豬袋裝冷凍精液保存液及其保存方法

2023-12-09 09:18:26

專利名稱：：豬袋裝冷凍精液保存液及其保存方法
技術領域：
：本發明涉及動物繁殖領域，涉及一種精液保存液及精液的保存方法，特別是涉及一種豬袋裝冷凍精液保存液及精液的保存方法。二、技術背景隨著養豬業的發展需要，豬常溫保存精液的人工授精已經不能滿足現代養豬業的發展，豬的冷凍精液人工授精技術已成為國內外養豬生產中亟待解決的問題。豬冷凍精液與常溫精液保存相比，冷凍精液可以使優良基因得到無限期的保存(如本地豬種資源保護)，延長公豬使用年限，不受該公豬死亡、損傷、採精間隔或繁殖不育的限制，有利於人為地使用高性能水平的種公豬與較多數的母豬配種，獲得更大的遺傳進展；使種豬選擇不受時間或地理位置差異的限制，可以引進國外高性能公豬凍精取代活體公豬，可節省外匯支出；有利於人工授精體系的完善，公豬冷凍精液完全可以在後裔測定或疾病檢測後開始大量供應，為穩定的遺傳進展和嚴格的生物安全體系建設提供額外保障。從健康角度考慮,凍精為疾病檢測提供了足夠的時間，凍精還可在疾病暴發時利用大型的人工授精站提供穩定的精液供應保障。目前，對豬精液冷凍方法主要有顆粒冷凍精液、細管冷凍精液和安瓿瓶冷凍精液三種方法。顆粒冷凍精液的顆粒大小一般在0.1ml左右，顆粒過大時裡層和外層精液的受溫過於不均勻，效果較差；若顆粒過小，則在冷凍時又費事也不太方便。細管冷凍精液的細管類型有0.25ml型和0.5ml型兩種，如要滿足1頭母豬的輸精劑量，0.5ml的細管至少要10個以上，否則，無法滿足精子的總量要求；安瓿瓶冷凍精液的方法，存在製作工藝繁雜、成本較高、安瓿瓶易破裂等問題。專利號為200410013364.X的文件公開了一種常溫下的豬精液的保存液，該保存液原料為葡萄糖、牛血清白蛋白、氯化鉀、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸、碳酸氫鈉、抗生素和水等成分。該發明在一定程度上可以高優秀種公豬的精液利用率，但精液的保存時間較短，一般只有7天左右，不能長期保存。
發明內容本發明要解決的技術問題提供一種豬袋裝冷凍精液保存液和精液的保存方法，該方法能有效地保持精子的活力、使用簡單、方便，成本低廉，可滿足豬冷凍精液人工授精的需要。本發明的技術方案是豬袋裝冷凍精液保存液，所述保存液由A液和B液組成，A液配製稱取葡萄糖110克、乳糖110克、穀氨酸鈉18克、聚乙烯吡咯烷酮18克，依次加入100毫升蒸餾水中，使其完全溶解，再加入抗生素1020萬國際單位，用細菌過濾器過濾，然後加入維生素Bu0.020.1克、安鈉咖0.020.1克、卵黃1030毫升，充分混勻後得到A液；B液配製取A液50100毫升，加入甘油210毫升、N-N-二甲基甲醯胺210毫升，充分混勻後得到B液。所述A液成分為葡萄糖13克、乳糖13克、穀氨酸鈉12克、聚乙烯吡咯烷酮12克，抗生素1015萬國際單位、維生素B,20.020.04克、安鈉咖0.020.04克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液7595毫升、甘油26毫升、N-N-二甲基甲醯胺26毫升。所述A液成分為葡萄糖37克、乳糖13克、穀氨酸鈉26克、聚乙烯吡咯垸酮25克、抗生素1520萬國際單位、維生素B^0.040.08克、安鈉咖0.040.08克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液70100毫升、甘油48毫升、N-N-二甲基甲醯胺48毫升。所述抗生素為硫酸慶大黴素、青黴素或鏈黴素。所述A液和B液的pH值為6.57.5、滲透壓為300500mmol/L。一種豬袋裝冷凍精液保存液保存精液的方法，該方法包括以下步驟(1)採精和濃縮對公豬進行精液採集、精液離心分離，收集下層液體，控制精子密度在10億/ml以上，保存、備用；(2)降溫按A液和濃縮精液的比為l:0.52的比例，在18~35°〇下將精液等溫稀釋，然後冷藏，經12小時降溫至14'C;(3)平衡將冷藏精液用B液進行第二次稀釋，B液和冷藏精液的配比1:0.52，稀釋後精液在14'C下保存12小時；(4)分裝將精液分裝成袋；(5)冷凍將袋裝精液在液氮中保存。所述精液分裝成袋是將精液用無菌袋按每袋5ml精液分裝。所述在液氮中保存是將袋裝精液先在距離液氮面25cm處燻蒸510分鐘，然後投入液氮中冷凍保存。本發明的積極有益效果(1)本發明的豬袋裝冷凍精液保存液配方中，葡萄糖和乳糖主要為精子提供營養和能量，並具有保護精子、抗低溫的作用；穀氨酸鈉主要為精液提供緩衝作用；卵黃和聚乙烯吡咯烷酮主要由抗低溫保存精子的作用；維生素Bu和安鈉咖有減少精子畸形率，提高精子活力的功能；抗生素如硫酸慶大黴素主要是殺菌、抑制細菌生長的作用，各成分採用合適的比例混合後，可產生較好的協同作用，有利於豬精液的保存。(2)本發明的方法採用5ml無菌塑膠袋對豬精液進行分裝、冷凍、解凍和輸精等操作，具有每袋豬精液可滿足l頭母豬輸精需要的特點，整個操作簡單、方便，避免了二次汙染，成本低廉，可滿足豬冷凍精液人工授精的需要。(3)運用本發明方法保存的豬袋裝冷凍精液表明，該方法保存的精液可以正常用於豬的人工授精，並且豬的妊娠率、平均窩產仔數均和常溫保存的豬精液人工授精效果相當，可以正常使用。(4)本發明方法保存的豬袋裝冷凍精液可以在液氮中長期保存，可以顯著提高優秀種公豬的精液利用率，降低生產成本，能獲得更大的遺傳進展，有利於豬人工授精體系的完善。具體實施例方式實施例一(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配製A液配製稱取葡萄糖10克、乳糖1克、穀氨酸鈉8克、聚乙烯吡咯垸酮8克，溶於100毫升蒸餾水中，再依次加入使其完全溶解，再加入硫酸慶大黴素IO萬國際單位，用細菌過濾器過濾，然後加入維生素B^0.02克、安鈉咖0.02克、卵黃10毫升，充分混勻後為A液。B液配製取A液50毫升，加入甘油2毫升、N-N-二甲基甲醯胺2毫升，充分混勻後得到B液。要求上述所用試劑均為分析純，A液和B液的pH值均為6.57.5、滲透壓為300500mmol/L，對酸、鹼均具有一定的緩衝能力。(二)利用上述冷凍精液保存液的保存豬精液的方法，包括以下步驟1.採精和精液濃縮採用手握法對8頭公豬進行採精，將採集的精液用離心機800轉/分離心10分鐘，分層後收集下層的精子部分，精子密度控制在10億個/ml以上。對精液進行品質檢査，確保精子活力在0.6以上，畸形率在20%以內，保存、備用；2.降溫將濃縮的精液，按A液和濃縮精液為1:0.5的比例在20。C下等溫稀釋，可將A液緩慢加入到精液中，然後在冰箱冷藏室經12小時降溫至12°C。3.平衡將降溫至14。C的精液，按B液和濃縮精液為1:0.5的比例在l2'C下進行第二次稀釋，可將B液緩慢加入到精液中，在12"C存放12小時。4.分裝將平衡好的精液用無菌塑膠袋按每袋5ml分裝，即按每頭豬5ml的用量分裝好。5.冷凍將分裝好的精液先在距離液氮面2cm處進行燻蒸5分鐘，然後直接投入到液氮中冷凍，使其與液氮溫度保持一致(即一196°C)，然後一直在液氮中保存。6.解凍和解凍後精液品質檢査使用前將冷凍的精液投入到384(TC溫水中，解凍1020秒鐘；然後進行精液品質檢査，精子活力在0.4以上、畸形率20%以下、頂體完整率在60%以上為合格。實施例二(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配製，同實施例一不同之處在於A液成分葡萄糖1克、乳糖1克、穀氨酸鈉1克、聚乙烯吡咯烷酮1克，蒸餾水100毫升，硫酸慶大黴素20萬國際單位，維生素B120.02克、安鈉咖0.02克、卵黃10毫升。B液成分A液60毫升、甘油2毫升、N-N-二甲基甲醯胺2毫升。(二)利用上述的冷凍精液保存液的保存豬精液的方法，包括以下步驟-1.採精和精液的濃縮同實施例一。2.降溫按A液和濃縮精液為1:1的比例在25'C等溫稀釋，然後在冰箱經1小時降溫至4'C。3.平衡將降溫至4t:的精液，按B液和精液1:1的比例在4r下第二次稀釋，然後在4'C下存放1小時。其他分裝、冷凍、解凍和解凍後精液的品質檢查同實施例一。實施例三(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖3克、乳糖10克、穀氨酸鈉5克、聚乙烯吡咯烷酮3克，蒸餾水100毫升，硫酸慶大黴素15萬國際單位，維生素B120.03克、安鈉咖0.04克、卵黃30毫升。B液成分A液75毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲醯胺4毫升。(二)利用豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，包括以下步驟1.採精和精液的濃縮同實施例一。2.降溫按A液和濃縮精液l丄5的比例在20'C等溫稀釋，然後在冰箱經2小時降溫至rc。3.平衡將降溫至rC的精液，按B液和濃縮精液1:1.5的比例在rc下進行第二次稀釋，然後在rc存放2小時。其他分裝、冷凍、解凍和解凍後精液的品質檢査同實施例一。實施例四(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於-A液成分葡萄糖1.5克、乳糖2克、穀氨酸鈉1.5克、聚乙烯吡咯烷酮l克，蒸餾水100毫升、青黴素15萬國際單位、維生素8120.03克、安鈉咖0.04克、卵黃15毫升。B液成分A液80毫升、甘油3毫升、N-N-二甲基甲醯胺3毫升。(二)利用豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，包括以下步驟1.採精和精液的濃縮同實施例一。2.降溫按A液和濃縮精液l丄8的比例在常溫下20'C等溫稀釋，然後在冰箱冷藏室經1.5小時降溫至2°C。3.平衡將降溫至2。C的精液，按B液和濃縮精液1丄8的比例在2'C下第二次稀釋，然後在2'C存放1.5小時。其他分裝、冷凍、解凍和解凍後精液的品質檢査同實施例一。實施例五豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖5克、乳糖7克、穀氨酸鈉4克、聚乙烯吡咯烷酮5克、蒸餾水100毫升、連黴素20萬國際單位、維生素Bu0.06克、安鈉咖0.03克、卵黃16毫升。B液成分A液60毫升、甘油8毫升、N-N-二甲基甲醯胺7毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例六豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖7克、乳糖3克、穀氨酸鈉2克、聚乙烯吡咯烷酮4克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大黴素10萬國際單位，維生素B120.04克、安鈉咖0.03克、卵黃10毫升。B液成分A液90毫升、甘油4毫升、N-N-二甲基甲醯胺9毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例七豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖3克、乳糖2克、穀氨酸鈉4克、聚乙烯吡咯烷酮5克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大黴素15萬國際單位、維生素B120.03克、安鈉咖0.07克、卵黃15毫升。B液成分A液65毫升、甘油8毫升、N-N-二甲基甲醯胺8毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例八豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於-A液成分葡萄糖4克、乳糖2克、穀氨酸鈉3克、聚乙烯吡咯烷酮4克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大黴素20萬國際單位、維生素B120.08克、安鈉咖0.07克、卵黃18毫升。B液成分A液95毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲醯胺5毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例九豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖6克、乳糖2克、穀氨酸鈉5克、聚乙烯吡咯垸酮3克、100毫升蒸餾水、硫酸慶大黴素15萬國際單位、維生素BI20.07克、安鈉咖0.06克、卵黃20毫升。B液成分A液80毫升、甘油7毫升、N-N-二甲基甲醯胺4毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例十豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液配製葡萄糖5克、乳糖1克、穀氨酸鈉6克、聚乙烯吡咯烷酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大黴素12萬國際單位、維生素B120.06克、安鈉咖0.04克、卵黃13毫升。B液成分A液70毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲醯胺3毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例十一豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖1克、乳糖1.5克、穀氨酸鈉2克、聚乙烯吡咯烷酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大黴素10萬國際單位、維生素B120.02克、安鈉咖0.03克、卵黃15毫升。B液成分A液80毫升、甘油3毫升、N-N-二甲基甲醯胺4毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例十二豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖2.5克、乳糖1克、穀氨酸鈉1.5克、聚乙烯吡咯垸酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大黴素20萬國際單位、維生素B^0.06克、安鈉咖0.04克、卵黃13毫升。B液成分A液80毫升、甘油4毫升、N-N-二甲基甲醯胺3毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例十三豬袋裝冷凍精液保存液的配製同實施例一，不同之處在於A液成分葡萄糖3克、乳糖2克、穀氨酸鈉6克、聚乙烯吡咯烷酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大黴素10萬國際單位、維生素B120.06克、安鈉咖0.04克、卵黃13毫升。B液成分A液70毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲醯胺4毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實施例一，不再重述。實施例十四在同一豬場、採用相同種豬運用本發明的豬袋裝冷凍精液的人工授精和常溫保存的豬精液人工授精的比較(一)本發明的豬袋裝冷凍精液的人工授精的運用1.發情母豬的鑑定當按壓其背部或人騎在母豬背上時，母豬站立不動，同時表現為耳豎起，背弓起，尾豎起，顫抖，對外陰和側腹部的剌激敏感，視為發情，作輸精準備。2.輸精前精液的處理取本發明方法已冷凍存放一年的豬袋裝冷凍精液一袋即5ml，解凍，可直接投入到3840'C溫水中，解凍1020秒鐘；然後進行精液品質檢查，要求精子活力均在0.4以上、畸形率20%以內、頂體完整率在60%以上，合格精子用豬精液常溫保存液(如EDTA、GuelPh、BTS、Zorpva、Reading等)按1:10的比例在一次性豬人工授精輸精瓶中稀釋。3.輸精採用豬一次性無消毒輸精器對發情母豬進行輸精，發情後612小時內作第一次輸精，間隔12小時第二次輸精。4.結果共輸精25歲繁殖母豬26頭。其中23頭繁殖母豬分娩，1頭流產，2頭未妊娠，出現返情。妊娠率為88.4%，23頭繁殖母豬分娩，平均窩產仔數為9.3頭。(二)採用常溫保存的豬精液的人工授精1.發情母豬的鑑定，同上；2.輸精前精液的處理採集豬新鮮精液，對精液進行品質檢査，用豬精液常溫保存液(如EDTA、GuelPh、BTS、Zorpva、Reading等)按50億/60ml/份分裝好，在常溫(17~18°C)下保存，4天內(活力不能低於0.6)可用於輸精。3.輸精將分裝好的豬精液，採用豬一次性無消毒輸精器對發情母豬進行輸精。發情後612小時內作第一次輸精，間隔12小時第二次輸精。4.結果共輸精25歲繁殖母豬143頭。其中132頭繁殖母豬分娩，3頭流產，8頭未妊娠，出現返情。妊娠率為92.3%，平均窩產仔數為9.5頭。列表對比tableseeoriginaldocumentpage13通過上述比較可以看出，採用常溫保存的豬精液人工授精和本發明豬袋裝冷凍精液人工授精在妊娠率、平均窩產仔數等方面接近。權利要求1.豬袋裝冷凍精液保存液，其特徵是所述保存液由A液和B液組成，A液配製稱取葡萄糖1～10克、乳糖1～10克、穀氨酸鈉1～8克、聚乙烯吡咯烷酮1～8克，依次加入100毫升蒸餾水中，使其完全溶解，再加入抗生素10～20萬國際單位，用細菌過濾器過濾，然後加入維生素B120.02～0.1克、安鈉咖0.02～0.1克、卵黃10～30毫升，充分混勻後得到A液；B液配製取A液50～100毫升，加入甘油2～10毫升、N-N-二甲基甲醯胺2～10毫升，充分混勻後得到B液。2.根據權利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特徵是所述A液成分為葡萄糖13克、乳糖13克、穀氨酸鈉12克、聚乙烯吡咯垸酮12克，抗生素10~15萬國際單位、維生素B120.020.04克、安鈉咖0.020.04克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液7595毫升、甘油26亳升、N-N-二甲基甲醯胺26毫升。3.根據權利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特徵是所述A液成分為葡萄糖37克、乳糖13克、穀氨酸鈉26克、聚乙烯吡咯烷酮25克、抗生素15-20萬國際單位、維生素B120.040.08克、安鈉咖0.040.08克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液70100毫升、甘油48毫升、N-N-二甲基甲醯胺48毫升。4.根據權利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特徵是所述抗生素為硫酸慶大黴素、青黴素或鏈黴素。5.根據權利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特徵是所述A液和B液的pH值為6.57.5、滲透壓為30050Ommol/L。6.—種用權利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液保存精液的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)採精和濃縮對公豬進行精液採集、精液離心分離，收集分離的下層液體，控制精子密度在10億/ml以上，保存、備用；(2)降溫按A液和濃縮精液的比為l:0.52的比例，在1835。C下將精液等溫稀釋，然後冷藏，經12小時降溫至14'C;(3)平衡將冷藏精液用B液進行第二次稀釋，B液和冷藏精液的配比1:0.52，稀釋後精液在14t:下保存12小時；(4)分裝將精液分裝成袋；(5)冷凍將袋裝精液在液氮中保存。7.根據權利要求6所述的保存精液的方法，其特徵是所述精液分裝成袋是將精液用無菌袋按每袋5ml精液分裝。8.根據權利要求6所述的保存精液的方法，其特徵是所述在液氮中保存是將袋裝精液先在距離液氮面25cm處燻蒸510分鐘，然後投入液氮中冷凍保存。全文摘要本發明公開了一種豬袋裝冷凍精液保存液及其保存方法，保存液由A液和B液組成，A液中葡萄糖1～10克、乳糖1～10克、穀氨酸鈉1～8克、聚乙烯吡咯烷酮1～8克、蒸餾水100毫升、抗生素10～20萬國際單位、維生素B120.02～0.1克、安鈉咖0.02～0.1克、卵黃10～30毫升；B液為A液50～100毫升、甘油2～10毫升、N-N-二甲基甲醯胺2～10毫升。用此保存液保存精液的方法包括，包括採精後將精液濃縮，按A液和濃縮精液按比例等溫稀釋、冷藏；再用B液進行第二次稀釋，將精液分裝成袋；然後在液氮中保存。該方法能有效地保持精子的活力、使用簡單、方便，成本低廉，可滿足豬冷凍精液人工授精的需要。文檔編號C12N5/06GK101418282SQ200810231378公開日2009年4月29日申請日期2008年12月15日優先權日2008年12月15日發明者孟令坤,尹慧茹,張松濤,張長興,凱權,陳理盾,高家登,魏紅芳,黃炎坤申請人:鄭州牧業工程高等專科學校