的兩階段增加(圖15)。在應用較大的紫杉酚-添加劑顆粒(270μm)製備糊劑時，與使用較小的紫杉酚-添加劑顆粒(106μm)相比，導致紫杉酚從聚合物基質中釋放的速率進一步增加(圖16)。增加添加劑(如明膠)的量相應增加藥物釋放(圖16)。圖17A顯示了含有20％紫杉酚、20％添加劑和60％PCL的糊劑的溶脹性能。溶脹速率有如下順序明膠＞白蛋白＞甲基纖維素＞葡聚糖＞氯化鈉。另外，當在糊劑中加入更高比例的水溶性聚合物時，溶脹速率增加(圖17B)。含有明膠或白蛋白的糊劑在開始的8-10小時內快速溶脹。當樣品體積變化超過40％時，隨之溶脹速率降低。用更大的紫杉酚-明膠顆粒(270μm)製備的糊劑比用較小的(106μm)紫杉酚-明膠顆粒製備的糊劑具有更快的溶脹速率。當體積的增加超過50％時，所有糊劑崩解。SEM研究顯示糊劑的溶脹伴隨基質的裂解(圖18)。隨著溶脹，在高放大倍數下(圖18C和圖18D)，可見在糊劑表面有針狀或棒狀紫杉酚結晶，並與糊劑中的明膠密切相關(圖18C和18D)。
能滲透或溶脹的親水性藥物作為分散的顆粒包埋在疏水性聚合物中，通過基質浸蝕、藥物在聚合物基質中擴散，和/或通過基質中水溶性添加劑的溶解導致基質中通過孔的擴散和/或對流增加等綜合效應，導致藥物釋放。分散在疏水性聚合物中的能滲透的藥物和能溶脹的聚合物將吸水(相當於芯吸劑)，溶解或溶脹，並產生充盈壓力，致使相鄰顆粒之間的隔膜(聚合物層)破裂，產生微管，因而利於藥物分子藉助擴散或對流逃逸進入周圍介質。糊劑基質的溶脹和裂解(圖18)很可能導致形成貫穿基質內部的微管。聚合物溶脹的不同速率和程度可以導致所觀察的紫杉酚釋放的不同速率(圖15、16)。
圖19顯示了用對照明膠-PCL糊劑(圖19A)和20％紫杉酚-明膠-PCL糊劑(圖19B)處理的CAM。在圖中用箭頭表示糊劑在CAMs表面的位置。用對照糊劑處理的CAM顯示正常的毛細血管網狀結構。用紫杉酚-PCL糊劑處理的CAMs均顯示血管退化和無毛細血管網的區域。在糊劑中加入添加劑顯著地增加無血管區域的直徑(圖19)。
體內研究結果示於圖20。概括地說，對於建立了可觸知的腫瘤的小鼠，在腫瘤周圍注入紫杉酚-明膠-PCL糊劑，此製劑導致腫瘤塊比對照組平均縮小63％。另外，對於處理後小鼠的體重沒有顯著的影響。紫杉酚-PCL糊劑(無添加劑)不導致腫瘤塊的顯著縮小。
此項研究顯示，可以通過在PCL基質中加入紫杉酚/親水性聚合物顆粒，增加紫杉酚從PCL中的體外釋放。評價製劑在治療小鼠皮下腫瘤的效應的體內研究也顯示紫杉酚/明膠/PCL糊劑顯著縮小腫瘤塊。水溶性藥物的類型、微粒體積和添加劑比例等因素影響藥物的釋放特性。
在小管周圍注射化療糊劑，使之進入被惡性增生阻塞的管的外膜，可以降低局部腫瘤生長，並能減輕阻塞的症狀，而不需要侵入性的手術過程。
實施例11改進紫杉酚從PDLLA-PEG-PDLLA和低分子量聚(D,L，乳酸)製備的熱糊劑中的釋放A．製備PDLLA-PEG-PDLLA和低分子量PDLLADL-丙交酯購自Aldrich。分子量為8,000的聚乙二醇(PEG)、錫辛酸鹽和DL-乳酸為從Sigma得到的。分子量為20,000的聚-ε-己內酯(PCL)得自Birmingham Polymers(Birmingham,AL)。紫杉酚購自Hauser Chemicals(Boulder,Co)。具有窄分子量分布的聚苯乙烯標準品購自Polysciences(warrington,PA)。乙腈和二氯甲烷為高效液相純度級別(Fisher Scientific)。
通過開環聚合合成三嵌段共聚物PDLLA-PEA-PDLLA。DL-丙交酯和PEG單體以不同比例混合，加入0.5wt％錫辛酸鹽。聚合反應在150℃進行3.5小時。通過DL-乳酸的縮聚合成低分子量PDLLA。反應在玻璃燒瓶中進行，伴以柔和的氮氣驅氣，機械攪拌，並在180℃加熱1.5小時。通過滴定末端羧基測定PDLLA分子量約為800。
B．製備糊劑將20％或30％紫杉酚充分混入PDLLA-PEG-PDLLA共聚物或在60℃融熔的PDLLA∶PCL 90∶10,80∶20,70∶30混合物中。將含有紫杉酚的糊劑稱重加入注射器中，保存在4℃。
C．PDLLA-PEG-PDLLA和糊劑混合物的特性在室溫下，用GPC測定PDLLA-PEA-PDLLA共聚物的分子量及分布，此GPC使用Shimadzu LC-10AD HPLC泵和與-104HewlettPackard Plgel柱連接的Shimadzu RID-6A折射率測定儀。流動相為氯仿，流速1ml/min。樣品注入體積為20μl，聚合物濃度為0.2％(w/v)。以聚苯乙烯標準品為基準測定聚合物分子量。用Connon-Fenske粘度計測量25℃時PDLLA-PEG-PDLLA在氯仿中的固有粘度。
使用TA Instruments 2000控制器和DuPont 910SDSC(Newcastle,Delaware)，通過差示掃描量熱法(DSC)進行共聚物的熱分析。升溫速率為10℃/min,將共聚物和紫杉酚/共聚物基質樣品(3-5mg)稱重加入具有彎曲開口(crimped open)的鋁製樣品槽中。
用1H核磁共振(NMR)測定聚合物的化學組成。用NMR儀(Bruker,AC-200E)在200MHz測得含有紫彬酚的PDLLA-PEG-PDLLA在CDCL3中的1H NMR譜。聚合物濃度為1-2％。
用掃描電子顯微鏡(SEM)(Hitachi F-2300)觀測紫杉酚/PDLLA-PEG-PDLLA糊劑的形態特徵。樣品用Hummer儀(Technics USA)將表面鍍以60％金和40％鈀的膜(厚度10-15nm)。
D．紫杉酚體外釋放將加載20％紫杉酚的PDLLA∶PCL糊劑的小丸(約2mg)或加載20％紫杉酚的PDLLA-PEG-PDLLA糊劑的圓柱(將融熔的糊劑擠壓通過一無針頭的注射器製得)置於具塞的盛有10ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，PH7.4)與0.4g/L白蛋白的14ml的玻璃試管內。試管在37℃保溫，並旋轉混合。定期取上清液進行紫杉酚分析，並補充以新鮮的PBS/白蛋白緩衝液。用1ml二氯甲烷提取上清液(10ml)。傾去水相，在60℃的氮氣流下將二氯甲烷吹乾。乾燥的殘餘物中加入40∶60水乙腈混合物，在10,000g離心1分鐘。用HPLC法分析上清液中紫杉酚的量。用110A泵和C-8特種球柱(Beckman)，及232nm的SPD-6A紫外檢測器，SIL-9A自動進樣器和C-R3A積分儀(Shimadzu)進行HPLC分析。進樣體積為20μl，流速為1ml/min。流動相為58％乙腈5％甲醇37％蒸餾水。
E．體內動物實驗10周大的DBA/2j雌性小鼠在到達後使之適應環境3-4天。第1天在每隻鼠的脅腹部後外側皮下注射100μl PBS，內有10×105MDAY-D2腫瘤細胞。在第6天，將鼠隨機分成2組。組1植入空白糊劑(對照)，組2植入含有紫杉酚的糊劑。在麻醉狀態下通過手術在靠近腫瘤處形成皮下囊，在此囊中置入約100mg熔融糊劑(加熱到50℃-60℃)，將傷口閉合。在第16天，將小鼠處死，切取腫瘤並稱重。選擇16天使腫瘤生長到在規格限度內易於測量的體積。
F．結果和討論用GPC法測定PDLLA-PEG-PDLLA相對於聚苯乙烯標準品的分子量及其分子量分布(圖21)。用Canon-Fensre粘度計測定共聚物在25℃氯仿中的固有粘度。隨著PEG含量的增加，分子量和固有粘度降低。含有10％-40％PEG的PDLLA-PEG-PDLLA的多分散性為2.4-3.5。然而，有70％PEG的共聚物具有多分散性值為1.21的窄分子量分布。這可能由於高PEG含量降低了副反應，如可導致聚合物寬分子量分布的轉酯(基)作用發生的機率。另外，具有疏水-親水單元的共聚物的捲曲結構可以導致人為的低多分散性值。
純PEG和PDLLA-PEG-PDLLA共聚物的DSC掃描為圖21和22。PEG和PEG含量為70％和40％的PDLLA-PEG-PDLLA，當共聚物中PEG含量降低時，顯示具有降低的焓和溫度的吸熱峰。含有40％和70％PEG的共聚物的吸熱峰，可能由於PEG區域的融熔，導致發生相分離而產生。純PEG具有一尖的融熔峰，而含有70％和40％PEG的共聚物顯示寬的融熔峰，並在PEG含量為70％時具有一明顯的肩峰。寬的熔融峰可能由於PDLLA幹擾PEG結晶化而致。70％PEG的肩峰可能反映PDLLA部位的玻璃化。具有PEG含量為10％、20％、30％的共聚物在10-250℃溫度範圍內不發生熱變化，提示不發生顯著的結晶(可能是相分離)。
無紫杉酚或含20％紫杉酚的PDLLA∶PCL(70∶30,80∶20，90∶10)混合物的DSC溫度自記曲線在約60℃顯示一吸熱峰，由PCL熔化引起。因為PDLLA的無定形性及其低分子量(800)，未觀察到PDLLA的熔化和玻璃化，未觀察到由於紫杉酚的重結晶或熔化產生的熱變化。
由於以下原因選擇含有20％和30％PEG的PDLLA-PEG-PDLLA共聚物作為組成糊劑的最佳材料。在約60℃含有10％PEG的PDLLA-PEG-PDLLA不能熔化。含有40％和70％PEG的共聚物在60℃已熔化，含有20％和30％PEG的共聚物在50℃-60℃變成粘性液體。含有40％和70％PEG的共聚物在水中溶脹很高導致糊劑在水中的快速分散。
紫杉酚從PDLLA-PEG-PDLLA圓柱體中的體外釋放曲線示於圖23。測定從40％PEG圓柱體中釋放的實驗，由於圓柱體具有很高的溶脹度因而是吸水的(一天內約吸水200％)，並在幾天內崩裂。從30％PEG圓柱體中釋放的紫杉酚在70天內逐漸增加。從20％PEG圓柱體中釋放的紫杉酚緩慢增加到第30天後，突然增加，繼之另一逐漸增加的階段。每個單獨的圓柱體(20％PEG含量)之間存在的顯著的不同顯示了紫杉酚釋放中的突然的變化。在突然的增加之前，對於具有同樣圓柱體直徑的(1mm)，具有較低PEG含量的共聚物，紫杉酚釋放的部分是較低的。40％和30％PEG圓柱體比20％圓柱體顯示非常高的紫杉酚釋放速率。如,30％PEG的圓柱體在30天內釋放17％紫杉酚，而從20％PEG圓柱體中僅釋放2％。具有較小直徑的圓柱體導致更快的釋放速率，如在30天內，0.65mm和1mm直徑的30％PEG圓柱體分別釋放26％和17％紫杉酚(圖23)。
可以用紫杉酚從圓柱體中的釋放機制解釋以上觀察結果。光學顯微鏡觀察到紫杉酚作為結晶分散於聚合物中。熱鏡臺顯微鏡觀察到結晶在170℃開始溶解在共聚物基質中，在180℃完全溶解。加載20％紫杉酚的PDLLA-PEG-PDAAL(30％PEG)糊劑的DSC溫度自記曲線顯示紫杉酚的一小的重結晶放熱(16J/g,190℃)和一熔融吸熱(16J/g,212℃)(圖21)，顯示紫杉酚在180℃後熔融的共聚物中重結晶。在此類型的藥物/聚合物基質中，紫杉酚能通過擴散和/或聚合物浸蝕而釋放。
在這種控制擴散的情況下，藥物能通過分子在聚合物內部擴散和/或通過聯接藥物粒子形成的開放的通道擴散，而被釋放。因此在負載量為20％時，脫離出一些紫杉酚顆粒，紫杉酚可以通過在共聚物中溶解而後擴散得到釋放。其它紫杉酚顆粒可以與表面相聯形成簇狀排列，通過通道擴散而被釋放。在這兩種情況下，較小的圓柱體由於較短的擴散路徑而產生較快的藥物釋放(圖23)。
在釋放過程中記錄圓柱體大小變化和吸水(圖24)。30％PEG圓柱體的長度、直徑、溼重在2天內快速增加到最大值，隨後15天保持不變，然後逐漸降低。圓柱體的初始直徑不影響其溶脹行為。對於20％PEG圓柱體，在1天內長度降低10％，並達到平衡，而在此期間內直徑和吸水性逐步增加。因為在共聚物中有更多的PEG吸收更多的水促使紫杉酚的擴散，可以觀察到更快的釋放(圖23)。
通過GPC檢測PDLLA-PEG-PDLLA糊劑共聚物分子量降解。對於20％PEG圓柱體，在峰的位置的洗脫體積隨時間增加，顯示在釋放實驗的過程中分子量降低(圖25)。在第69天觀察到一兩階段分子量分布。對於30％PEG圓柱體(1mm和0.65mm)，聚合物分子量也降低。然而沒有觀察到兩階段分布。
NMR譜顯示在3.6ppm有一PEG峰，在1.65ppm和5.1ppm有PDLLA峰。在共聚物中PEG相對於PDLLA的峰面積在69天後顯著降低(圖26)，表明PEG在其與PDLLA分離後溶解。還記錄了圓柱體的乾燥失重(圖26)，並顯示降解速率按以下順序降低30％PEG-0.65mm＞30％PEG-1mm＞20％PEG-1mm。
用SEM觀察了紫杉酚釋放前後乾燥圓柱體的形態學變化(圖27)。概括地說，在釋放之前能觀察到固體紫杉酚結晶和非多孔性聚合物基質(圖27A和27B)。在釋放69天以後，已觀察不到紫杉酚結晶，並且基質含有許多由於聚合物降解和吸水產生的孔(圖27C和27D)。
在置於水中僅僅2天後,30％PEG圓柱體顯示強烈的溶脹(圖24)，因此對於脫離的水溶性PEG嵌段物和降解的PDLLA(即DL-乳酸低聚物)的擴散的阻礙作用降低。因為失重和30％PEG圓柱體的繼續降解，浸蝕釋放的作用逐漸增加，導致紫杉酚的持續釋放而不引起任何突然的變化(圖23)。對於20％PEG圓柱體，溶脹程度初始較低(圖24)，導致降解產物的緩慢擴散。因為擴散通道短，因此內部的降解產物主要停留在內部而有較少的降解產物在外部區域。因為低聚物的末端羧酸基團催化水解，降解產物加速了降解速率。這導致了兩階段共聚物分子量分布所顯示的一高分子量的殼和一低分子量的內部(圖25,69天)。因為殼的破裂依賴於這些因素，如殼的強度、厚度和其上的庇點，及內部的降解產物，因此內部降解產物開始減少的時間和程度有很大差異。因為殼的破裂是間斷的，聚合物中的藥物在顯微水平上是不均勻的，4個試驗樣品釋放爆發的時間點和爆發的程度不同(圖23)。
圖28顯示了紫杉酚從PDLLA和PCL混和物中，及從純PCL中的釋放。概括地說，釋放部分隨混和物中PDLLA含量的增加而增加。如，在10天內，從80∶20,70∶30和0∶100 PDLLA∶PCL中釋放的紫杉酚分別為17％、11％和6％。在第1天的初始爆發後，從80∶20 PDLLA∶PCL糊劑中的釋放大體上變得穩定。在釋放中不會觀察到顯著的溶脹。對於PDLLA∶PCL混合物，因為PDLLA有很低的約為800的分子量，它快速水解成水溶性產物，而不在失重階段延遲很長時間。PCL作為骨架材料使糊劑不致快速崩解。因此隨著混合物中PDLLA含量的增加，降解增強，導致釋放速率增加。PDLLA持續的的浸蝕控制紫杉酚的釋放並導致一持續釋放。因為PCL的緩慢的降解速率(在1-2年內)，紫杉酚從純PCL中的釋放可能是受擴散控制的。
加載20％紫杉酚的90∶10 PDLLA∶PCL糊劑，因為在24小時內保溫過程中糊劑丸產生崩解，使其釋放研究遇到了困難。概括地說，在保溫的前12小時內，每個小時都要取樣以用以保證紫杉酚釋放所需的滲透條件。在10小時內，從90∶10糊劑中釋放的紫杉酚為25-30％。
測定了糊劑抑制小鼠腫瘤生長的效果(圖29)。概括地說，測定的糊劑為PCL±20％紫杉酚,80∶20 PDLLA∶PCL±20％紫杉酚，90∶10PDLLA∶PCL±20％紫杉酚,PDLLA-PEG-PDLLA(30％PEG)±20％紫杉酚。組成為90∶10 PDLLA∶PCL和PDLLA-PEG-PDLLA的含有紫杉酚的糊劑，在體內對腫瘤生長的抑制率分別為54％和40％。而組成為PCL和80∶20PDLLA∶PCL的含有紫杉酚的糊劑，對於腫瘤生長沒有或只有很小的作用。所有對照糊劑(無藥物)對於腫瘤生長沒有顯著作用。具有紫杉酚快速釋放速率的糊劑(90∶10 PDLLA∶PCL和PDLLA-PEG-PDLLA)對於降低腫瘤生長也很有效，這提示需要在腫瘤部位具有足夠的紫杉酚局部濃度以抑制腫瘤生長。釋放紫杉酚緩慢的糊劑，如PCL和80∶20 PDLLA∶PCL無效。所有測定的糊劑對於小鼠體重沒有顯著影響，提示含有紫杉酚的糊劑在體內是可以被接受的。
這些數據提示，紫杉酚在腫瘤部位的局部用藥，對於抑制局部腫瘤生長是有效而不增加全身毒性的治療方法。含有紫杉酚的製劑不能完全抑制腫瘤生長，可能是由於紫杉酚從聚合物中的釋放沒有達到充足的量，和MDAY-D2腫瘤的快速生長。含有30％紫杉酚的90∶10 PDLLA∶PCL糊劑，比含有20％紫杉酚的90∶10 PDLLA∶PCL糊劑，能釋放更多的紫杉酚，因而能更有效地抑制腫瘤生長，這一現象符合以上認識。因此，調整由聚合物和化療劑的性質及用藥部位控制的紫杉酚的釋放速率，在抑制腫瘤生長的局部治療方法的發展中是一重要步驟。
實施例12製備PCL微球擴大規模研究用PCL(標示分子量80,000)按如下所述的溶劑蒸發法製備微球(50g)。
A．方法將500ml10％PCL的二氯甲烷液和4000ml1％PVA(分子量13,000-23,000,99％水解)溶液，用Homo混合器乳化10小時，控制混合器的變阻器參數設定在40。混合物用#140篩過濾直到微球沉降在底部，然後將上清液輕輕倒出。用蒸餾水洗滌產品三次(使用沉澱後傾倒的方法)，再懸浮於250ml蒸餾水中，並過濾。微球在37℃過夜，空氣乾燥。
B．結果微球產率如下PCL的初始重量50.1g所得微球重量41.2g％產率 (43.2/50.0)×100=86.4產率(10-50μm)約為72％，平均體積21.4μm，中間值22.0μm,眾數值24.7μm。
可以通過過篩或用沉降法分離得到狹窄的體積分布範圍(20-40μm)。
實施例13製備PLGA微球從(PLLA)乳酸-乙醇酸(GA)共聚物製備微球。
A．方法用標準方法(將聚合物溶解在二氯甲烷中，並按製備PCL或PDLLA微球的方法，將其在PVA溶液中攪拌乳化)，製備體積範圍為0.5-10μm,10-20μm和30-100μm的微球。當使用不同分子量的聚合物時，採用PLLA對GA的不同比例[如Intrinsic Viscosity(I.V.)所述]。
B．結果從以下起始聚合物成功地製得微球PLLA∶GA I.V.
50∶500.7450∶500.7850∶501.0665∶350.5575∶250.5585∶150.56
成功地將10％或20％的紫杉酚加入這些微球。圖31-34顯示了用一種起始聚合物(85∶15Ⅳ=0.56)製得的微球的體積分布的例子。用具有各種體積和各種組成的微球進行紫杉酚釋放試驗。釋放速率示於圖35-38。
實施例14二嵌段共聚物用總體融熔聚合技術合成聚合(DL-丙交酯)-嵌段-甲氧基聚乙二醇(PDLLA-MePEG)，聚合己內酯-嵌段-甲氧基聚乙二醇(PCL-MePEG)，和聚(DL-丙交酯-共-己內酯)-嵌段-甲氧基聚乙二醇(PDLLACL-MePEG)。簡要地說，將給定數量的有不同的分子量的DL-丙交酯、己內酯和甲氧基聚乙二醇單體，加熱(130℃)到融熔，伴以氮氣吹氣和攪拌。將錫辛酸鹽催化劑(0.2％W/W)，加入到融熔的單體中。聚合反應進行四小時。分別用GPC、螢光法和溶出試驗法測定分子重量、臨界膠束濃度，和最大紫杉酚負載量(圖39)。得到紫杉酚的高負載力。紫杉酚的溶出依賴於共聚物的組成和濃度(圖39和40),PDLLA-MePEG可以使紫杉酚最穩定地溶出(圖40-41)。
實施例15尼龍微囊對紫杉酚的包封能力A．製備加載紫杉酚的微囊用界面聚合技術將紫杉酚包進尼龍微囊。簡要地說，將100mg紫杉酚和100mg多聚醇(Pluronic)F-127溶解在1ml二氯甲烷(DCM)中，加入0.4ml(約500mg)己二醯氯(ADC)。用Polytron均化器(設定在1)將此溶液均化15秒，使之成為2％PVA溶液。均化時滴加溶解在5ml蒸餾水中的1,6-己二胺(HMD)溶液。加入HMD溶液後，將此混合物進一步均化10秒。將混合物移入燒杯中，並用磁力攪拌器攪拌三小時。將混合物離心，收集，並再次懸浮在1ml蒸餾水中。
B．包封效率/紫杉酚負載量將約0.5ml懸浮液過濾，並將微球乾燥。將約2.5mg微球稱重，懸浮在10ml乙腈中24小時。測定上層液中的紫杉酚，結果作為紫杉酚的百分含量。初步研究顯示，紫杉酚能以高負載量(60％)被包封在尼龍微囊中，並具有高的包封效率(高於80％)。
C．紫杉酚釋放研究將約2.5mg紫杉酚-尼龍微球懸浮在含有1M氯化鈉和1M脲的50ml水中，並周期地進行分析。紫杉酚從微囊中的釋放是快的，在72小時後釋放藥物的95％以上。(圖42)實施例16紫杉酚聚合膠束PDLLA-MePEG是一有疏水(PDLLA)和親水(MePEG)區域的嵌段共聚物。在適當的分子重量和化學組成時，它們形成具有疏水性PDLLA核和親水性MePEG殼的膠束。紫杉酚可以被包入疏水性核，由此使紫杉酚增溶。
A．PDLLA-MePEG雙嵌段共聚物的合成將甲氧基聚乙二醇(M.W.2000,150g)和DL丙交酯(100g)單體加入圓底燒瓶中，將溫度升高到130-150℃。單體熔化後，加入0.6g錫辛酸鹽催化劑。在氮氣保護和攪拌條件下進行反應，聚合反應在0小時內完成。
B．製備紫杉酚膠束將PDLLA-MePEG共聚物溶解在乙腈或50∶50乙醇∶丙酮(聚合濃度＜40％)中。將聚合物溶液離心(14000rpm)5分鐘，將上清液(廢棄不溶的聚合物)移到玻璃試管中。將紫杉酚溶解在乙腈或50∶50乙醇∶丙酮中，並被加到純化的聚合物溶液中。旋轉混合後，溶液在氮氣流(一般每批量需要40mg紫杉酚2小時)保護下在60℃蒸發。通過抽真空和加熱，除去殘餘的溶劑。將基質加熱到約60℃，直至變成透明的膠體。將一定體積的水(大於基質重量的四倍)加入到基質中。馬上進行旋轉混合，直至紫杉酚/聚合基質溶液化。配方示於表Ⅱ。
表Ⅱ紫杉酚/PDLLA-MePEG*配方


C．製備紫杉酚膠束/熱凝膠聚合物的釋放系統將熱凝膠聚合物如聚(N-異丙基丙烯醯胺)溶解於蒸餾水中。分別將水加到紫杉酚膠束/聚合物基質中，如含有10％紫杉酚的PDLLA/MePEG 2000-40/60，形成紫杉酚膠束溶液。將二溶液冷卻(如4℃)並混合形成熱凝膠釋放系統。
實施例17藥物釋放分析將已知重量的聚合物(一般2.5mg丸)加入盛有含l0mmNa2HPO4-NaH2PO4,0.145m NaCl和0.4g/l牛血清白蛋白的14ml緩衝液的15ml的試管中。蓋上試管並在37℃使其轉動。在一定時間取出全部14ml緩衝溶液，並用新鮮緩衝液代替。
將緩衝液加到1ml二氯甲烷中，搖動1分鐘，將紫杉酚提取到二氯甲烷中。移去水相在氮氣流下將二氯甲烷乾燥。殘餘物溶解在60％乙腈∶40％水中，將溶液注入HPLC系統，實驗條件為C8柱(BeckmanIstruments USA)，流動相58％∶5％∶37％乙腈∶甲醇∶水，流速為1ml/min。
在232nm分析收集的緩衝液中的紫杉酚。對於MTX，收集到的緩衝液直接加到HPLC柱上，不需要經過在二氯甲烷中的提取。在302nm分析MTX。對於含有釩的化合物，在200-300nm直接用UV/VIS光度計分析緩衝液。
實施例18加載紫杉酚的熱糊劑在腫瘤生長和腫瘤血管生成中的體內作用受精的家雞胚胎孵化三天後去掉殼。將氣室處的殼去掉，割開內殼膜，在相對的一端打孔，使卵的內含物從鈍圓的一端緩慢流出，將內含物倒空。將內含物倒入圓底滅菌的玻璃杯中，用培養皿覆蓋，在相對溫度90％和3％二氧化碳條件下孵化。
將MDAY-D2細胞(鼠淋巴腫瘤)注入小鼠中，並使腫瘤生長到重量為0.5-1.0g。將小鼠處死，用乙醇擦拭腫瘤部位，切除，置於無菌組織培養介質中，在層流通風櫃下切成1mm薄片。在將切片的腫塊置於9天大的家雞胚胎上之前，用30號針輕輕刮CAM表面以保證腫瘤的植入。孵育8天後(去殼後孵育4天)將腫瘤塊置於CAM上，使其在CAM上生長4天，建立血管供應。用這種方法製備4個胚胎，每個胚胎接受3個腫塊。對於這些胚胎，一個腫塊接受含有20％紫杉酚的熱糊劑，第二個腫塊用不含藥的熱糊劑，第三個腫塊不進行治療。治療兩天，記錄結果。
植入的MDAY-D2腫瘤分泌的血管生成因子，誘發毛細管(從CAM上衍生)向內生長進入腫瘤塊，使其體積持續增長。因為腫塊的所有血管從CAM上衍生，而所有腫瘤細胞從移植物衍生，可以設想，對於這兩個過程的治療幹擾效應是獨立的。這一測定法已用於測定含有紫杉酚的熱糊劑的效應(a)抑制腫瘤的血管系統，(b)抑制腫瘤細胞自身的生長。
直接體內立體顯微鏡觀察和固定組織的組織學研究證明了以下結論。與對照腫瘤比較(圖70A和70B)，用含有20％紫杉酚的熱糊劑處理的腫瘤，供應腫瘤的血管數量減少(圖70C和70D)，腫瘤內血管數量降低，腫瘤周圍血管數量降低(在固體腫瘤中，此處一般為高血管區域)。在進行研究的兩天內，腫瘤體積和質量開始降低。另外，在細胞分裂中大批內皮細胞被抑制，顯示破壞了內皮細胞的增生。在有絲分裂中，經常看到腫瘤細胞被抑制。所有4個胚胎顯示一致方式，含有20％紫杉酚的熱糊劑抑制腫瘤血管系統，而不含藥的熱糊劑沒有效應。
比較起來，用不含藥的熱糊劑處理的CAM，腫瘤血管生長良好，與周圍正常組織比較血管數量和密度增加，觀察到的血管明顯多於用含紫杉酚的熱糊劑處理的腫瘤。新生成的血管從各個角度進入腫瘤，象輪輻伸向輪的中心(圖70A和70B)。在研究期間對照腫瘤在體積和質量上持續生長。組織學上，可以看到在腫瘤組織邊緣有許多擴張的薄壁的毛細管，在細胞分裂中，幾乎沒有內皮細胞。腫瘤組織始終具有良好的血管生長，並具有活力。
作為一個例子，將兩個相似體積的腫瘤(初始，在移植時)置於同樣的CAM上，獲得隨後的數據。用含有20％紫杉酚的熱糊劑處理的腫瘤，經測定為330mm×597mm,緊鄰腫瘤周圍有14條血管，而腫瘤塊只有3-4條小毛細血管。對於使用不含藥的熱糊劑治療的腫瘤，經測量為623mm×678mm，緊鄰腫瘤邊緣有54條血管，腫瘤塊有12-14條血管。另外，周圍的CAM與紫杉酚處理的腫瘤周圍區域比較含有更多的血管。
此研究證實熱糊劑釋放足夠量的抗增殖劑(在該實施例中為紫杉酚)以抑制伴有腫瘤生長和發育的病理性血管生長。在這些條件下，腫瘤細胞最大程度地刺激血管生長，這些腫瘤細胞產生血管生長因子，能夠引起毛細血管從周圍組織向內生長進入腫瘤塊。含有20％紫杉酚的熱糊劑，能夠阻斷這一過程，並限制腫瘤組織保持足夠量的血液供應的能力。通過藥物對腫瘤細胞自身的細胞毒效應，和剝奪組織生長和擴張必需的營養供應，導致腫瘤大小的降低。
實施例19含有治療劑的熱糊劑在鼠腫瘤模型中對於腫瘤生長的體內效應可以使用鼠MDAY-D2腫瘤模型，測定抗增殖化合物，如紫杉酚局部慢速釋放，對於腫瘤生長、腫瘤轉移和動物存活率的效應。概括地說，使MDAY-D2腫瘤細胞繫於在αmem培養基中的含有5％胎牛血清的細胞懸浮液中生長。在37℃，在用含5％二氧化碳供給的人工大氣條件下孵育細胞，並每三天稀釋到十五分之一，直到得到足夠量的細胞。孵育後用光學顯微鏡檢查細胞的成活力，並在1500rpm離心5分鐘。將PBS加到細胞中，以達到稀釋度為1,000,000細胞/ml。
使10周大的DBA/2j雌性小鼠在到達後適應三至四天。每隻小鼠在脅腹的後側面，皮下注射100ml PBS，內含100,000 MDAY-D2細胞。前面的研究顯示，此過程在3-4天內在注射部位產生可見的腫瘤，在14天體積達到1.0-1.7g，注射19-25天後在肝內產生可見的轉移。根據此研究的目的，可以在疾病發展的任何一點建立治療性的介入。
用以上動物模型，將140,000 MDAY-D2細胞皮下注入20隻小鼠，使腫瘤組織生長。在第5天，將小鼠分為5組。在麻醉下，使用手術將腫瘤部位切開，用含藥的熱糊劑或對照熱糊劑處理局部區域而不幹擾存在的腫瘤細胞，關閉傷口。五組分別接受非治療(僅僅關閉傷口)，僅用聚合物(PCL)，含有10％紫杉酚的熱糊劑或含有20％紫杉酚的熱糊劑(僅4隻動物注射)植入緊鄰腫瘤部位。在第16天，將小鼠處死，切取腫瘤並檢查(整體檢查和組織學檢查)腫瘤生長、腫瘤轉移、治療產生的局部和系統毒性、對於傷口恢復的作用、對於腫瘤血管的作用，及保留在切口部位糊劑的情況。每隻動物的腫瘤重量示於如下表Ⅳ表Ⅳ腫瘤重量(gm)

含有20％紫杉酚的熱糊劑與對照組動物比較(平均重量0.681)腫瘤生長抑制率高於85％(平均重量0.105)。用空白熱糊劑或用含有10％紫杉酚的熱糊劑處理的動物，對於腫瘤生長只有一般的效應；腫瘤重量分別降低10％和35％(圖43A)。因此，含有20％的紫杉酚的熱糊劑在降低腫瘤生長方面比含有10％紫杉酚的熱糊劑有更大的作用(圖43C和圖43B)。
在一些動物的用藥部位檢測糊劑。在8/15小鼠中檢測到重量在0.026g/0.078g的聚合物。在含有20％紫杉酚的熱糊劑的組中，每隻動物含有一些殘餘的聚合物，提示它對溶解是不敏感的。組織學上，用含有紫杉酚的熱糊劑處理的腫瘤與對照腫瘤相比含有較低的細胞結構和更多的組織壞疽。血管減少，在細胞分裂中經常見到內皮細胞被抑制。含有紫杉酚的熱糊劑不顯示損害皮膚或腫瘤周圍組織的完整性或細胞結構。大體上，傷口恢復不受影響。
實施例20含有紫杉酚的手術用糊劑延緩小鼠體內部分切除的RIF-1腫瘤再生的用途考察了紫杉酚可生物降解的聚合物持續釋放手術用糊劑延緩C3H/Hej小鼠體內部分切除的RIF-1腫瘤再生的效應。
A．方法將20％紫杉酚混入聚(ε-己內酯)和甲氧基聚乙二醇4∶1的混合物中。通過用HPLC測定法檢測紫杉酚，考察了此劑型在含有白蛋白(0.4mg/ml)的37℃的磷酸鹽緩衝鹽水中的體外釋放曲線。概括地說，將懸浮有RIF-1細胞(1.0×106細胞)的Hanks緩衝液100ul，注入17隻小鼠的右腹。使腫瘤生長5天，將每個腫瘤手術切除70％以上，剩餘腫塊不進行處理，或以20-30ul20％紫杉酚手術用糊劑或不合藥物的手術用糊劑覆蓋。此時為第0天。在第4天至第7天，和第9天，測定皮膚下可以見到的腫瘤塊的尺寸。可見的圓柱形腫瘤的面積與腫瘤體積相關聯(r=0.812)。
B．結果紫杉酚的體外釋放曲線，以初始第1天的爆發階段和隨之一長期的慢速持續釋放為特徵。從第4天至第9天每隻鼠可見的圓柱形腫瘤表面面積示於表Ⅴ。在不接受紫杉酚的2組中，除1隻鼠外，所有小鼠在第4天顯示普遍的腫瘤再生。1隻只接受聚合物的小鼠顯示延遲腫瘤生長，而1隻不接受治療的小鼠不顯示腫瘤再生。對照地，用紫杉酚手術用糊劑處理的除1隻外的所有小鼠，至少直至第5天，不顯示腫瘤再生，兩隻鼠直至第6天仍不顯示腫瘤再生。
C．結論含有紫杉酚的糊劑，在第1-5天顯著抑制腫瘤再生。因為細胞系的進攻性，再生發生在第6天以後。
表Ⅴ腫瘤切除術後測量的RIF-1細胞腫瘤大小(表示為皮下可見腫瘤塊的面積mm2)<


*未測量腫瘤或動物已被處死實施例21包膠蘇拉明將1ml5％ELVAX(與5％乙酸乙烯酯交聯的聚合(乙烯-乙酸乙烯酯))的二氯甲烷(DCM)溶液，與固定重量的蘇拉明鈉亞微粒粉末混合。將此混合物注入盛於30ml平底試管中的5ml5％聚乙烯醇(PVA)水溶液中。將含有不同重量藥物的試管懸浮在40℃放多個樣品的水浴中90分鐘，伴以自動攪拌。將混合物移出，分析微球樣品的體積。將試管在1000g離心5分鐘。移取並收集PVA上清液用以分析(非包膠藥物)。在5ml水中洗滌微球並再次離心。保留此5ml洗滌液用於分析(表面結合著的藥物)。將微球在50ul甲醇中溼潤，並在1mlDCM中渦旋混合以溶解ELVAX。將微球加熱到40℃，在攪拌條件下緩慢加入5ml50℃水。此過程導致DCM立即蒸發，因此蘇拉明鈉釋放進入5ml水中。
所有樣品用螢光定量法測定藥物含量。概括地說，蘇拉明鈉的紫外/可見(uv/vis)吸收有最大吸收峰λ312nm。在水和5％PVA中，此吸收在0-100ug/ml範圍內呈直線。蘇拉明鈉也能強烈地發出螢光，最大激發波長在312nm，最大發射波長在400nm。此螢光測定法在0-2Sug/ml範圍內是可以定量的。
這些實驗結果示於圖44-50。概括地說，在DCM中加入藥物，不影響微球體積的數量(圖44)或重量(圖45)分布。可以得到在20-60um範圍內的微球的高產率。
蘇拉明的包膠率很低(＜1％)(圖47)。然而隨著DCM中藥物重量增加，雖然包膠百分率降低，但被包膠的藥物總量增加。如示於圖46，可以將50ug藥物包在50mg ELVAX中。蘇拉明鈉在含有10％NaCl的2.5％PVA中的包膠作用示於圖48(以重量為基準的體積分布)。蘇拉明鈉在含有10％氯化鈉的5％PVA中的包膠作用示於圖49和50(分別為以重量、數量為基準的體積分布)。
為評價蘇拉明鈉和可的松乙酸酯作為潛在的抗血管生成劑的作用，每個藥物與0.5％甲基纖維素混合，並使用乾燥的圓盤，在其中將藥物置於6天大的CAM的生長的血管上。蘇拉明(70μg)與可的松乙酸酯(20μg)聯合治療，當在CAM上試驗48小時時，能成功地抑制血管生長。產生的無血管區域直徑為6mm,顯示一個無血流和血管組織稀疏的區域(圖51A和51B)。
實施例22含有甲氨喋呤的糊劑A．製備含有甲氨喋呤的糊劑用研杵和研缽將甲氨喋呤(「MTX」；Sigma Chemical Co.)研磨使顆粒體積降低到5微米以下。將其乾粉末與聚己內酯(分子量18000,Birmingham Polymers,AL USA)混合。將混合物加熱到65℃5分鐘，將熔融的聚合物/甲氨喋呤混合物攪拌5分鐘成為均勻的糊劑。將熔融糊劑置於1ml注射器中，按需要擠出。
B．結果結果示於圖52A-E。概括地說，圖52A顯示MTX從含有20％MePEG和各種濃度的MTX的PCL片中釋放的情況。圖52B顯示了一相似的試驗，所用的糊劑不含MePEG。圖52C,D和E顯示了存在於片中的MTX的量。
從以上結果可以看出，當使用高含量的MePEG時，可以從聚合物中釋放出相當大量的MTX。
實施例23製備含有甲氨喋呤的微球A．僅含有MTX的微球用研杵和研缽將甲氨喋呤(Sigma)研磨使顆粒體積降低到5微米以下。將100ml2.5％PVA(w/v)(Aldrich或Sigma)水溶液與500mg未研碎的MTX在25℃攪拌15分鐘，使溶液被MTX飽和。在2000rpm將此溶液離心除去未溶解的MTX，上清液用於製備微球。
概括地說，將10ml5％w/v聚合(DL)乳酸(分子量500,000；Polysciences)、聚合乳酸∶乙醇酸(50∶50Ⅳ0.78 Polysciences)或含有10∶90w/wMTX(粉末)聚合物的聚己內酯PCL(分子量18,000，BPI)溶液緩慢滴入100mlMTX飽和的2.5％w/vPVA(Aldrich或Sigma)溶液中，同時，伴以600rpm的攪拌。將混合物在25℃攪拌2小時，將產生的微球洗滌並乾燥。
用這種方法能夠重複製備在30-160微米範圍內的含有MTX的微球(圖53)。
B．含有MTX和透明質酸的微球按如下所述，可以用透明質酸(HA)作為載體，用油包水乳化方法製備含有MTX的微球。概括地說，將50ml石蠟油(Parafin oil)(輕油；Fisher Scienfic)在200rpm攪拌的條件下加熱到60℃。將5ml含有不同量的MTX的透明質酸鈉(來源=公雞雞冠；Sigma)水溶液(20/ml)滴加到石蠟油中。將混合物在200rpm攪拌5小時，在500xg離心5分鐘。將產生的微球在正己烷中洗滌4次，然後乾燥。
實施例24製備含有釩化合物的聚合組合物A．含有硫酸氧釩的聚合糊劑首先用研缽和研杵將硫酸氧釩(Fisher Scientific)研磨以降低其顆粒體積，然後按如上所述用於MTX的方法將其分散於熔融的PCL中。將其置於注射器中固化待用。
如在例31中所述測定藥物的釋放，不同點只在於將65mg含有10％w/wVOSO4∶PCL的丸劑懸浮於10ml水中，用UV/Vis分光法測定在200-300nm範圍內的吸收峰，以分析上清液中釋放的硫酸氧釩。
結果示於圖54。概括地說，從含有10％VOSO4的聚合組合物中，6小時內釋放1mgVOSO4，兩天後釋放3mg VOSO4,6天釋放5mgVOSO4。
B．含有硫酸氧釩的聚合微球如例23所述，將硫酸氧釩加入聚合-乳酸或透明質酸的微球。結果示於圖55。
C．含有有機釩酸鹽的聚合糊劑如例22所述，將有機釩酸鹽加入PCL糊劑。如上測定釩從微球中的釋放。結果示於圖56A和56B。
D．含有有機釩酸鹽的微球如例23所述，也可將有機釩酸鹽加入微球。如示於圖57的聚合D,L-乳酸的微球(分子量500,000,Polysciences)。
實施例25含有雙(麥芽酚酸)氧合釩(BMOV)的聚合組合物A．製備加載雙(麥芽酚酸)氧合釩(BMOV)的糊劑將聚(ε-己內酯)(分子量20000)(BPI Birmingham AL)和BMOV稱重，直接以適當比例置於玻璃燒杯中。在某些製劑中，也在PCL和BMOV中加入甲氧基聚乙二醇(MEPEG)(分子量350)(UnionCarbide,Danbury CT.)。將燒杯和內容物加熱到55℃，同時輕輕攪拌5分鐘直至BMOV徹底分散於熔融的聚合物中。將熔融的混合物吸入預熱的注射器中，保存在4℃待用。
B．藥物釋放研究向含有15ml10mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS pH7.4)和100μg/ml牛血清白蛋白(部分5 Boehringer Mannheim，德國)的試管中加入150mgPCL-BMOV糊劑的圓盤形的片。將試管密封，並在37℃以30rpm的速率上下翻轉。在適當的時間，使PCL-BMOV片在重力作用下沉降5分鐘，吸取所有上清液。通過測定在256nm(A256)和276nm(A276)的吸收，測定上清液中的BMOV的含量。用15ml新鮮PBS補充試管中的上清液，再次使試管翻轉。用0-25μg/ml範圍內BMOV的標準品得到BMOV濃度與A256和A276的線性曲線。在37℃密封試管中保存2-3天，這些標準品在256nm和276nm的吸收值不受影響(藥物釋放研究使用同樣條件)。
在藥物釋放實驗的最後，通過將已知乾燥重量的基質溶解在0.5mlDCM(Fisher)中，測定PCL-BMOV基質樣品中殘餘藥物含量。向此溶液中加入50ml熱水(50℃)，攪拌，使DCM蒸發，將BMOV留在水中，用分光光度計進行分析(A256)。
C．掃描電鏡(SEM)用掃描電鏡觀察在2個月的藥物釋放實驗中使用的PCL-BMOV基質樣品。這些樣品與新鮮製備的對照樣品比較。將聚合物樣品鍍膜(金鈀=60∶40)(Hummer instruments,Technics,USA)，用有IBM數據採集系統的Hitachi(model F-2300)掃描電鏡觀測。
D．結果BMOV從PCL基質中的釋放示於圖58A和圖58B。將BMOV在PCL基質中的加載量從5％增加到35％，將增加藥物在2個月的周期內釋放的速率(圖58A)。在35％BMOV加載量，釋放速率顯著增加。BMOV加載量從20％至30％的釋放曲線顯示在前2天有一很快的藥物初始釋放階段，在以後的2個月中，隨之一受控制的幾乎為0級的釋放。
藥物釋放曲線也以存留於丸中的藥物的百分比表示(圖58B)。概括地說，存留於PCL基質中的BMOV的百分數，在所有時間點對於所有低於(包括)30％的BMOV含量，幾乎是相同的。因此，佔初始含量65％-80％的BMOV在2個月後還存在於基質中。(為清楚計，只有BMOV含量為25％和30％的數據示於圖58B)。存留於基質中的藥物的百分數在BMOV含量為35％時降低最快，因此，佔初始濃度的50％稍高的BMOV在一個月後還存在於基質中。為確定藥物累計釋放數據，在每次藥物釋放實驗結束時測定PCL-BMOV基質樣品的存留藥物含量。在70天按此存留量測定法測得的藥物存留百分數如下67％+/-10％(5％BMOV),56％+/-10％(10％BMOV),80％+/-20％(15％BMOV),84％+/-20％(20％BMOV),85％+/-12％(25％BMOV),77％+/-14％(30％BMOV),57％+/-1S％(35％BMOV)。
圖59A和59B顯示在PCL基質中加入20％MEPEG對於不同BMOV加載量的藥物釋放曲線的影響。在基質中加入MEPEG，與BMOV從只含PCL的基質中釋放比較，顯著增加BMOV的釋放速率(圖58)。對於所有BMOV含量，高於50％的BMOV在1周內從聚合基質中釋放。PCL-BMOV-MEPEG丸劑的存留分析給出7天時丸劑中BMOV的存留量24％(+/-9％),5％BMOV；25％(+/-8％),10％BMOV；22％(+/-4％),15％BMOV；27％(+/-7％),20％BMOV。
圖60A顯示了在高放大倍數下BMOV結晶的形態。圖60B和60C顯示了在水溶性緩衝液中進行的周期為兩個月的藥物釋放研究前後聚合物-藥物基質的形態。含有15％、20％、30％BMOV的PCL-BMOV基質在釋放研究之前其外表面一般是光滑的，圖60B顯示了一張代表性的SEM照片。隨著在水溶性緩衝液中保溫2個月，外表面變得粗糙並有凹痕。
E．討論此化合物從PCL基質中緩慢釋放，具有維持持續的釩濃度的理想的特徵。這些特徵包括僅僅在開始幾天藥物釋放的小的爆發效應，繼之對於大部分藥物加載量幾乎為動力學0級釋放(圖58)。BMOV的水溶性比硫酸氧釩或原釩酸鈉低，分子的疏水性很可能增加BMOV分子與疏水性PCL基質的親和，並降低藥物釋放進入水性保溫介質中的速率。
向PCL中加入20％MEPEG顯示能通過降低基質的粘性和聚合物的固化溫度而增加糊劑的熱流動性。這些性質對於將糊劑用於周圍小管腫瘤部位，以在此條件下使此部位更好地恢復是重要的。在BMOV-PCL糊劑基質中加入MEPEG已顯示能在各種BMOV含量(5％-20％)下，與從BMOV-PCL(無MEPEG)中釋放的速率(圖58)相比，增加BMOV的體外釋放速率(圖59)。含有5％BMOV的PCL-MEPEG糊劑顯示每天釋放500-1000μgBMOV(與從含有35％BMOV的PCL中的釋放速率相似)。
實施例26含有雙(麥芽酚酸)氧合釩(BMOV)的熱糊劑的體外和體內功效如上製備含有BMOV的聚合PCL熱糊劑，並試驗其在體外和體內抗腫瘤細胞系的功效。
A．人腫瘤細胞系從美國典型培養物保藏中心得到HT-29結腸、MCF-7乳腺和SKMES1非小細胞肺人腫瘤細胞系。用含有10％加熱滅活的胎牛血清(HIFBS)的RPMI 1640培養HT-29結腸細胞系，用含有5％HIFBS加10-9M胰島素的Iscov’s改良Eagles培養基培養MCF-7乳腺細胞系，用含有10％非熱滅活FBS的Eagle's最低必需培養基培養SKMES1肺細胞系。
B．正常人骨髓細胞從由於固體腫瘤將要進行骨髓移植，但在使用骨髓前死亡的病人身上得到正常人骨髓細胞(組織學上與腫瘤細胞不相容)。離心後，移去血沉棕黃層，用溶細胞緩衝液處理細胞，並用其洗滌細胞兩次，然後再次懸浮於含有20％HIFBS的RPMI 1640中。將細胞拉過一25號的針並計數。
C．輻射測量(Bactec)系統Bactec系統(Johnston Laboratories,Towson,MD)以一測定血液培養物中的細菌的臨床設備為基礎，並用於篩選新的抗腫瘤劑。此輻射測量系統為高速半自動系統，採用14C葡萄糖向14CO2轉化的抑制效應作為細胞毒性的指數。Bactec儀器自動將14CO2衝入離子室，在其中將放射標記的CO2信號轉化為成比例的電信號，或按1∶1000比例的增長指數值。對於連續照射，將腫瘤細胞或正常骨髓細胞加入2ml含有2uC14C葡萄糖並加入BMOV使其終濃度為0.01,0.1,1,10,25,50uM的正常生長培養基中，並注入含有5％CO2和空氣的20ml具有橡膠塞的玻璃瓶中，將玻璃瓶在37℃保溫24天。對於再照射的1小時，將細胞和具有同樣最終濃度的BMOV置於15ml聚丙烯錐形瓶中，在37℃水浴中保溫1小時。然後將細胞離心，並在培養基中清洗，再次懸浮於2ml含有2uCi14C葡萄糖的正常生長培養基中，並注入20ml含有5％CO2和空氣的具有橡膠塞的血清瓶中，將血清瓶在37℃保溫24天，對於腫瘤細胞系，在第6、9、12天，對於骨髓細胞在第6、15、24天，除去血清瓶，將細胞注入Bactec裝置，測定細胞對於14C葡萄糖進行新陳代謝產生的14CO2的量。將BMOV處理的細胞的生長指數與未非處理細胞的生長指數比較，計算與未治療的對照物比較的存活率％。
D．切除腫瘤的研究在此研究中使用7周大的雄性C3H/HeJ小鼠。在含有10％FBS(Gibco Canada)的α-MEM介質中培養RIF-1(鼠照射產生的纖維肉瘤)細胞。將細胞懸浮在1％Hanks緩衝鹽水溶液中(HBSSpH7.4)(Gibco Canada)，濃度為1×107細胞/ml。將100微升這些細胞(1×106細胞)注入每隻鼠的右腹。使腫瘤生長5天(此時腫瘤直徑為6-8mm)。在第5天將鼠用Ketamine:Rompom(70mg/kg:10mg/kg)組合物(0.02ml/g)麻醉。從腫瘤邊緣製造一5mm切口，切除每個腫瘤的約90％，從一500ul注射器中擠出150mg熔融的(50℃)PCL-BMOV或PCL(對照)，使其覆蓋被切除腫瘤部位的整個表面。PCL在30秒內固化，以5-0聚丙烯纖維縫合線關閉此部位。在第4、5、6、7天檢查小鼠。每天測量腫瘤(長徑和短徑)並照相。當腫瘤達到最大直徑為9mm時，將鼠處死，切開腫瘤部位，進一步進行組織學研究。
結果示於圖63。
E．腫瘤抑制研究使MDAY-D2造血細胞系(從Dr.J Dennis,Mount Sinai Hospital，Toronto得到)覆蓋在含有5％FBS(Cibco Canada)的DMEM中的懸浮液中，並使其在其中生長。在每隻鼠的後側部皮下注入存在於100 ul PBS中的4×105細胞。腫瘤生長5天，在每隻鼠靠近腫瘤的部位植入150mg PCL或PCL-BMOV熔融糊劑。15天後將鼠處死，稱重，並切取腫瘤稱重。結果示於圖62。
F．結果和討論對於正常人骨髓細胞，1小時照射的BMOV即使在濃度50μM，只有很少的作用。使用連續照射，BMOV對於骨髓細胞的作用也不明顯，只在50μM濃度觀察到敏感性(49％存活率)。因此BMOV化合物在此濃度和照射試驗中不顯示非常抑制骨髓生長。
在此研究中，BMOV的抗腫瘤作用已顯示在體外在連續暴露於這些藥物之下時，能對抗3種人腫瘤細胞系。然而，其在體內的功效依賴於腫瘤細胞在BMOV之下的連續暴露。此研究的主要目的是設計和試驗(體內)一種生物降解的聚合物傳遞系統，可以提供低濃度釩(BMOV型)的持續供應。
體內試驗顯示PCL-BMOV糊劑的皮下單一給藥抑制MDAYD2腫瘤生長。圖62顯示對照鼠(PCL-無BMOV)的腫瘤重量和用含有25％、30％、35％BMOV的PCL治療的鼠的腫瘤重量。對於含有25％BMOV的PCL，腫瘤抑制率為54％(顯著性p＜0.05)。含有30％和35％BMOV者分別產生76％和80％的腫瘤生長抑制率，在BMOV含量為35％的試驗組中，6隻鼠中的1隻能完全根除腫瘤。
令人感興趣的是，體內藥物釋放曲線顯示含有25％、30％BMOV的糊劑每天釋放約500ug BMOV，此劑量以前已顯示出功效。然而，在降低腫瘤生長方面最有效的含有35％BMOV的PCL糊劑，在體外的釋放量約為此量的2倍。這些數據證明低劑量釩化合物的持續釋放與釩酸鹽每天給藥的方式比較，是一等效或更有效的抗腫瘤方式。
雖然，PCL-BMOV糊劑在抗腫瘤生長方面是等效的，小鼠不顯示應激反應和體重降低。每日注射高劑量釩酸鹽會觀察到應激反應增加和體重降低，或許與用藥後血漿中立即出現的釩酸鹽的高水平導致的毒性相關。使用PCL-BMOV糊劑提供釩酸鹽的長時期持續的釋放可以降低血漿釩酸鹽濃度的大的波動，防止釩產生毒性。這些數據與我們的假說一致，即BMOV的緩慢持續釋放在降低腫瘤生長和防止釩產生毒性方面是等效或更有效的。
實施例27BMOV微球對於小鼠腫瘤生長的影響此研究的目的是測試加載BMOV的PLLA微球(20％)對抑制小鼠腫瘤生長的作用。
24隻小鼠中的20隻皮下注射100ml濃度為10×106/ml的MDAY-D2細胞。在第6天，將小鼠分為6組。組1，空白對照；組2，腫瘤對照；組3，皮下注射0.25mg/100ulBMOV，每日2次；組4腹膜內注射20mg含有5mgBMOV的PLLA微球；組5分別在第6和第9天腹膜內注射10mg BMOV微球；組6分別在第6和第9天肌肉內注射10mg BMOV微球。在第16天，處死小鼠並解剖腫瘤。
結果示於如下的表Ⅵ和Ⅶ。
表Ⅵ對照組和治療組小鼠的重量

表Ⅶ對照組和治療組腫瘤的重量


實施例28控制釋放的聚合物藥物釋放系統有機釩配合物從聚(ε-己內酯)(PCL)熱糊劑與甲氧基聚乙二醇(PCL-MePEG)熱糊劑中釋放的體外藥物釋放曲線的比較研究本研究旨在探索在聚(ε-己內酯)(PCL)熱糊劑和/或PCL-MePEG熱糊劑中釩的4種有機配合物形式(BMOV,BEMOV,V5,PRC-V)的包封和體外釋放動力學。
A．方法用不同濃度的釩溶液進行定量分析(UV/VIS分光光度分析法)得到吸收峰的波長和計算方程。在含白蛋白的10mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS/ALB)(pH7.4)中研究釩的溶解度。將1％、5％、10％和20％(在PCL中釩配合物的百分比)的各種有機配合物形式的釩包封在可生物降解的聚合物PCL和/或PCL與MePEG(MW350)混合物中得到稱為「熱糊劑」的聚合藥物輸送產物。在37℃PBS/ALB中進行各種形式的釩從熱糊劑中釋放的體外釋放研究，用UV/VIS吸收分光光度法測定釩的釋放。
B．結果結果示於圖64-68。簡要地說，BMOV,BEMOV和V5的吸收峰在276nm,PRC-V的吸收峰在266nm。釩的各種形式的溶解速率和程度的順序為V5＞BMOVBEMOV＞PRC-V。體外釋放研究顯示，藥物從熱糊劑中釋放的速率隨以下因素增加(1)增加藥物溶解度，(2)增加藥物濃度，(3)增加熱糊劑中MePEG的數量。
C．結論可以通過使用不同形式的釩(作為藥物)，通過改變PCL中特定形式的釩的加載百分含量，或通過在PCL中加入MePEG，使從PCL熱糊劑中釋放控制劑量的釩。然而改變PCL中特定形式的釩的百分含量，可以在短期內控制釋放速率，但藥物控制劑量的輸送可以導致藥物(PCL中)在動物體內產生一巨大的儲存(有潛在的毒性)。因此，交替使用各種形態的釩，或PCL在中加入MePEG，可以為輸送控制劑量的釩提供另一種方法。
實施例29在PCL熱糊劑中包封喜樹鹼及其抗血管生成效應的分析A．在PCL中加入喜樹鹼用研杵和乳缽將喜樹鹼研磨使其體積降低到5微米以下。然後將此乾燥粉末與聚己內酯(分子量18,000 Birmingham聚合物，AL USA)混合。將混合物加熱到65℃，保持5分鐘，將熔融聚合物/藥劑混合物攪拌5分鐘，成為均勻的糊劑。將此糊劑加入1ml注射器中，並擠出形成3mg的丸。將這些丸置於CAM上，測定其抗血管生成效應。
B．結果含有喜樹鹼的熱糊劑與對照PCL丸劑相比能有效地抑制血管生成。含藥量為5％時，4/5實驗所用的CAM顯示有效的血管生成抑制效應。另外，含藥量為1％和0.25％時，分別有2/3和3/4CAM顯示血管生成抑制效應。因此，這些結果明確顯示喜樹鹼從PCL糊劑中的釋放是足夠的，喜樹鹼具有治療性的抗血管生成作用。
實施例30製備含有S-磷酸酯的熱糊劑在此研究中，我們證明S-磷酸酯，一種具有抗腫瘤活性的醚脂，能成功地加入PCL熱糊劑中，並在CAM測定中顯示出效力。
A．製備含有S-磷酸酯的糊劑將聚己內酯(BirminghamPolymers，Birmingham AL)和S-磷酸酯以適當比例在55℃研磨2分鐘。將熔融混合物用吸管滴製成3mg的半球形丸，在4℃固化成型。
B．CAM生物測定將受精家雞胚胎(Fizsimmons ConsultingResearch ServicesLtd.,B.C.)孵育4天，然後在其殼上開一小窗。簡要地說，從卵的鈍圓的一端(氣室部位)除去殼和內層殼膜，形成一小洞(直徑約為2cm)，將暴露區域以無菌石蠟膜封閉。將卵置於孵育器上，窗口向上，在37℃另外孵育2天。在孵育的第6天，將3mg的含有S-磷酸酯的聚合物丸或對照(無藥物)聚合物丸置於生長的CAM血管表面。接觸2天後(孵育的第8天)用裝有Contax照相系統的立體顯微鏡觀測CAM的血管系統。為增加血管的對比度，掩蓋背景信息，在成象前將1ml脂肪乳劑溶液(AbbottLaboratories)注入CAM中。
C．結果S-磷酸酯濃度分別為0％、1％、2％、4％、8％的PCL丸劑，在CAM實驗中引起劑量依賴性抗血管生成反應。抗血管生成反應以含有S-磷酸酯的丸劑直接接觸的下部區域的血管缺損為特徵。在CAM對照區域的緻密的毛細血管網的正常生長，在經S-磷酸酯處理的CAM區域已明顯地被抑制。在高濃度(4％和8％)，被處理的CAM，在藥物/聚合物丸劑的鄰近區域已經發生結構改變。此改變包括CAM緊接S-磷酸酯/聚合物丸處明顯增厚，丸劑下面的膜變薄。在所有經S-磷酸酯處理的CAM中，暴露2天後有一明顯的無血管區域，這稱為毛細管網缺損區，面積約為3mm2。
實施例31在PCL熱糊劑中包膠酪氨酸激酶抑制劑並用CAM測定法分析用研杵和乳缽將酪氨酸激酶抑制劑研磨使其體積降低到5微米以下。然後將此乾燥粉末與PCL混合(分子量18,000BirminghamPolymers,AL USA)。將混合物加熱到65℃，保持5分鐘，將熔融聚合物/藥劑混合物攪拌5分鐘，成為均勻的糊劑。將此糊劑加入1ml注射器中，並擠出形成3mg的丸。然後用CAM法測定這些丸劑。CAM測定法所測定的酪氨酸激酶抑制劑包括灰薰草黴素-C、制表黴素、除莠黴素、和金雀異黃素。當比較這些藥劑的抗血管生成抑制效應時，在導致4/4實驗的CAM產生無血管區方面，除莠黴素(在PCL中有2％)是最有效的。
實施例32在PCL熱糊劑中包膠長春花屬生物鹼並用CAM法進行分析A．在PCL熱糊劑中加入抑制劑用研杵和乳缽將長春花屬生物鹼(長春花鹼和長春新鹼)研磨使其體積降低到5微米以下。然後將此乾燥粉末與PCL混合(分子量18,000BirminghamPolymers,AL USA)。將混合物加熱到65℃，保持5分鐘，將熔融聚合物/藥劑混合物攪拌5分鐘，成為均勻的糊劑。將此糊劑加入1ml注射器中，並擠出形成3mg的丸。然後用CAM法測定這些丸劑。
B．結果當以CAM法測定製劑時，明顯地，這些藥物從PCL丸中釋放出足夠的量產生生物效應。長春花鹼和長春新鹼與對照PCL熱糊劑丸比較，在CAM測定中產生抗血管生成效應。
藥物加載含量為0.5％和0.1％時，長春新鹼在所有被實驗的CAM中產生血管生成抑制效應。當濃度超過2％時，達到有毒的藥物水平，並發生意外的胚胎死亡。
在長春花鹼濃度為0.25％、0.5％、1％時，CAM實驗也有抑制血管生成的效果。然而，濃度超過2％時，長春花鹼也對胚胎產生毒性。
實施例33生物粘附微球A．製備生物粘附微球用100kg/molPLLA製備直徑為10-60um的微球。將微球在氫氧化鈉溶液中保溫，通過聚酯水解在表面產生碳酸基團。此反應通過測定表面電荷，以氫氧化鈉濃度和保溫時間為特徵。在0.1M氫氧化鈉中保溫45分鐘後反應完成。用鹼處理後，將微球懸浮在二甲基氨基丙基碳二亞胺(DEC)的乙醇溶液中，使微球表面包以交聯劑DEC,使混合物乾燥成分散的粉末。微球與DEC的重量比為9∶1。微球乾燥後，將其攪拌分散於2％w/v聚合丙烯酸溶液中，使DEC與PAA反應，在微球表面產生交聯PAA水溶性網，用掃描電鏡證實微球表面PAA的存在。
用鹼處理微球前後，用差示掃描量熱法觀察微球顯示，用掃描電鏡觀測到的體積熱性質(比熱、熔融、結晶度)不發生變化。
B．紫杉酚的體外釋放速率製備具有同樣顆粒體積的加載紫杉酚的微球(含量10％和30％w/w)，及其在磷酸鹽緩衝鹽水中釋放10天的體外釋放曲線。釋放與藥物含量呈比例，在10天內，從5mg含量為30％的微球中釋放的紫杉酚為400μg，從含量為10％的微球中釋放的紫杉酚為150μg。包封效率約為80％。將含有紫杉酚的微球在0.1M的氫氧化鈉溶液中保溫45分鐘，在於氫氧化鈉中保溫前後分別測定δ電位。在鹼處理前後，含有紫杉酚的微球的表面電荷，均低於不合紫杉酚的微球，C．製備表面包以聚合-L-賴氨酸或纖維結合素的PLLA，並進行體外測定製備含有1％蘇丹黑的PLLA微球(使微球染色)。將這些球懸浮在2％(w/v)聚合賴氨酸(Sigma chemicals-Hydrobromell form)或纖維結合素(Sigma)溶液中10分鐘。將這些微球在緩衝液中洗滌一次，置於新鮮製備的大鼠膀胱的內表面。這些膀胱放置10分鐘，然後在緩衝液中洗滌3次。此過程後殘餘(粘附)微球出現在膀胱壁，顯示纖維結合素或聚合賴氨酸包裹的微球具有生物附著性(圖69A和69B)。
實施例34合成聚合(N-異丙基丙烯醯胺)可以通過自由基聚合和照射聚合容易地製備聚丙烯醯胺及其衍生物。以下是合成聚合(N-異丙基丙烯醯胺)的例子，通過從有機溶劑如己烷和甲苯中重結晶，使其中的單體(N-異丙基丙烯醯胺)純化。
簡要地說，在一定溫度下，如60℃，將(N-異丙基丙烯醯胺)溶於甲苯。將此溶液冷卻到較低溫度(如4℃)以使單體重結晶。過濾收集單體，並使其真空乾燥。為進行合成，在圓形玻璃燒瓶中，將此純化過的單體(20g)溶於蒸餾水(180ml)。溶液用氮氣吹洗30分鐘，以置換其中溶解的氧氣。將溫度升高到65℃，在其中加入少量(0.1g)啟動劑，如過硫酸銨和2,2-偶氮二異丁基腈，以開始聚合反應。聚合反應在10小時內完成，在此過程中有氮氣保護並加以攪拌。最後通過加入乙醇使聚合(N-異丙基丙烯醯胺)沉澱。將聚合物乾燥並收集。
實施例35聚合丙烯酸衍生物的合成可以通過自由基聚合和照射聚合，產生聚合丙烯酸及其衍生物。以下是一個合成聚合丙烯酸的例子，其中通過減壓蒸餾(如40℃,10mmHg)使單體丙烯酸純化。
簡要地說，在一圓底玻璃燒瓶中，使純化的單體(20g)溶於二噁烷(180ml)，。溶液以氮氣吹洗30分鐘，以置換溶解在其中的氧。將溫度升高到65℃，並加入少量(0.1g)啟動劑2,2-偶氮-二異丁基腈以啟動聚合反應。聚合反應在24小時內完成，在此過程中有氮氣保護，並加以攪拌。最後通過加入正己烷，使聚合丙烯酸沉澱，將聚合物乾燥並收集。
實施例36紫杉酚的血管周圍用藥重量在250-300g的WISTAR大鼠，通過肌肉內注射達哌啶醇(0.33ml/kg)使其麻醉。當其鎮靜後，使其接受Halothane麻醉。常規麻醉後，剃掉頸部的毛，將皮膚夾緊，並用聚維酮碘擦拭。在左頸動脈處製備一垂直的切口，暴露表層的頸動脈，在表層的頸動脈處，進行兩處結紮，並進行一橫向的動脈切開術。將有2個FRENCH FOGART球的導管插入頸動脈，並進入左側頸總動脈，用鹽水使球加壓溶脹。導管在頸動脈中上下移動三次。然後除去導管，解開表層頸動脈處的繩子。
將存在於乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVA)中的紫杉酚(33％)以環狀方式注入10隻大鼠總動脈周圍。將單獨的EVA注入另外10隻大鼠的頸總動脈周圍。在第14天，將每組的5隻大鼠處死，在第28天，處死剩餘的5隻大鼠，觀察大鼠的失重和其它全身性疾病的症狀。在14或28天後，將動物麻醉，以開始的實驗方式，暴露大鼠的左頸動脈。分離左頸動脈，在10％緩衝甲醛中固定，並進行組織學檢測。
實施例37粥樣硬化的治療
A．粥樣硬化通過膳食使在紐西蘭白兔中產生粥樣硬化病變。簡要地說，重量約為1.6kg的New Zealand白兔，供給粉末狀雜食，其中含有重量0.25％的膽固醇。每周通過在耳緣靜脈處注射達哌啶醇(0.1ml/kg)使血管溶脹，從此處取樣，測定血漿膽固醇。將樣品與EDTA混合使EDTA在樣品中的濃度達到0.15％，置於冰中，通過低速離心分離血漿。
開始服用全膽固醇飲食一周後，將動物隨機分成3組，每組10隻。施以麻醉劑氯胺酮35mg/kg和賽拉嗪7mg/kg後，通過插管法麻醉，剃去下腹部的毛，皮膚消毒。施行剖腹術，分離腹主動脈。用22號的針乙烯-乙酸乙烯糊劑、含有5％紫杉酚的乙烯-乙酸乙烯糊劑或含有33％紫杉酚的乙烯-乙酸乙烯糊劑，以環狀方式置於腎外腹主動脈近端周圍。不治療延伸至主動脈分支處的主動脈遠端部分。在10隻對照兔中，分離腎外腹主動脈，但不在其周圍注入任何藥物。
引起粥樣硬化的雜食持續24周。此時通過肌內注射施以氯胺酮35mg/kg和賽拉嗪7mg/kg進行麻醉，然後靜脈內超劑量注射Euthanol(240mg/ml；2ml/4.5kg)將動物處死。動物在100mm汞柱壓力下通過左室灌注Hanks』平衡鹽溶液與含有肝素(1IU/ml)的0.15mmol/lN-2-羥乙基哌嗪-N'-乙磺酸(pH7.4)10分鐘，然後灌注稀釋的Karnovsky's固定劑15分鐘，從而灌注固定。整體地分離胸、腹主動脈和髂動脈，置於相似的溶液中再固定30分鐘。
通過胸主動脈，並尤其通過腎外腹主動脈進行連續切片。進行Movat,HE，和Masson染色和組織學分析，檢查動脈腔代償度、動脈粥樣硬化損害發展的程度，和動脈腔周圍對動脈環周給藥法的任何反應。
實施例38治療再狹窄重量在250-300g的WISTAR大鼠，通過肌肉注射達哌啶醇(0.33ml/kg)而被麻醉。當服用鎮靜劑後，對其施以Halothane麻醉法，常規麻醉後，剃去頸部的毛，皮膚用聚烯吡酮碘消毒。在左頸動脈處製備一垂直切口，暴露表層的頸動脈。在表層的頸動脈處，進行兩處結紮，在其之間將動脈橫向切開。將有兩個FRENCH FOGART球的導管插入表層頸動脈，並通入左側的主動脈，導管的球用鹽水溶脹加壓。導管在頸動脈內上下移動三次。然後除去導管，解開表層頸動脈處的繩子。
將動物隨機分為五組，五組分別是對照組，單獨的聚合物載體，聚合物載體加1,5,10,20和33％紫杉酚。觀察兩種聚合物載體,EVA和EVA/PLA混合物。將聚合物混合物以環周方式置於頸動脈處，關閉傷口。將每組動物在14天和28天處死。在此期間，觀察動物的體重降低和全身的其它症狀。14天和28天後，通過初始的靜鎮方式和肌肉內注射達哌啶醇(0.33ml/kg)，將動物處死。動脈進行組織學檢查。
實施例39引起移植狹窄的內膜增生A．動物研究對家豬進行常規的麻醉。剃去頸部的毛，皮膚用清潔溶劑消毒。在頸部兩側製備垂直的切口，暴露頸動脈，通過兩端吻合術，插入8mmPTFE移植物，吻合處的近端在頸總動脈處，遠端的吻合處在兩側的頸動脈處。將插入的旁路動脈結紮。動物隨機分組，每組10隻獵，在左側的外科手術吻合處分別接受單獨的聚合載體，聚合載體加5％紫杉酚，聚合載體加33％紫杉酚。右側移植物作為對照，關閉傷口，使每隻豬恢復。
研究第二組豬。以同樣方式製備移植物。在手術時，不在吻合處加任何血管活性劑。使動物恢復。進行移植兩周後，進行常規的第二次麻醉，再次暴露左動脈。靠近吻合處近端和遠端，以靠近近端和遠端吻合處環周方式，使10隻豬分別接受單獨的載體，聚合載體加5％紫杉酚和聚合載體加33％紫杉酚。閉合傷口，使豬恢復。對面的右側作為對照。
3個月後，將所有的豬進行常規麻醉，在股動脈處施以造口術，螢光鏡引導下在上行的胸主動脈中插入豬尾導管。進行頸動脈系統的弓形注射並成像。分別測量近端和遠端移植物狹窄等級，測量移植物遠端吻合處遠端緊鄰動脈的狹窄等級，計算狹窄百分率。如果需要，進行頸總動脈的選擇注射。
將每組5隻豬處死。動物在100mm汞柱壓力下通過左室灌注Hanks』平衡鹽溶液與含有肝素(1IU/ml)的0.15mmol/lN-2-羥乙基哌嗪-N』-乙磺酸(pH7.4)10分鐘，然後灌注稀釋的Karnovsky’s固定劑15分鐘，從而灌注固定。整體地分離胸、腹主動脈和髂動脈，置於相似的溶液中再固定30分鐘。
通過緊鄰近端吻合處頸動脈、近端吻合處、遠端吻合處和緊鄰遠端吻合處遠側頸動脈製備組織學切片。切片用Movat和HE和Masson染料染色。進行組織學分析，觀察血管內膜和外膜反應及血管周圍反應。計算形態測量得到的腔內狹窄程度。
在6個月時研究其它的豬，進行相似的製備血管造影標本過程。
從以上可以認識到，雖然為闡述本發明而記載了具體的實施例，但可以進行各種改進而不違背本發明的實質和不超出本發明的範圍。相應地，本發明只受限於所附的權利要求。
權利要求
1．一種治療或預防與身體通道有關的疾病的方法，它包含將治療劑輸送到所述身體通道的外部。
2．一種治療或預防與身體通道有關的疾病的方法，它包含將治療劑經血管外膜輸送到所述身體通道的平滑肌細胞。
3．根據權利要求1或2所述的方法，其中所述治療劑是抗血管生成因子。
4．根據權利要求1或2所述的方法，其中所述治療劑還包含聚合物。
5．根據權利要求3所述的方法，其中所述聚合物載體是聚(乙烯乙酸乙烯酯)(40％交聯)。
6．根據權利要求3所述的方法，其中所述聚合物載體是乳酸和乙醇酸的共聚物。
7．根據權利要求3所述的方法，其中所述聚合物載體是聚(己內酯)。
8．根據權利要求3所述的方法，其中所述聚合物載體是聚(乳酸)。
9．根據權利要求3所述的方法，其中所述聚合物載體是聚(乳酸)與聚(己內酯)的共聚物。
10．根據權利要求1或2所述的方法，其中所述治療劑是抗微管劑。
11．根據權利要求10所述的方法，其中所述抗微管劑能穩定微管。
12．根據權利要求11所述的方法，其中所述抗微管劑是紫杉酚，或其類似物或衍生物。
13．根據權利要求1或2所述的方法，其中所述身體通道選自動脈、食管、胃、十二指腸、小腸、大腸、膽道、輸尿管、膀胱、尿道、淚管、氣管、支氣管、細支氣管、鼻氣道、咽鼓管、外耳道和輸卵管。
14．根據權利要求13所述的方法，其中所述治療劑經動脈外壁直接注射到血管外膜，從而輸送到動脈。
15．根據權利要求1或2所述的方法，其中所述疾病選自血管疾病、胃腸疾病、泌尿生殖系統疾病和肺部疾病。
16．根據權利要求15所述的方法，其中所述治療劑是抗微管劑。
17．根據權利要求16所述的方法，其中所述抗微管劑能穩定微管。
18．根據權利要求17所述的方法，其中所述抗微管劑是紫杉酚，或其類似物或衍生物。
19．根據權利要求16所述的方法，其中所述抗微管劑是釩酸鹽或氧釩化合物，或其類似物或衍生物。
全文摘要
本發明提供了治療或預防與身體通道相關的疾病的方法,它包含將治療劑釋放到身體通道的外部的步驟。治療劑的代表實例包括抗血管生成因子,抗增殖劑,抗炎劑和抗生素。
文檔編號A61P31/04GK1219872SQ97194908
公開日1999年6月16日 申請日期1997年5月26日 優先權日1996年5月24日
發明者W·L·杭特, L·S·馬尚 申請人:血管技術藥物公司, 不列顛哥倫比亞大學